李榮 林曉瑩 吳曉昀 黃呈 毛邱嫻 魏佳雪*

(1.廣東省第二人民醫(yī)院 產(chǎn)前診斷中心，廣東 廣州 510317；2. 廣東省第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣東 廣州 510317)

Treacher Collins綜合征(Treacher Collins syndrome，TCS；OMIM#154500)又稱之為下頜面骨發(fā)育不全(mandibulo facial dysostosis，MFD)，主要是顱面發(fā)育障礙[1,2]。這些特征包括顴骨發(fā)育不全、下瞼裂、耳廓畸形、下頜骨發(fā)育不全、巨裂、具有特殊的“魚(yú)樣面”面容，發(fā)病率比較低，為1/50 000左右[3]，該病約40%有家族史，而有60%的為散發(fā)病例[4]。TCS具有遺傳異質(zhì),OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)將該病分為1～4型，大多數(shù)TCS患者(占78%～93%)是由TCOF1基因突變引起的TCS-1(OMIM#154500)，與常染色體顯性遺傳性單倍體功能不全相關(guān)。由POLR1D基因突變引起的TCS-2(OMIM 613717)既可以是常染色體顯性遺傳，也可以是隱性遺傳。由POLR1C基因突變引起的TCS被歸類為T(mén)CS-3(OMIM#248390)，該類型為常染色體隱性遺傳[5-7]。而在最近的一項(xiàng)研究中，POLR1B被發(fā)現(xiàn)是一種新的致病基因，與一種新型的TCS-4(OMIM#618939)有關(guān)[8]。TCOF1基因所編碼的核仁磷酸化蛋白Treacle在TCS發(fā)生中發(fā)揮著不可或缺的作用。Treacle蛋白致病機(jī)制主要在于，TCOF1基因突變使其截短，從而引起蛋白功能喪失。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Treacle表達(dá)將抑制核糖體DNA基因轉(zhuǎn)錄，在神經(jīng)嵴融合時(shí)不能產(chǎn)生足夠的核糖體RNA，從而引發(fā)的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)嵴細(xì)胞增殖降低是畸形發(fā)生的直接原因[9,10]。本文對(duì)1例產(chǎn)前超聲提示小下頜合并外耳異常胎兒實(shí)行產(chǎn)前基因檢測(cè)，以明確其致病機(jī)理。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 孕婦，29歲，孕13周首診。G1P0，平素月經(jīng)規(guī)律，自然受孕。否認(rèn)不良接觸及近親結(jié)婚和家族遺傳病史。孕13周超聲檢查顯示: 胎兒如孕13周，頸項(xiàng)透明層厚度 (nuchal translucecy，NT)1.8mm，胎兒顏面部正中矢狀切面顯示異常，小下頜畸形待排，如圖1A。孕18周Ⅲ級(jí)產(chǎn)前超聲檢查顯示：胎兒顏面部正中矢狀切面顯示下唇及頦形成的曲線失常，頦稍后，下唇后移，下唇較上唇位置稍后，面下部角(inferior facial angle,IFA)41°，雙側(cè)外耳形態(tài)異常，位置可疑偏低，考慮小下頜畸形，如圖1B、C。

圖1 病例超聲圖像

1.2 方法

1.2.1 多重定量熒光PCR(quantitative fluorescence PCR，QF-PCR)快速診斷 采用Devyser 13、18、21-三體和性染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒，通過(guò)熒光PCR毛細(xì)管電泳法進(jìn)行分析。在提取羊水細(xì)胞基因組DNA并純化后，采用試劑盒對(duì)DNA模板進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，取擴(kuò)增產(chǎn)物1μl加入甲酰胺9μl與內(nèi)標(biāo)GeneScan Rox-500 Size standard(ABI)0.2μl，將待測(cè)96孔板放入ABI3500遺傳分析儀上進(jìn)行片段分析，Genemapper 4.1系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。

1.2.2 染色體G顯帶核型分析 羊水細(xì)胞培養(yǎng)7d后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，2d后視細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行收獲以及染色體制備，在顯微鏡下計(jì)數(shù)20個(gè)核型，分析5個(gè)核型。染色體核型描述按照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名國(guó)際體系(ISCN2016)。

1.2.3 染色體微陣列分析(chromosome microarray analysis，CMA) 采用QIAamp DNA Blood Mini Kid(德國(guó)QIAGEN公司)提取基因組DNA并測(cè)定其濃度和純度，再通過(guò)限制性內(nèi)切酶消化、加接頭、PCR擴(kuò)增、片段化、生物素標(biāo)記來(lái)構(gòu)建芯片文庫(kù)。利用美國(guó)Affymetrix公司的CytoScanTM 750K芯片與生物素標(biāo)記好的基因組DNA進(jìn)行雜交檢測(cè)羊水細(xì)胞全基因組不平衡現(xiàn)象，結(jié)果采用Chromosome Analysis Suits(ChAs)軟件進(jìn)行分析。

1.2.4 全外顯子測(cè)序(whole exon sequencing，WES)

1.2.4.1 文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 使用安捷倫(Agilent)的SureSelectHuman All Exon 50Mb平臺(tái)制備檢測(cè)樣本，包括DNA片段化、末端修復(fù)、加接頭、PCR擴(kuò)增、探針雜交、磁珠捕獲富集等步驟。構(gòu)建文庫(kù)使用安捷倫(Agilent)2200分析儀質(zhì)控分析合格后采用illumina 550完成高通量測(cè)序。

1.2.4.2 生物信息學(xué)分析 利用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析；利用BWA軟件(v0.7.15-r1140)將所有過(guò)濾后的測(cè)序序列(reads)比對(duì)到參考基因組(GRCh37/hg19);利用Picard軟件工具去除重復(fù)reads；利用GATK軟件工具包(v3.7-0)完成單堿基變異和插入缺失變異的檢出；利用Annovar及VEP等軟件包進(jìn)行注釋。

1.2.4.3 致病性變異過(guò)濾與篩選 結(jié)合人群dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)(SNP150)、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)等信息，去除最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)>0.01 (常染色體顯性遺傳病)或MAF>0.05(常染色體隱性遺傳病)的高頻變異。參考2020年廣東省精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)應(yīng)用學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布的《產(chǎn)前外顯子測(cè)序遺傳咨詢和報(bào)告規(guī)范》，結(jié)合結(jié)合疾病基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)(Clinvar、HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù))信息、文獻(xiàn)報(bào)道、功能試驗(yàn)、遺傳模式、基因型-表型關(guān)聯(lián)分析等綜合判斷，按照《ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南》將變異分成致病、可能致病、意義不明確、可能良性、良性5類；并篩選出與先證者表型相關(guān)的可疑致病性變異進(jìn)行sanger測(cè)序驗(yàn)證等進(jìn)一步分析。

1.2.4.4 sanger測(cè)序驗(yàn)證及家系共分離分析 通過(guò)以上方法篩選出的可疑致病基因變異，利用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序驗(yàn)證。利用chromas軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析。胎兒及父母家系DNA樣本測(cè)序結(jié)果進(jìn)行家系共分離分析。

2 結(jié)果

2.1 QF-PCR結(jié)果分析 未見(jiàn)21號(hào)、18號(hào)、13號(hào)及性染色體數(shù)目異常，STR位點(diǎn)分析提示未見(jiàn)母體DNA污染。

2.2 染色體G顯帶核型分析及CMA分析結(jié)果 胎兒羊水染色體分析結(jié)果為46,XN，未發(fā)現(xiàn)核型異常。經(jīng)CytoScanTM 750K芯片掃描及數(shù)據(jù)分析結(jié)果為[hg19](1-22)×2,(XN)×1，未發(fā)現(xiàn)致病性拷貝數(shù)變異、雜合性缺失及單親二倍體。

2.3 全外顯子測(cè)序結(jié)果分析 一家三口全外顯子測(cè)序(trio-whole exome sequencing，Trio-WES)檢出胎兒攜帶TCOF1 基因NM_001135243.1: exon8: c.928_931del:p.T310fs 雜合致病變異，對(duì)于該個(gè)體親本樣本中該區(qū)域的全外顯子測(cè)序分析未檢測(cè)到該變異，該變異在胎兒中為新發(fā)變異。本例胎兒TCOF1基因第8外顯子c.928-931del(p.T310fs)缺失突變尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，胎兒、母親及父親Sanger驗(yàn)證測(cè)序圖見(jiàn)圖2。

圖2 TCOF1基因變異Sanger測(cè)序驗(yàn)證圖

2.4 胎兒妊娠結(jié)局隨訪 產(chǎn)前遺傳咨詢后，孕婦選擇終止妊娠，胎兒引產(chǎn)見(jiàn)圖3。可見(jiàn)典型的小下頜、外耳畸形等Treacher Collins綜合征癥狀。

圖3 胎兒引產(chǎn)后表型

3 討論

TCS是一種以常染色體顯性遺傳為主的先天性臉頰骨及下頷骨發(fā)育不全疾病。TCOF1基因作為T(mén)CS主要致病基因(78%～93%)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過(guò)300種突變，它們既可自發(fā)產(chǎn)生，也可由遺傳獲得，沒(méi)有明顯的性別差異。TCS畸形與其他顱面部疾病不同，除一些軟組織和骨骼外通常是雙側(cè)對(duì)稱發(fā)病，累及部位自上而下主要包括眼及眶周、耳、顴骨顴弓和上下頜骨等，大腦、腎臟和四肢畸形很少見(jiàn)。顴骨復(fù)合體(81%)和上下頜骨(78%)發(fā)育畸形是TCS最明顯的特征[11]。Vincent等[12]將TCS1患者的臨床特征與文獻(xiàn)報(bào)道的患者進(jìn)行了比較。在70例患者中，眼瞼裂向下傾斜(100%)、顴骨發(fā)育不良(99%)、傳導(dǎo)性耳聾(91%)、下頜發(fā)育不良(87%)、外耳道閉鎖(72%)、小耳(71%)、下瞼缺損(65%)、不對(duì)稱(53%)、頭發(fā)向側(cè)頰突出(48%)、腭裂(22%)、后鼻孔狹窄/閉鎖(14%)、心臟畸形(12%)。可見(jiàn)該疾病的外顯率比較高但表型差異很大，表型較輕者幾乎未顯現(xiàn)明顯的臨床特征，而表型較重者可因鼻后孔閉鎖、舌后墜等原因?qū)е峦庹系K而死亡[13]，這些因素給TCS患者，特別是產(chǎn)前胎兒的明確臨床診斷和遺傳咨詢帶來(lái)了困難。目前，產(chǎn)前TCS可以通過(guò)常規(guī)的二維超聲或更精細(xì)的三維掃描來(lái)檢測(cè)；但對(duì)于輕到中度的TCS，尤其是散發(fā)性TCS，很少有效[14]。因此，識(shí)別受累胎兒的致病基因?qū)?zhǔn)確預(yù)防TCS具有重要意義。本文胎兒在孕早期13周超聲檢查即出現(xiàn)了疑似小下頜待排，繼續(xù)超聲監(jiān)測(cè)在18周發(fā)現(xiàn)明顯小下頜畸形、外耳形態(tài)異常、耳低位等面部發(fā)育不良。通過(guò)全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)胎兒TCOF1 基因第8外顯子存在c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)雜合突變，依據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics，ACMG)遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[15]，致病變異標(biāo)準(zhǔn)可分為非常強(qiáng)(very strong，PVS1)、強(qiáng)(strong，PS1-4)、中等(moderate，PM1-6)、或輔助證據(jù)(supporting，PP1-5)。良性變異證據(jù)可分為獨(dú)立(stand-alone，BA1)、強(qiáng)(strong，BS1-4)、或輔助證據(jù)(BP1-6)。其中，數(shù)字只是作為有助于參考的分類標(biāo)注，不具有任何意義。每個(gè)類別中的數(shù)字不表示分類的任何差異，僅用來(lái)標(biāo)記以幫助指代不同的規(guī)則。本例胎兒TCOF1 基因c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)證據(jù)項(xiàng)為PVS1+PM2+PP4，判斷該變異為致病變異，證據(jù)為，PVS1：當(dāng)一個(gè)疾病的致病機(jī)制為喪失功能(loss of function, LoF)時(shí)，無(wú)功能變異(無(wú)義突變、移碼突變、經(jīng)典±1 或 2 的剪接突變、起始密碼子變異、單個(gè)或多個(gè)外顯子缺失)。PM2：ESP 數(shù)據(jù)庫(kù)、千人數(shù)據(jù)庫(kù)、EXAC 數(shù)據(jù)庫(kù)中正常對(duì)照人群中未發(fā)現(xiàn)的變異(或隱性遺傳病中極低頻位點(diǎn))；人群頻率：ESP6500：-，千人：-，EXAC：-，GnomAD：-。PP4：變異攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病。本文胎兒采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證結(jié)果與WES一致，該突變使得終止密碼子提前出現(xiàn)，可能會(huì)導(dǎo)致Treacle蛋白截短而喪失功能，這與單倍性不足的機(jī)制是一致的符合證據(jù)項(xiàng)PVS1；胎兒父母在該區(qū)域的全外顯子測(cè)序分析未檢測(cè)到該變異，該變異在胎兒中為新發(fā)變異，且該突變類型尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，符合證據(jù)項(xiàng)PM2；胎兒表型與TCS表型高度符合,判定為PP4證據(jù)項(xiàng)，綜合上述證據(jù)項(xiàng)診斷本例胎兒TCOF1 基因c.928-931del(ACCC)(p.T310fs)變異是導(dǎo)致TCS的致病性變異。該TCS患兒的產(chǎn)前診斷為該家系的遺傳咨詢提供了重要信息。

目前為止，根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(The Human Gene Mutation Database，HGMD)的數(shù)據(jù)，在TCS患者中已經(jīng)報(bào)道了300多種不同的TCOF1基因突變。目前已發(fā)現(xiàn)的突變種類包括框移突變、剪切突變、無(wú)義突變和缺失突變等，多數(shù)突變都引入了一個(gè)終止密碼子的過(guò)早插入。最常見(jiàn)的TCOF1基因變異是小缺失(60%)和重復(fù)(25%)導(dǎo)致的移碼突變[16]。國(guó)外報(bào)道認(rèn)為T(mén)COF1基因的5個(gè)外顯子(10、15、16、23和24)是TCOF1基因突變的熱點(diǎn)區(qū)域(50%)[17]，但其他外顯子的致病變異均有報(bào)道。目前產(chǎn)前基因診斷TCS的報(bào)道極少，中國(guó)人產(chǎn)前TCS基因診斷目前僅報(bào)道1例胎兒為新的TCOF1基因第2～6外顯子的大缺失，來(lái)源于胎兒父親，胎兒父親表現(xiàn)出明顯的斜眼瞼裂隙、眼瞼缺損、顴弓發(fā)育不良，屬于家系遺傳[18]。而本文胎兒父母表型均無(wú)異常，僅依靠超聲圖像不能做出診斷，需要通過(guò)WES分析從分子水平明確胎兒的致病機(jī)制。

目前治療TCS的首選方法仍是以改善患者外貌、提高患者生存質(zhì)量的外科手術(shù)方法為主。但多學(xué)科的共同參與、有序的治療時(shí)間安排和完善的術(shù)前設(shè)計(jì)才是手術(shù)成功的保障。除手術(shù)治療外，p53基因治療和抗氧化劑治療也逐漸成為研究熱點(diǎn)，具體應(yīng)用于臨床還需要更為完善的研究支持[19]。相較于手術(shù)治療給社會(huì)和家庭帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)以及在此期間疾病給患者造成的巨大心理傷害，TCS產(chǎn)前預(yù)防和篩查非常重要。在本文病例中，與其他具有不同突變的患者相比，我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)特殊的表型。僅靠超聲篩查對(duì)TCS胎兒做出明確診斷仍具有挑戰(zhàn)性。分子診斷在TCS患者產(chǎn)前和產(chǎn)后階段發(fā)揮著重要作用，對(duì)遺傳咨詢的發(fā)展有著不可否認(rèn)的影響。本文結(jié)合三維超聲和全外顯子組測(cè)序，成功地檢測(cè)了TCS胎兒。在該家系中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TCOF1基因第8外顯子c.928-931del(ACCC)缺失突變，擴(kuò)大了HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)TCOF1基因的突變譜。本研究還表明，面對(duì)類似的產(chǎn)前顱面畸形病例，分子遺傳學(xué)檢測(cè)有助于明確診斷，指導(dǎo)產(chǎn)前診斷后續(xù)的遺傳咨詢。