胡聽聽 胡蓉 張艷霞 袁騰龍 盧健 王繼成

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學遺傳中心，廣東 廣州 511400)

短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)為基因組中由核心序列2～7bp重數(shù)次到數(shù)十次的高度串聯(lián)重復序列，由于其具有在不同人群不同個體間具有高度多態(tài)且高雜合度，并且其檢測快捷簡便，使其在臨床遺傳性疾病檢測和法醫(yī)學等方面具有廣泛的應用[1, 2]。 性染色體嵌合為產(chǎn)前診斷中常見的一種染色體異常，在患者中典型表現(xiàn)為身體、心理、行為、學習能力、神經(jīng)認知等方面的異常，生育能力低下或者不育。但是一般情況，大多數(shù)的性染色體非整倍體患者具有正常人的生活能力、壽命以及智力[3]。在產(chǎn)前診斷中，STR檢測技術已經(jīng)廣泛應用于13、18、21和XY性染色體非整倍體的檢測，但對于性染色體嵌合的檢測報道不多。常規(guī)的染色體核型分析檢測技術為胎兒性染色體嵌合檢測的金標準，但該方法費時費力，給產(chǎn)前遺傳咨詢帶來難度[4]。本文回顧性分析1164例胎兒染色體檢測病例，探討STR在胎兒性染色體嵌合體檢測中的作用，并報道分析如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2018年1月至2020年5月在廣東省婦幼保健院(本院)進行產(chǎn)前診斷，篩選出性染色體異常的病例共計1164例，其中性染色體嵌合的病例有34例，年齡為18～47歲，平均年齡為28.09歲，孕周為13～30周，平均孕周為21.3。其中羊水25例(73.5%)，臍血5例(14.7%)，絨毛4例(11.8%)。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準通過，并且所有研究對象都簽署了知情同意書(廣東省婦幼保健院醫(yī)倫第[202101243]號)。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣品采集 在充分告知患者本實驗情況下，進行簽訂知情同意書，對于羊水穿刺須在超聲引導下進行羊水穿刺，穿刺過程中應盡量避開胎盤和隔膜，初始的2ml羊水丟棄后再抽取20ml羊水；對于絨毛穿刺須在超聲引導下選擇合適的穿刺點和角度進行，將引導套針穿刺入胎盤絨毛邊緣，并使用活檢針抽取絨毛組織5～10支；對于臍血穿刺應盡量避開胎盤和隔膜抽取胎兒2～4ml臍血。

1.2.2 STR檢測 使用德國Macherey-Nagel公司的NucleoSpin Blood提取試劑盒進行羊水、絨毛、臍血DNA提取。定量熒光聚合酶鏈反應(quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF-PCR)擴增位點選擇XY染色體上的8個STR位點，分別為AMEL、DXS1187、DX981、DXS7423、SRY、DYS448、DXYS267、DXYS218、TAF9。擴增體系為12.5μl Takara-Premix，7.5μl引物混合液，3～5μlDNA模板(約60ngDNA)。PCR反應為：95℃ 5min變性，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min循環(huán)30次，72℃ 10min后保存。PCR產(chǎn)物使用3500XL毛細管電泳儀檢測，結果使用GeneMarkerV2分析。

1.2.3 染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA) 該實驗DNA提取試劑盒為德國QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit提取試劑盒，芯片平臺為美國Affymatrix的cyto750K芯片檢測平臺，實驗數(shù)據(jù)分析結合公共數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合分析。

1.2.4 STR檢測結果性染色體嵌合判斷標準 使用GeneScan3.7軟件進行結果分析，根據(jù)顯示的峰圖進行結果判斷。判斷標準(臨床生化協(xié)會/臨床分子遺傳協(xié)會規(guī)定)如下：若STR等位基因出現(xiàn)3個峰，且峰值面積(area rate，AR)接近1∶1∶1，可判斷為三體；若顯示2個峰，則計算峰圖面積，面積比值>1.8或者<0.65則判斷為三體，雙峰面積比值為0.8～1.4則判斷為正常；介于兩個區(qū)間之間的值則需重新檢測，若重新檢測依然介于兩區(qū)之間則懷疑為嵌合，需進一步進行檢測。若X染色體STR位點檢測圖譜鈞呈現(xiàn)單峰，則判斷為45，X。

2 結果

2.1 34例樣本中絨毛4例，臍血5例，羊水25例，最小孕周13+，最大孕周35+。34例樣本中，產(chǎn)前超聲異常的有10例(29.41%)，唐氏篩查高風險或臨界風險的有6例(17.65%)，無創(chuàng)性染色體數(shù)目異常的有12例(35.29%)，高齡的8例(23.4%)，復發(fā)性流產(chǎn)的2例(5.88%)，不良孕產(chǎn)史2例(5.88%)。(詳細結果見附表1)。

2.2 34例STR性染色體嵌合體結果與CMA結果比對后，均為嵌合的為25例(73.53%)，性染色體異常的樣本有7例(20.59%)，CMA正常而STR異常的樣本有2例(5.88%)。25例嵌合體樣本中，檢測結果為45,X/46,XXY有10例(29.41%)，45,X/46,XY有6例(17.65%)，46,XX/47,XXX有3例(8.82%)，46,XY/47,XYY有2例(5.88%)，1例45,X/46,XX/47,XXX(2.94%)，1例Y染色體嵌合缺失(2.94%)，2例X染色體嵌合缺失合并重復(5.88%)。STR檢測嵌合體中，CMA檢測為性染色體異常的有7例，分別為47,XXY有4例(11.76%)，1例45,X(2.94%)，1例47,XXXY(2.94%)，1例Y染色體異常(2.94%)。CMA檢測為陰性而STR檢測提示為嵌合的有2例，檢測結果分別為XY和XX。詳細結果見表1。

表1 35例樣本STR和CMA檢測結果

續(xù)表

3 討論

產(chǎn)前診斷中具有嚴重表型的主要染色體疾病為13、18、21-三體綜合征，大約占89%[5]，隨著技術的發(fā)展，為了緩解孕婦的緊張情緒和擁有更多選擇時間，需要一種快速而準確的方法應用到產(chǎn)前診斷。QF-PCR(quantitative fluorescence polymerase，QF-PCR)的出現(xiàn)緩解了臨床需求，現(xiàn)今廣泛應用于臨床檢測13、18、21和性染色體非整倍體[6]。但是對于性染色體嵌合的診斷由于缺少準確、便捷的方法導致檢出率不高。

性染色體嵌合由于往往不影響患者生存，往往在臨床中被忽視，導致在人群中發(fā)生率較高，有研究發(fā)現(xiàn)X染色體嵌合在女性人群中發(fā)生率大概是常染色體的4倍(0～0.25%)[7]。本實驗中STR檢測技術和CMA檢測技術均為嵌合的有25例，陽性預測值PPV為73.53%(25/34)，Dorte等[8]的研究表明QF-PCR檢測非整倍體具有快速、可靠性高，但對于性染色體嵌合其陽性預測值為44%。Lildballe等[8]的研究研究與本研究的陽性預測值有差異，但該研究性染色體嵌合樣本只有9例，而本研究樣本更為豐富，具有更強的說服力。有2例STR檢測為嵌合而CMA檢測為正常，可能是STR位點的引物區(qū)的多態(tài)性而出現(xiàn)等位基因全部或部分丟失[9]。由于STR檢測技術只選取染色體特定部分STR位點，而無法檢測到性染色體其他部分缺失或重復[1]，CMA技術主要功能是檢測微缺失或微重復[10]。STR檢測技術在檢測染色體嵌合或其他異常中具有較高的可靠性，這可能與STR檢測技術通過設計染色體上多個不同的STR特異性位點而檢測染色體數(shù)目異常，又通過PCR擴增，更進一步擴大了染色體異常比例。同時STR檢測技術也存在諸多缺陷，比如無法檢測染色體平衡易位、無法檢測出少于30%母體污染的樣本等。

4 結論

綜上所述，性染色體嵌合的患者在精神、身體、行為、生育等方面會收到較大影響，并且隨著嵌合比例的增加，其癥狀會加重，給家庭帶來沉重負擔，而使用STR檢測技術能夠及時而準確的獲取檢測結果，可以給孕婦帶來寶貴的時間進行選擇，極大地緩解孕婦的精神壓力，對后續(xù)的產(chǎn)前檢查也可以做出重要指導。但STR技術的本身技術缺陷使其需要聯(lián)合其他方法(核型分析技術、CMA檢測技術等)綜合判斷，給孕婦提供更準確可靠的結果[11]。故STR檢測方法在產(chǎn)前診斷胎兒性染色體嵌合體中具有重要價值。