陸 奇，韓修遠，趙 亮，劉 爽，亓美玉，姚玉昌*

（1.黑龍江普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

精液質(zhì)量是影響動物繁殖效率的重要因素。哺乳動物精子在生殖道內(nèi)運行的過程中易受到細菌和病毒污染。由于大腸桿菌（）、肺炎克雷伯菌（）、奇異變形桿菌（）等革蘭氏陰性菌污染，會導致精子活力和受精能力下降，造成雌性受胎率降低，嚴重時雄性動物會喪失生育能力，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來嚴重損失。

精子活力是成功受精的基本保證。普遍認為精子中段的線粒體缺陷可能是精子活力受損的重要原因，進而影響精子頂體反應、獲能、與透明帶相互作用、精卵細胞融合等關(guān)鍵的能量依賴過程。有研究表明，精液中細菌污染主要通過增加精子中ROS 水平對線粒體功能造成損傷。適度低水平的ROS 是保證精子活力的要素，但異常高水平的ROS 將導致精子膜流動性發(fā)生不可逆的改變，造成精子活力下降，并持續(xù)破壞精子頂體反應和獲能，進一步造成精子DNA 片段化。因此，精液中細菌污染可能通過損傷線粒體功能來降低精子活力。

革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分脂多糖（Lipopoly saccharide，LPS），具有雄性生殖毒性，可誘發(fā)精子內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，損傷線粒體功能，進而降低精子活力。（）作為LPS 的主要模式識別受體，被LPS 激活后，可在多種細胞中誘發(fā)炎癥、凋亡、氧化應激等生物學反應。因此，本研究以LPS 作為模擬物處理綿羊精子，擬闡明精液中革蘭氏陰性菌污染對精子活力、線粒體結(jié)構(gòu)及功能的損傷，并揭示基因在此過程中的介導作用，為解析細菌侵染導致精子損傷的機制提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及樣品收集 選擇健康、體況良好、無繁殖疾病的2～3 歲德國肉用美利奴公羊8 只，其中過表達基因公羊和野生型公羊各4 只，飼養(yǎng)于東北農(nóng)業(yè)大學綿羊新品種培育基地，每日提供全價精飼料 0.7 kg，自由采食飼草和飲水。利用常規(guī)假陰道方法采集公羊精液，經(jīng)現(xiàn)場外觀初評后，立即送至實驗室檢測精子活力。

1.2 精子上浮 精液經(jīng)外觀評定及活力檢測合格后，立即使用37℃預熱的精子BWW 培養(yǎng)液（HLCM0052，上海哈靈生物科技有限公司）完成精子上浮操作。具體操作步驟如下：精液經(jīng)BWW 培養(yǎng)液等體積稀釋后，吸取200 μL 稀釋精液緩慢加于裝有2 mL 培養(yǎng)液離心管的底部，移入37℃、5% CO環(huán)境的培養(yǎng)箱中傾斜45°放置30 min，使用剪掉尖端的槍頭吸取適量的上浮精子懸液，用于活力及純度檢測。

1.3 上浮精子純度鑒定 為避免精液中白細胞、上皮細胞、睪丸組織細胞等體細胞污染對精子試驗產(chǎn)生影響，本研究采用CD4、E-Cadherin 和c-kit 基因作為細胞標志物檢測上浮后精子樣品。收集原精以及上浮精子樣品，3 000 r/min 離心10 min 后，利用QIAGEN RNeasy Mini Kit（7410474106，Qiagen）提取總RNA，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（04897030001，Roche）合成cDNA，具體操作步驟按照試劑盒說明書執(zhí)行，產(chǎn)物置于-20℃冰箱保存，用于精子純度檢測。精子純度鑒定所用的引物信息見表1，交由南京金唯智生物技術(shù)公司合成。

表1 PCR 引物序列

1.4 精子培養(yǎng) 將上浮純化后的精子調(diào)整濃度至2×10/mL，置于12 孔板中，37℃、5% CO條件下培養(yǎng)。設置對照組、LPS（1 μg/mL）處理組（L4391，Sigma）、TAK-242（3 μmol/L）處理組（Cli095，Invivogen）和TAK-242（3 μmol/L）+LPS（1 μg/mL）共處理組，其中共處理組利用TAK-242 提前預處理30 min。每組設置3 個重復孔，分別于處理后的2、4 h 和6 h 收集樣品用于后續(xù)分析。

1.5 精子活力檢測 將樣品放置于37℃溫控板上，利用SCA 全自動精子質(zhì)量分析儀(Sperm Class Analyzer)中的綿羊物種模塊檢測精子活力和質(zhì)量。以精子活力抑制率作為評價精子活力的指標，活力抑制率=0 h 時精子活力百分數(shù)值-各檢測時間點精子活力百分數(shù)值。

1.6 精子基因表達檢測 利用免疫熒光方法檢測精子外膜基因表達，操作過程如下：培養(yǎng)后的精子（1×10/mL）經(jīng)推片后，PBS 浸洗3 次，BSA（A1933，Sigma）封閉2 h；一抗（AF7107，Affinity）4℃孵育過夜，加入cy3 標記的二抗避光孵育1 h，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，而后在熒光顯微鏡（Χ71，Olympus）下察看采集圖像。

1.7 精子線粒體超微結(jié)構(gòu)檢測 將精子樣品利用2.5%戊二醛和1% 鋨酸固定，按照50% 乙醇8～10 min、70% 乙醇8～10 min、90% 乙醇8～10 min 和100% 乙醇8～10 min 的順序梯度脫水，樹脂包埋后切片，經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，利用透射電子顯微鏡（JEOL-1200EΧ，日本）觀察精子線粒體結(jié)構(gòu)并拍照。

1.8 精子線粒體膜電位檢測 利用JC-1 膜電位檢測試劑盒（65-0851-38，eBioScience）分析線粒體膜電位的變化，具體操作步驟如下：取1 mL 培養(yǎng)后的精子樣品（1×10/mL），以1000 r/min 低速離心5 min 后獲得樣品沉淀，加入200 μL JC-1（2.5 μg/mL）工作液，將樣品重懸后37℃孵育15 min，低速離心后的沉淀利用PBS 重懸，流式細胞儀上機檢測（FACS Calibur，美國BD 公司）。

1.9 精子ATP 水平檢測 利用ATP 合酶酶活性檢測試劑盒（ab109714，Abcam）分析精子中ATP 水平，具體操作步驟如下：利用蒸餾水將ATP 標準溶液稀釋為10～10mol/L 的梯度濃度，加入100 μL 細胞裂解液后，根據(jù)ATP 梯度熒光值繪制標準曲線；加入100 μL 細胞裂解液至待測精子樣品中（1×10/mL），將樣品熒光值帶入標準曲線得到ATP 水平檢測值。

1.10 統(tǒng)計分析 利用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）分析和Duncan 多重比較。*代表＜0.05，表示差異顯著；** 代表＜0.01，*** 代表＜0.001，表示差異極顯著。所有數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 上浮處理后提高了精子樣品的活力和純度 研究結(jié)果表明，精子經(jīng)上浮操作后精子活力提升（＜0.05），由初始活力78%，提升到90%（圖1）。

圖1 綿羊精子上浮前后活力

圖2 表明，精子經(jīng)上浮處理后，純度較高，無明顯的白細胞（作為標記基因）、上皮細胞（作為標記基因）以及睪丸組織細胞（c-kit 作為標記基因）的污染，可用于進一步研究。

圖2 上浮后精子中體細胞污染檢測

2.2 LPS 對精子活力的影響 圖3 表明，隨著培養(yǎng)時間延長精子活力逐漸下降。精子經(jīng)LPS（1 μg/mL）處理后，在6 h 時精子活力抑制率高于對照組（＜0.001），精子活力呈現(xiàn)較大幅度的下降。因此，本研究后續(xù)分析均選擇培養(yǎng)6 h 時的樣品。

圖3 LPS 處理后綿羊精子活力變化

2.3基因?qū)PS 誘發(fā)的精子活力下降的影響 免疫熒光染色結(jié)果表明，基因在綿羊精子外膜上表達；精子經(jīng)LPS（1 μg/mL）處理后基因表達上調(diào)（＜0.001），同時其表達位置發(fā)生變化，由主要表達在精子頭部向尾部擴展（圖4-A）。LPS 處理后6 h精子活力下降（＜0.001）（圖4-B、C），前向運動率和非前向運動率均降低（＜0.05），不運動精子率極顯著升高（＜0.001）（圖4-D）。但精子經(jīng)LPS 處理后，過表達基因?qū)ζ浠盍Α⑶跋蜻\動率、非前向運動率、不運動精子率均無顯著影響；利用TAK-242抑制TLR4 信號通路緩解了LPS 誘發(fā)的精子活力下降（＜0.001），但對前向運動率、非前向運動率、不運動精子率無顯著影響。

圖4 綿羊精子TLR4 基因的表達及其表達水平對LPS 處理后精子活力的影響

2.4 LPS 對精子線粒體結(jié)構(gòu)的影響 精子經(jīng)LPS（1 μg/mL）處理后，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，主要表現(xiàn)為線粒體排列不規(guī)則、膜間隙腫脹（Swollen，SW）和定向障礙（Disorientation，di），并產(chǎn)生大量液泡（Vacuole，Va）結(jié)構(gòu)（圖5）。

圖5 LPS 處理后精子線粒體結(jié)構(gòu)變化

2.5基因?qū)PS 誘發(fā)的線粒體膜電位和ATP 水平降低的影響 精子線粒體膜電位（JC-1）檢測結(jié)果表明（圖6-A），與對照組相比，精子經(jīng)LPS 處理6 h 后其膜電位水平降低（＜0.001），雖然過表達基因?qū)€粒體膜電位無顯著影響，但TAK-242 處理后對緩解線粒體膜電位水平降低具有明顯作用（＜0.05）。ATP 水平的檢測結(jié)果表明（圖6-B），與對照組相比，經(jīng)LPS 處理6 h 后，精子中ATP 水平降低（＜0.001），同樣地，過表達基因?qū)又蠥TP 水平無顯著影響，而TAK-242 處理緩解了ATP 水平的降低（＜0.001）。

圖6 LPS 刺激后精子線粒體膜電位和ATP 變化

3 討 論

細菌感染對動物和人類精子的發(fā)生過程造成不利影響，如金黃色葡萄球菌感染可引起少精子癥（Oligospermia）、弱精子癥（Asthenospermia）、畸形精子癥（Teratospermia）和無精子癥（Azoospermia）。大腸桿菌作為泌尿生殖系統(tǒng)感染的主要菌株可引起前列腺炎，造成睪丸損傷進而影響精子成熟；同時，細菌來源的LPS 也可破壞睪丸類固醇激素以及精子的發(fā)生，并誘導暫時性不育和睪丸功能障礙。細菌感染除損傷精子發(fā)生過程以外，也會導致成熟精子活力和受精能力下降，造成雌性受胎率降低，嚴重時雄性動物會喪失生育能力。在人類和豬上的相關(guān)研究也表明，LPS 顯著影響精子的活力和凋亡，造成其穿透粘性介質(zhì)的能力下降。本研究中，大腸桿菌來源的LPS 刺激綿羊精子后精子活力下降，前向運動率和非前向運動率均顯著降低，不運動精子率升高，導致精液質(zhì)量下降。

精子的活力與能量代謝密切相關(guān)。線粒體作為精子的主要供能單位，在ATP 和ROS 產(chǎn)生方面與其他細胞中的線粒體類似，還參與著精子獲能以及頂體反應。對人類精子的研究表明，由細菌侵染引起的精子線粒體缺陷是導致男性不育的主要原因，將精子與支原體、溶血鏈球菌以及大腸桿菌共孵育后，造成線粒體的活性受損、氧化還原能力降低。線粒體出現(xiàn)結(jié)構(gòu)損傷、ROS含量增加、膜電位降低均會造成線粒體功能障礙進而導致精子活力降低。本研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激綿羊成熟精子后，線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為線粒體排列不規(guī)則、膜間隙腫脹（SW）和定向障礙（di），并產(chǎn)生大量液泡（Va）結(jié)構(gòu)。有研究表明，線粒體結(jié)構(gòu)異常會引起細胞色素氧化酶（Cytochrome Oxidase，CCO）、琥珀酸脫氫酶（Succinodehydrogenase，SDH）和乳酸脫氫酶同工酶（Lactate Dehydrogenase Isoenzyme，LDH）等多種與能量代謝相關(guān)的酶類含量發(fā)生變化，進而影響精子的能量供應，造成精子運動障礙。同時，線粒體膜電位和ATP 水平極顯著降低。這與之前的報道一致，即無論是細菌還是其提純的毒素如LPS 均可以直接或間接地負面影響精子的線粒體，引起線粒體功能下降，導致精子質(zhì)量受損，從而降低精子的受精能力。正常的線粒體膜電位是保證ATP 產(chǎn)生的必需條件，是反映線粒體功能的主要指標，ATP 水解后釋放能量維持精子的運動和活力。因此，LPS 刺激后引起精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷，導致精子的活力下降，造成受精能力降低。

TLR4 作為LPS 的主要模式識別受體，可特異性識別LPS，進而在多種細胞中激活炎癥、凋亡、氧化應激等生物學反應。近年來的研究表明，細菌除了通過白細胞和細胞因子等對精子造成損傷外，也可直接作用于精子進而影響精子的活力。有研究發(fā)現(xiàn)基因在精子頂體部位表達，白細胞精子癥將引起其表達水平上調(diào)。本研究中，為闡明LPS 對綿羊成熟精子的直接作用，避免精液中白細胞、上皮細胞以及睪丸組織細胞等對試驗的干擾，采用上浮法獲得了高純度的精子樣品，用于進一步分析，結(jié)果表明LPS 刺激后精子表面基因表達上調(diào)，同時其表達位置由頭部向尾部擴展。LPS 刺激精子后，過表達基因?qū)踊盍Α⒕€粒體膜電位、ATP 水平均無顯著影響；而抑制TLR4信號通路后，緩解了LPS 誘發(fā)的精子活力、線粒體膜電位水平和ATP 水平的降低。Barbonetti 等研究發(fā)現(xiàn)，LPS 可以通過TLR4/CD14 途徑抑制精子線粒體膜電位，這與本實驗結(jié)果相似。因此，TLR4 信號通路在介導LPS 誘發(fā)的綿羊精子活力降低、線粒體功能障礙方面扮演著重要角色。

4 結(jié) 論

本研究采用上浮法獲得高活力、高純度的綿羊精子樣品，LPS（1 μg/mL）處理6 h 后，精子活力降低、線粒體結(jié)構(gòu)及功能受損；同時，精子表面基因的表達上調(diào)，表達位置由頭部向尾部擴展；過表達基因?qū)踊盍?、線粒體結(jié)構(gòu)及功能無顯著影響，抑制基因緩解了LPS 誘發(fā)的精子損傷。因此，TLR4信號通路在介導LPS 誘發(fā)的綿羊精子活力降低、線粒體功能障礙方面扮演著重要角色。