戎友俊，尚方正，馬 榮，王 敏，潘劍鋒，梁麗麗，張燕軍*，李金泉*

（1.內蒙古農業(yè)大學動物科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.農業(yè)農村部肉羊遺傳育種重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；3.內蒙古自治區(qū)動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古呼和浩特 010018；4.內蒙古自治區(qū)山羊遺傳育種工程技術研究中心，內蒙古呼和浩特 010018）

circRNA 是由單個RNA 前體通過反向剪接而成的一種閉合環(huán)狀的RNA 轉錄物，發(fā)現于包括哺乳動物在內的所有高等真核生物，circRNA 最大的特點是其具有閉合環(huán)狀結構，從而避免了被RNA 外切酶或者RNA 酶（RNase）降解，從而導致circRNA 在儲存時比其他非編碼RNA（ncRNA）更穩(wěn)定。1971 年科研人員研究發(fā)現馬鈴薯紡錘塊莖病由類病毒引起。類病毒與其他病毒的不同之處在于其外表面沒有蛋白質包裹，僅僅是單鏈環(huán)狀的RNA 分子。1979 年，科研人員第一次通過電子顯微鏡觀察到環(huán)狀的RNA 分子，這種circRNA 分子僅包含外顯子結構，穩(wěn)定存在于細胞質中。但circRNA 在當時并沒有引起研究者的重視，而且還被誤認為是罕見的轉錄“噪音”。隨著高通量測序技術的迅速發(fā)展，circRNA 又重新回到了研究前沿。2012 年，Salzman 等通過對健康和患病的人類細胞測序發(fā)現了大量的circRNA，報道了80 多個circRNA。自此，circRNA 的報道屢見不鮮。

大量實驗發(fā)現，circRNA 在生物體內發(fā)揮著重要功能，或直接作用于靶細胞發(fā)揮作用，又或通過解除miRNA 對靶細胞的抑制作用來發(fā)揮其功能。此外，circRNA 在進行GO、KEGG 功能富集時發(fā)揮著相似的功能，相關性較高。在對各個物種進行轉錄組測序時發(fā)現，都存在大量circRNA。本文綜述了circRNA 的產生、特征、性質、功能及其在畜禽遺傳調控中的應用研究，以期為探究circRNA 在畜禽應用中的功能機制提供理論依據。

1 circRNA 的產生

Jeck 等提出了circRNA 起源的2 個模型，即套索驅動的環(huán)化模型和內含子配對驅動的環(huán)化模型。如圖1 所示，在模型1 中，RNA 前體在轉錄過程中由于RNA 發(fā)生部分折疊，拉近相鄰的外顯子，使得下游外顯子的剪接供體（Splice Donor,SD）的3'端和上游外顯子的剪接受體（Splice Acceptor，SA）的5' 端結合，致使外顯子跳躍（Exon Skipping），從而產生包含外顯子的套索，這種套索是內部拼接的，去除內含子序列形成具有2 個外顯子的circRNA。Jeck 等也認為任何外顯子跳躍都有可能產生1 個circRNA。在模型2 中，RNA 前體上2 個不相鄰的內含子互補配對，使得與這2 個內含子相連的2 個外顯子相互接近，下游外顯子的剪接供體的3' 端和上游外顯子的剪接受體的5' 端結合，反向剪接形成套索，再切除內含子，形成circRNA。2 種模型主要的區(qū)別是在circRNA 產生的第一步。第1 種模型要求剪接供體與外顯子中的剪接受體共價結合，而第2 種模型涉及2 個內含子內的互補配對，來形成環(huán)狀結構。circRNA 形成的后續(xù)步驟很大程度上是相似的。也就是說，剪接體切除剩余的內含子，形成circRNA。另外，Stagsted 等研究發(fā)現富含脯氨酸/ 谷氨酰胺的剪接因子（SFPQ）可以確保長內含子的準確剪接，從而有效保持了內含子的完整性，控制circRNA 的產生。

圖1 索尾插接（Backsplicing）形成模型和circRNA 形成機制[3]

此外，有研究表明，選擇性環(huán)化（Alternative Circu larization）是產生circRNA 的另一種途徑，可能的機制如圖2 所示。RNA 的這種選擇性環(huán)化依賴于人類基因組內含子區(qū)域包含大量的互補序列（如Alu 序列），這些反向重復的互補序列可以使1 個基因產生多個circRNA 轉錄物，跨側翼內含子或單個內含子內的RNA 配對之間的競爭調節(jié)了外顯子的環(huán)化效率。然而，不是所有的互補序列都能促進環(huán)化。短內含子重復序列促進了circRNA 產生，而由于RNA 的部分折疊形成的發(fā)夾結構穩(wěn)定性增加抑制了circRNA 產生。

圖2 選擇性環(huán)化的可能機制[14]

2 circRNA 的特征、分類與性質

circRNA 廣泛存在于真核細胞的細胞質中，它由mRNA 前體反向剪接產生，具有共價閉合的環(huán)，沒有5'端帽子和3' 端多聚腺苷酸尾巴，可以調節(jié)真核生物中的基因表達。

circRNA 可以由外顯子或內含子產生，產生的circRNA分別稱為外顯子circRNA（Exonic circRNA，ecRNA）、內含子circRNA（circlar intronic RNA，ciRNA）、外顯子-內含子circRNA（Exon-intron circRNA，ElciRNA）。ecRNA 位于細胞質中，ciRNA 和ElciRNA 存在于細胞核中，ecRNA 和ElciRNA 成環(huán)時，RNA 的3' 端和5' 端磷酸二酯鍵相連，ciRNA 成環(huán)是2' 端和5' 端磷酸二酯鍵相連；這3 種circRNA 都不受RNA 外切酶（RNase R）的降解作用，而對于脫支酶（Debranching Enzyme）來說，ecRNA 和ElciRNA 不受其作用，ciRNA易受脫支酶的降解。

研究發(fā)現，類病毒（Viroids）和丁型肝炎病毒（Hepatitis Delta Virus，HDV）的復制方式很類似，最主要的相同點是依賴于宿主DNA 的RNA 聚合酶來啟動RNA 基因組的滾環(huán)復制，從而產生線性中間體，進一步被切分為較短的單體，最后將這些線性單體的5'端和3'端連接，產生反義circRNA，然后負鏈circRNA 經過滾環(huán)擴增，產生大量正鏈circRNA 基因組，將感染擴散。因此，circRNA 具有滾環(huán)擴增的能力。此外，circRNA 還有重新排列基因組信息順序的能力、免受核酸外切酶降解的能力、限制RNA 的折疊和結構穩(wěn)定（圖3）。

圖3 circRNA 的性質[22]

3 circRNA 的功能

circRNA 可能通過以下幾種方式發(fā)揮其生物學功能：作為miRNA 海綿；編碼、翻譯成蛋白質；參與基因轉錄調控；與蛋白質結合發(fā)揮作用。

3.1 作為micorRNAs（miRNAs）的海綿 circRNA 可以作為miRNA 的海綿，與mRNA 競爭miRNA 的靶標結合位點。大部分的circRNA 主要定位于細胞質中，發(fā)揮著競爭性內源RNA 機制，所以circRNA-miRNAmRNA 調控網絡的研究就成為circRNA 研究的熱點。Wang 等建立了小鼠孤獨癥模型，鑒定出1059 個差異表達的circRNA，構建了circRNA-miRNA-mRNA調控網絡，此網絡共有9715 個節(jié)點，包含1059 個circRNA、6730 個mRNA 和1926 個miRNA 和150408個邊。隨后對其進行GO 分析，發(fā)現這一調控網絡主要與“細胞過程”、“生物調節(jié)”、“生物過程調節(jié)”等有關，KEGG 分析發(fā)現，其主要富集在“軸突導向”、“MAPK 信號通路”、“Hippo 信號通路”等，這些研究結果對孤獨癥發(fā)病機制的揭示起著促進作用。

3.2 少量circRNA 也能編碼、翻譯成蛋白質 circRNA最初被定義為非編碼RNA，但隨著生物信息學分析技術和高通量測序技術的發(fā)展，國內外研究發(fā)現，ZNF609基因的二號外顯子環(huán)化產生的circ-ZNF609，其開放閱讀框中包含起始密碼子和終止密碼子，進一步的蛋白質組學分析以及Western blot 驗證發(fā)現內源的circ-ZNF609 具有翻譯蛋白質的功能，但翻譯效率低下，這一功能的發(fā)現可能為circRNA 的研究開拓一個新的方向。

3.3 參與基因轉錄調控 越來越多的實驗表明，circRNA 可以調控基因轉錄。Chao 等在對小鼠（）基因的分析中發(fā)現其轉錄本為環(huán)狀，這些也是成人大腦和腎臟中在該位點產生的主要轉錄本。同時，在外顯子4 或5 基因靶向缺失的小鼠中未檢測到這些環(huán)狀轉錄本，即使肢體發(fā)育正常，但是這些小鼠還是表現出腎功能發(fā)育不全的癥狀。這說明環(huán)狀轉錄本與腎臟發(fā)育之間存在聯系。作者提出了一個模型，其中，環(huán)狀Fmn RNA 作為一個功能性的mRNA“陷阱”，在該模型中，所有未加工的Fmn RNAs 被拼接形成一個環(huán)狀的RNAs 分子，由于沒有被翻譯成功能性的蛋白質產物，因此成為無功能的RNAs。circRNA的形成使基因產生的轉錄本陷入無功能狀態(tài)，并阻止某些可以翻譯的正常線性轉錄物的存在。因此，控制circRNA 形成可以調節(jié)正常線性RNA 轉錄物的表達水平，從而調節(jié)基因功能。

3.4 與蛋白質結合發(fā)揮作用 circRNA 可以與RNA 結合蛋白（RNA Binding Proteins，RBP）結合發(fā)揮作用。Du 等研究發(fā)現circ-FoxO3 可以通過結合和p21 蛋白形成三元復合物，抑制的功能，阻斷細胞周期進程。不難發(fā)現，circ-FoxO3 作為一個蛋白相互作用的腳手架，通過與眾多蛋白結合從而影響蛋白的功能，但circ-FoxO3 究竟是以何種方式與蛋白質結合有待進一步研究。

4 circRNA 在畜禽遺傳調控中的應用研究

4.1 circRNA 在豬上的應用研究 circRNA 在豬上的研究主要集中于骨骼肌生長發(fā)育、脂肪沉積、卵巢的發(fā)育方面。

肌肉是生物機體最大的器官，其功能或再生特性喪失會導致肌肉骨骼疾病。研究影響骨骼肌形成的因素有助于解開骨骼肌的分子之謎。circRNA 在豬骨骼肌的形成中發(fā)揮著至關重要的作用。Liang 等從貴州小香豬的9 個器官和3 塊骨骼肌中鑒定出5 934 個circRNA，發(fā)現有149 個circRNA 可能與肌肉生長有關，因為它們的宿主基因顯著參與肌肉發(fā)育、收縮和染色質修飾等過程。李巧偉等研究鑒定了8 486 條circRNA，并指出3 個與豬骨骼肌生長發(fā)育相關的circRNA，即sus-MYH2_0025、sus-CDK13_0002、sus-FANCL_0003，構建了circRNA-miRNA 調控網絡。Hong 等對杜洛克豬胚胎肌肉發(fā)育中的circRNA 展開研究，發(fā)現超過5 000 個circRNA 特異性表達，綜合分析了競爭性內源RNA（ceRNA）的圖譜，發(fā)現circTUT7 在ceRNA 機制中調節(jié)HMG20B 的表達，表明circRNA 在豬胚胎的發(fā)育中起作用。Li 等構建了豬的股二頭肌（Bf）和比目魚?。⊿ol）的circRNA 表達譜，鑒定出Bf 和Sol 肌肉之間242 個差異表達的circRNA，對這些circRNA 進行GO 和KWGG 富集，發(fā)現它們主要被富集到骨骼肌纖維相關的信號通路（如AMPK 和cGMPPKG），并構建circRNA-miRNA-mRNA 網絡，發(fā)現多個circRNA 可充當miR-499-5p 的海綿，miR-499-5p優(yōu)先在慢肌中表達，并降低杜興肌營養(yǎng)不良癥（DMD）的嚴重程度，為進一步深入研究circRNA 在骨骼肌纖維形成中的調節(jié)機制提供了全面的circRNA 資源。

脂肪組織是豬體內重要的產熱器官。Li 等在萊蕪豬皮下脂肪組織中，鑒定出275 個差異表達的circRNA，并構建了circRNA_26852-miRNA-mRNA 和circRNA_11897-miRNA-mRNA 調控網絡，通過GO 和KWGG 富集分析發(fā)現，circRNA_26852 和circRNA_11897的靶基因富集到脂肪細胞分化和脂質代謝相關的途徑。左小元在豬脂肪干細胞中鑒定出243 個差異表達的circRNA，這些circRNA 的來源基因富集于PI3K-Akt通路，MAPK 信號通路等，暗示circRNA 可能通過這些信號通路影響細胞多能性。

卵巢細胞的發(fā)育程度是衡量豬繁殖力的重要指標。Guo 等在豬健康卵巢和閉鎖起始階段的竇卵泡中篩選出197 個差異表達的circRNA，通過預測circRNA 與miRNA 的靶向關系，確定出16 個功能性的miRNA。Cao 等在卵丘細胞和卵母細胞中鑒定出7 067 和637個circRNA，circRNA 的宿主基因顯著富集于卵丘細胞功能和卵母細胞成熟相關的多種信號通路中，這些結果表明circRNA 對豬卵母細胞的成熟至關重要。

4.2 circRNA 在反芻動物中的應用研究 circRNA 在羊上的研究較為廣泛，在羊的組織、各類細胞、子宮上都鑒定出circRNA。Varela-Martínez Endika 等進行了綿羊外周血單核細胞和頂葉皮層中circRNA 的研究，在頂葉皮層和外周血單核細胞中分別檢測到了2510 個和3403 個circRNA，共發(fā)現了1379 個新的circRNA。GO 和KEGG 功能富集分析表明來自腦的circRNA 在突觸功能中發(fā)揮著重要作用，來自外周血單核細胞的circRNA 參與基本免疫系統功能。Yin 等在絨山羊次級毛囊干細胞中鑒定出了circRNA-1926。經過研究發(fā)現，circRNA-1926 作為miR-148a/b-3p 的海綿來促進CDK19 基因的表達，并且促進絨山羊次級毛囊干細胞向毛囊譜系的分化。Zhang 等發(fā)現在奶山羊乳腺上皮細胞中，circRNA-006258 可以作為miR-574-5p的海綿，并通過同向性病毒5 樣結合位點（Ecotropic Viral Integration Site 5-like,EVI5L）來調節(jié)細胞生長和乳汁合成，這可能為奶山羊的育種提供科學依據。Song 等分析了妊娠期山羊子宮內膜中circRNA 的表達譜，鑒定出21813 個circRNA。其中，在子宮內膜的接收態(tài)前期（Pre-receptive Endometrium,PE），有9078 個circRNA 是特異性的；在子宮內膜的接收態(tài)期（Receptive Endometrium,RE），有5925 個circRNA是特異性的。通過進一步的研究發(fā)現，和PE 相比較，RE 有334 個差異表達的circRNA。Zhang 等發(fā)現circRNA-9119 可以作為miR-26a 的海綿，預測了奶山羊子宮內膜上皮細胞的靶位點，而miR-26a 通過此位點來下調前列腺素內過氧化物合酶2（Prostaglandinendoperoxide Synthase 2,PTGS2）的表達。作者指出，子宮內膜上皮細胞中的circRNA-9119-miR-26a-PTGS2通路可能成為調控RE 發(fā)育的潛在靶點。La 等比較了蘇尼特綿羊子宮組織在3 種不同光周期，即短光周期（SP）、短轉長光周期（SLP）和長光周期（LP）中的基因表達譜，結果發(fā)現，有124、270、400 個差異表達的circRNA 分別存在于SP 和LP，SP 和SLP，LP 和SLP 中，差異表達的RNA 主要參與GnRH 信號通路、甲狀腺激素合成和甲狀腺激素信號通路。這些發(fā)現可能有助于揭示綿羊季節(jié)性繁殖的分子機制。

circRNA 主要與牛的成肌細胞和脂肪細胞相聯系，以探究牛肉品質的影響因素。Liu 等對山東黑牛和魯西牛的背最長肌進行轉錄組測序后，鑒定了14640個circRNA，其中有655 個circRNA 差異表達，并發(fā)現它們參與多種生物過程，如肌纖維發(fā)育、平滑肌細胞增殖、骨系統形態(tài)發(fā)生等等。也鑒定出circ0014518 和miR-1 有結合位點，為后續(xù)的實驗奠定了基礎。Huang等探究了影響黃牛和水牛肌肉品質的分子機制，利用RNA-seq 技術檢測到10 449 個circRNA，有1128個circRNA 差異表達，驗證發(fā)現circEch1 是肌肉發(fā)育過程中差異最顯著的circRNA 之一，過表達circEch1可以抑制牛成肌細胞增殖，促進分化，circEch1 還能夠促進骨骼肌再生，表明circEch1 誘導成肌細胞分化和骨骼肌再生，這也為circRNA 調控牛肉品質的機制提供了新的見解。蔣瑞篩選出了與脂肪發(fā)育相關的circFUT10，驗證發(fā)現其與let-7c 結合來促進脂肪細胞增殖，從而為秦川牛的育種工作提供理論依據。Li 等發(fā)現miR-107 抑制牛成肌細胞的分化和凋亡，但不影響細胞的增值，circFGFR4 不影響細胞增值，但結合miR-107 之后可促進成肌細胞的分化和凋亡，并減輕其對Wnt3a 的抑制作用，從而驗證了CircFGFR4-miR-107-Wnt3a 調控網絡，為牛的肌肉研究提供分子基礎。

4.3 circRNA 在禽類中的應用研究 禽病是影響?zhàn)B殖戶經濟效益的重要因素，探究其免疫機理的影響因素對于預防和治療禽病有著非同尋常的意義。Yu 等探究了柔嫩艾美耳球蟲感染雞盲腸后circRNA 表達譜的變化，構建了circRNAs-mRNA 共表達網絡，發(fā)現circRNA2202 和circRNA0759 與（）的表達呈正相關。因此，這兩個circRNA 可能通過調節(jié)基因參與球蟲感染的免疫應答。Yang 等發(fā)現circRNA-3079 廣泛表達于雞的各種組織中，circRNA-3079 和預測的靶基因在許多與免疫或腫瘤相關的通路中富集，如p53 信號通路，Jak-STAT 信號通路等，揭示了circRNA-3079 可能通過調節(jié)靶基因間接調節(jié)禽白血病病毒（ALV-J）的感染過程。Shen 等分析了雞卵泡發(fā)育過程中卵泡膜細胞中的circRNA，鑒定 出14 502 個circRNA，其中5 622 個circRNA 廣泛分布于所有發(fā)育階段。這些信息表明circRNA 在卵泡膜細胞發(fā)育過程中的代謝和免疫過程以及凋亡、增殖和分化中起著重要作用。

骨骼肌是生物體最重要的組成部分，也與家禽的生產力息息相關。Ouyang 等對不同胎齡雞的腿部肌肉進行測序，鑒定出13377 個circRNA，其中有462個circRNA 差異表達，說明circRNA 在雞的胚胎期肌肉發(fā)育過程中大量存在并動態(tài)表達，并且可能與骨骼肌的生長有關。隨后又探討了circSVIL 對骨骼肌發(fā)育的影響，發(fā)現circSVIL 在雞胚胎骨骼肌發(fā)育后期高水平表達。circSVIL 作為miR-203 的海綿，并上調靶基因和的表達，從而促進雞胚胎骨骼肌的發(fā)育。Shen 等發(fā) 現circTMTC1 作 為miR-128-3p 的海綿在機體內發(fā)揮作用，circTMTC1 的敲除加速了雞骨骼肌衛(wèi)星細胞（SMSCs）的增殖和分化；而且，過表達circTMTC1 則抑制了SMSCs 的生長，所以在生產實踐中，可以抑制circTMTC1 來達到讓骨骼肌生長的目的。

5 展 望

自1990 年人類基因組計劃啟動以來，研究者的目光大多集中在人類的DNA 和編碼RNA 上，而對于非編碼RNA 的研究極少。高通量測序技術的迅速發(fā)展使得miRNA、lncRNA 和circRNA 逐漸受到研究人員的重視，但大多數的研究集中在人類癌癥等疾病方面，在動物上這些非編碼RNA 是如何表達以及發(fā)揮調控作用的研究也相對匱乏，只在部分動物的個別性狀有所研究，自然也就缺乏相關的數據庫。因此，運用轉錄組測序、芯片等技術在動植物上建立更多非編碼RNA 的數據庫從而為探究其具體的功能機制奠定基礎是后續(xù)探究非編碼RNA 的一項重要工作。

同時，circRNA 的研究還處在遺傳調控方面，而對于細胞生物學機制還沒有特別成熟和系統的研究，只能通過轉錄組數據或者免疫組化等技術來研究一個物種的某個組織或者細胞發(fā)生發(fā)育有哪些circRNA 在發(fā)揮調控作用，而這些circRNA 如何來調控細胞的增殖、分化、凋亡和遷移等具體機制還有待進一步研究。在更多物種中開展circRNA 的研究和進一步探究circRNA 的機制對發(fā)現未知領域和揭示機體生命活動具有重大意義。因此對于circRNA 的研究仍有很長的路要走。