宋小玲，高冀婷，曹菲薇，胡子毅，任大喜

（浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058）

高血壓是引起心腦血管疾病和中風(fēng)的重要危險(xiǎn)因素之一[1]。近年來，高血壓人群在全球范圍內(nèi)持續(xù)增加[2]。中國高血壓調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2018年我國成人的高血壓患病人數(shù)達(dá)2.45億，且患者越來越年輕化[3?4]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）在血壓調(diào)節(jié)方面起著重要作用，可以將血管緊張素I（Ang I）轉(zhuǎn)化為具有收縮血管功能的血管緊張素II，還可以將具有血管舒張作用的緩激肽水解成失活片段[5]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是治療高血壓最常用的藥物之一[6?7]，盡管藥物療法是最廣泛用于治療高血壓的方法，但長期使用具有繼發(fā)性副作用。發(fā)酵乳被推薦作為高血壓的非藥物療法，主要因?yàn)樗緹o副作用。發(fā)酵乳的降壓效果[8?9]主要?dú)w因于乳蛋白中的ACE抑制肽（ACEI肽），這些肽可以在特定乳酸菌發(fā)酵或胃腸消化過程中被釋放出來，通過抑制ACE活性來引起血管擴(kuò)張反應(yīng)，從而降低血壓。

關(guān)于ACEI肽研究最多的是乳酸桿菌菌株[10?11]，例如Lb. helveticus、Lb. casei、Lb. paracasei、Lb. fermentum、Lb. plantarum、Lb. rhamnosus等，其中以瑞士乳桿菌（Lb. helveticus）最多。研究最多的ACEI肽[12]是在瑞士乳桿菌發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)的VPP和IPP，在幾種大鼠模型和人體研究中都顯示出降血壓效果。目前市面上的降血壓發(fā)酵乳[13?14]基本都是國外的，芬蘭和日本研發(fā)的降血壓發(fā)酵乳對(duì)高血壓的治療有顯著效果，知名度較高。雖然市面上存在具有降血壓作用的商業(yè)發(fā)酵乳，但品種稀缺，且大多數(shù)基于瑞士乳桿菌。

研究表明乳酸菌的細(xì)胞壁蛋白酶負(fù)責(zé)生產(chǎn)ACEI肽，細(xì)胞壁蛋白酶可以將乳蛋白分解成寡肽并將其用作營養(yǎng)來源，乳酸菌的細(xì)胞壁蛋白酶活性、蛋白水解系統(tǒng)和菌株活性是生產(chǎn)降壓肽的基礎(chǔ)。酶的特異性決定了釋放肽的序列，每個(gè)菌株的酶有特異性[15]，具有富產(chǎn)ACEI肽潛力的乳酸菌是開發(fā)降血壓發(fā)酵乳的前提。因此，篩選具有富產(chǎn)ACEI肽的新型乳酸菌并開發(fā)含有新型乳酸菌的功能性乳制品，對(duì)促進(jìn)人體健康和滿足人們對(duì)功能性食品的消費(fèi)需求意義重大。本研究擬在實(shí)驗(yàn)室乳酸菌庫中，篩選出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的富產(chǎn)ACE抑制肽的乳酸菌，為后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)、臨床研究、降壓發(fā)酵乳及乳制品的開發(fā)提供菌株和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株：本實(shí)驗(yàn)室篩選的菌株來自內(nèi)蒙及川藏地區(qū)酸奶湯、鮮奶、奶疙瘩、手工酸奶及浙江新生嬰兒糞便等分離到的遺傳穩(wěn)定性優(yōu)良的30多株菌；指示菌株：大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）ATCC 25922、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 13311 美國典型培養(yǎng)物保藏中心；單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC 54007、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003 中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心；膽鹽、MRS肉湯培養(yǎng)基、瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；脫脂乳粉 新西蘭恒天然有限公司；水牛乳 廣西水牛研究所牧場；FAPGG底物、ACE（來自兔肺，酶活0.1 UN）、胃蛋白酶（1:3000）和胰蛋白酶（1:250） Sigma公司；BCA蛋白試劑盒 上海源葉生物科技有限公司；HEPES（4-羥乙基哌嗪乙磺酸） 阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰?；抗生素藥敏試紙 杭州微生物試劑有限公司；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀 上海道尚生物科技有限公司；3-30K低溫高速離心機(jī) 德國Christ公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；ES-315高壓滅菌鍋 日本TOMY公司；BD-305E變溫冷凍凍藏箱 浙江星星冷鏈集成股份有限公司；SW-CJ-IF超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵乳制備 取出實(shí)驗(yàn)室乳酸菌庫中保藏的菌株，在MRS固體培養(yǎng)基上活化三代，取單菌落接于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)20 h后取出，用PBS將菌株濃度調(diào)至108CFU/mL，按照3%（v/v）的接種量接種到滅菌脫脂乳（11%，w/v）中，37 ℃培養(yǎng)48 h后取出，?20 ℃冰箱放置，待進(jìn)一步分析。

1.2.2 蛋白水解度測定 蛋白水解度的測定參考羅艷華等[16]的方法。以絲氨酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用OPA法測定樣品在340 nm處的吸光值，通過公式計(jì)算蛋白水解度（DH）。稱取0.01 g絲氨酸于100 mL容量瓶中定容，使其濃度為1 mmol/L，再加超純水稀釋至0、0.2、0.4、0.6、0.7、0.8、0.9 mmol/L，配制成絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，向96孔板中加入20 μL絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和150 μL OPA溶液混合，靜置2 min后讀取340 nm的吸光值（標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5746x+0.0178，R2=0.9935）。將發(fā)酵乳清稀釋20倍后，取20 μL樣品與150 μL OPA溶液混合，靜置2 min后讀取340 nm的吸光值，計(jì)算公式如下：

式中：Wserine NH2表示每克蛋白質(zhì)含絲氨酸的量，mmol/g；C表示樣品OD值相對(duì)應(yīng)于標(biāo)曲中絲氨酸的濃度，mol/L；V表示樣品體積，L；N表示稀釋倍數(shù)；X表示樣品質(zhì)量，g；h表示每克蛋白因水解被斷裂的肽鍵數(shù)，mmol/g；htot表示每克蛋白所含的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g；乳蛋白的α值為1.0，β值為0.4。

1.2.3 ACE抑制率測定 發(fā)酵乳清的制備：將發(fā)酵乳pH調(diào)至4.6，8000 ×g離心10 min取上清液，再將上清液pH調(diào)至8.3，8000 ×g離心10 min取上清液得發(fā)酵乳清。

HEPES緩沖液：pH8.3，80 mmol/L HEPES緩沖液（含30 mmol/L的NaCl）；FAPGG溶液：取FAPGG粉末加入到HEPES緩沖液中，配制成1.0 mmol/L的FAPGG溶液；ACE溶液：取ACE固體加入到HEPES緩沖液中，配制成0.1 U/mL的ACE溶液。

ACE抑制率的測定方法參考羅鵬[17]和Memarpoor等[18]并略作修改。以FAPGG底物法測定發(fā)酵乳清的ACE抑制率。取40 μL樣品和50 μL的FAPGG混合均勻，最后加入10 μL的ACE溶液，利用酶標(biāo)儀測定OD340數(shù)值的前后變化來代表ACE酶活性?？瞻讓?duì)照采用HEPES緩沖液（40 μL），其余測定同上。抑制率可用公式表示：

式中：ΔA為空白對(duì)照組在0～40 min內(nèi)吸光值的變化；ΔB為實(shí)驗(yàn)組（ACE抑制劑）在0～40 min時(shí)吸光值的變化。

IC50測定：將發(fā)酵乳清凍干，取凍干粉加水復(fù)配成30 mg/mL溶液，參照羅鵬[17]測定溶液中多肽含量，將樣品溶液8000 g 離心10 min保留上清液，使用10 kDa超濾管對(duì)上清液進(jìn)行超濾，取超濾液借助BCA試劑盒測定其多肽含量（酶標(biāo)儀法），將樣本溶液稀釋至6個(gè)多肽濃度梯度0.001、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，測定各濃度梯度下的ACE抑制率，利用Graph Pad Prism 8軟件計(jì)算樣品的IC50值（IC50定義為ACE抑制率達(dá)50%時(shí)所需的多肽濃度）。

1.2.4 模擬胃腸消化 人工胃液和腸液參考Lisson等[19]進(jìn)行配制。取發(fā)酵乳5 mL，將發(fā)酵乳與人工胃液按2:1（v/v）混合，于37 ℃恒溫水浴振蕩器中消化2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，取樣測定其ACE抑制率；胃蛋白酶消化后的樣品按1:1（v/v）的量與人工腸液混合，在恒溫水浴振蕩器中消化2 h，沸水浴加熱10 min以終止反應(yīng)，取樣測定其ACE抑制率。

1.2.5 菌株16S rRNA鑒定 將篩選到的菌株送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序，將所得到的序列于NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進(jìn)行同源性比較確定菌屬。使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.2.6 益生特性評(píng)價(jià)

1.2.6.1 乳酸菌酸耐受性能測定 參考鄭志瑤等[20]的方法，將乳酸菌（濃度約108CFU/mL）以10%（v/v）接種量接于pH為3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在0、3 h取菌液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算酸耐受性：

式中：A0、A3分別為待測菌株0和3 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6.2 乳酸菌膽鹽耐受性能測定 參考鄭志瑤等[20]的方法，將乳酸菌（濃度約108CFU/mL）以10%（v/v）的接種量接于含0.3%牛膽鹽（v/v）的MRS液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在0、3 h取菌液，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算膽鹽耐受性：

式中：T3、T0分別為待測菌株0和3 h的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.2.6.3 乳酸菌的抑菌活性 參考梁竟一等[21]的方法，采用牛津杯法和瓊脂擴(kuò)散法測量菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11代謝產(chǎn)物的抑菌活性。將已活化好的4種指示菌株（大腸桿菌、沙門氏菌、金黃葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌）的菌懸液濃度調(diào)至108CFU/mL，按1%（v/v）的量接種到LB瓊脂培養(yǎng)基（50 ℃）中，混合均勻后倒培養(yǎng)皿中（15 mL/皿），冷凝后拔掉事先放置的無菌牛津杯，將菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的代謝上清樣品加入杯孔中（200 μL/孔），以未接乳酸菌的MRS肉湯作為空白對(duì)照，在37 ℃下培養(yǎng)，24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.6.4 乳酸菌的抗生素敏感性 參考梁竟一等[21]的方法，采用紙片擴(kuò)散法[22]測量菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的抗生素敏感性。分別取100 μL菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的菌懸液（約108CFU/mL）于MRS固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，然后放置抗生素試紙，在37 ℃下培養(yǎng)，24 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.7 乳酸菌對(duì)不同發(fā)酵底物效果比較 將荷斯坦脫脂乳粉按11%濃度加水復(fù)配，調(diào)整pH至4.6，8000×g離心10 min保留上清液，調(diào)上清液pH至7.0得荷斯坦牛乳清；水牛乳由廣西水牛所提供，將水牛乳5000×g離心10 min脫脂，然后調(diào)整pH4.6，8000 ×g離心10 min保留上清液，調(diào)上清液pH至7.0得水牛乳清。使用BCA試劑盒分別測定荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清、水牛脫脂乳、水牛乳清的蛋白濃度。用超純水將4種底物的蛋白濃度調(diào)整為同一濃度，將菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11按3%（v/v）的量接種到這4種底物中，37 ℃發(fā)酵48 h，取樣測定ACE抑制率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。采用Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合得到回歸曲線圖；采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及顯著性分析（one-way ANOVA和two-way ANOVA），使用Tukey進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P<0.05的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的初篩

對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的30多株菌進(jìn)行脫脂乳發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定菌株的水解度在2.74%～7.54%之間，篩選出了13株水解能力最強(qiáng)的菌株（P<0.05）用于后期研究，如圖1所示。初篩得到的13種菌株，其蛋白水解度均在5%以上，其中菌株ZJUIDS22和ZJUIDS13的蛋白水解能力最強(qiáng)（P<0.05），水解度分別達(dá)7.54%和7.51%。

圖1 菌株發(fā)酵乳的蛋白水解度Fig.1 Protein hydrolysis degree of fermented milk by different strains

2.2 產(chǎn)ACE抑制肽乳酸菌的復(fù)篩

對(duì)上述篩選到的13株水解能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定ACE抑制率，所得結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，抑制效果最好的是菌株ZJUIDS11，其ACE抑制率達(dá)90.41%。13株乳酸菌中，有6株乳酸菌發(fā)酵乳的ACE抑制率顯著高于其它株（P<0.05），其ACE抑制率均在80%以上，篩選該6株菌用于后續(xù)的研究。

圖2 不同菌株發(fā)酵乳的ACE抑制率Fig.2 ACE inhibition rate of fermented milk by different strains

2.3 乳酸菌發(fā)酵乳在模擬胃腸液中ACE抑制率的變化

6株菌的發(fā)酵乳經(jīng)人工胃液和腸液消化后的ACE抑制率見圖3。6種菌株發(fā)酵乳經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解作用后，ACE抑制率全部下降，顯著低于消化前（P<0.05）。ZJUIDS09發(fā)酵乳經(jīng)胃液和腸液作用后，ACE抑制率無顯著性變化（P＞0.05）；ZJUIDS11發(fā)酵乳經(jīng)胃液和腸液消化后ACE抑制率先降低后升高（P<0.05）；經(jīng)人工腸液后，ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率分別達(dá)到了70.13%±0.15%和76.39%±2.91%，顯著高于其它4株菌（P<0.05）。因此，經(jīng)篩選得ZJUIDS09和ZJUIDS11為富產(chǎn)ACE抑制肽的最佳潛力菌株。

圖3 人工胃液和腸液對(duì)發(fā)酵乳ACE抑制率的影響Fig.3 Effect of artificial gastric juice and intestinal juice on the ACE inhibition rate of fermented milk

2.4 菌株的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)篩選后發(fā)現(xiàn)，菌株ZJUIDS09發(fā)酵乳的ACE抑制率為87.39%±2.44%，菌株ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率為90.41%±0.99%，兩者都能耐受模擬消化環(huán)境。送樣測定兩株菌的16S rDNA序列，將獲測序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)。綜合16S rDNA和系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果可知（圖4），菌株ZJUIDS09為羅伊氏乳桿菌（Limosilactobacillus reuteri），菌株ZJUIDS11為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticusstrain）。

圖4 兩株乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of two lactic acid bacteria

2.5 潛力菌株發(fā)酵乳的ACE抑制IC50值測定

ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率與其多肽濃度之間存在明顯的量效關(guān)系，多肽濃度與ACE抑制率之間的關(guān)系如圖5A（R2=0.951）和圖5B（R2=0.928）所示。根據(jù)Graph Pad Prism 8.0軟件進(jìn)行非線性擬合得到ZJUIDS09和ZJUIDS11發(fā)酵乳ACE抑制IC50值分別為0.31、0.25 mg/mL（注：IC50定義為ACE抑制率達(dá)50%時(shí)所需的多肽濃度）。

圖5 發(fā)酵乳的多肽濃度與ACE抑制率間的關(guān)系Fig.5 Relationship between the peptide concentration of fermented milk and ACE inhibitory rate

2.6 兩株乳酸菌的益生特性

2.6.1 兩株乳酸菌的酸耐受率和膽鹽耐受率 本試驗(yàn)中，菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的酸耐受率和膽鹽耐受率如表1所示。胃液的pH一般在2～3左右，具有酸耐受性的乳酸菌才能進(jìn)入胃腸道中發(fā)揮作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示兩株菌的酸耐受率分別為62.50%和152.00%，ZJUIDS11的酸耐受率是ZJUIDS09的2倍以上。人體小腸內(nèi)的膽鹽含量約為0.30%，具有膽鹽抗性的乳酸菌才能在小腸中維持活力并發(fā)揮益生菌作用，試驗(yàn)結(jié)果顯示兩株菌的膽鹽耐受率分別為0.26%和0.004%，表明ZJUIDS09可以耐受小腸的膽鹽環(huán)境，ZJUIDS11幾乎沒有膽鹽抗性。

表1 乳酸菌的酸、膽鹽耐受率Table 1 Acid and bile salt tolerance rate of lactic acid bacteria

2.6.2 兩株乳酸菌對(duì)4種常見致病菌的抗菌活性 在本試驗(yàn)中，采用4種腸道致病菌作為指示菌，分別檢測菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11上清液的抑菌活性，數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11對(duì)4種致病菌均有一定的抑制作用，菌株ZJUIDS09對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有顯著的抑制效果（P<0.05），抑菌圈達(dá)15.25 mm，菌株ZJUIDS11對(duì)金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌和大腸桿菌有顯著的抑制效果（P<0.05），其中對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制效果最好，抑菌圈達(dá)15.01 mm。因此，菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11生長過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)具有一定的抗菌活性，對(duì)人體腸道健康具有促進(jìn)作用。

表2 乳酸菌的抑菌活性Table 2 Antibacterial activity of lactic acid bacteria

2.6.3 兩株乳酸菌的抗生素敏感性 根據(jù)CLSI的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)菌株ZJUIDS09和ZJUIDS11的常見抗生素敏感性進(jìn)行判斷，結(jié)果見表3。菌株ZJUIDS09對(duì)4種抗生素（氯霉素、紅霉素、克拉霉素、林可霉素）呈現(xiàn)敏感狀態(tài)，其中對(duì)氯霉素最敏感，抑菌圈達(dá)35.15 mm，對(duì)青霉素中度敏感。菌株ZJUIDS11對(duì)2種抗生素（紅霉素、四環(huán)素）呈現(xiàn)敏感狀態(tài)，其中對(duì)紅霉素最敏感，抑菌圈達(dá)20.51 mm，對(duì)氯霉素、克拉霉素和氨芐青霉素中度敏感。試驗(yàn)結(jié)果表明兩株菌均對(duì)紅霉素表現(xiàn)出較高的敏感性，對(duì)4種常見抗生素（氯霉素、紅霉素、克拉霉素、四環(huán)素）均無耐藥性（注：對(duì)抗生素敏感與中度敏感被認(rèn)為不具備耐藥性），菌株安全性較好。

表3 兩株乳酸菌的抗生素敏感性Table 3 Antibiotic sensitivity of two lactic acid bacteria

2.7 兩株乳酸菌對(duì)不同底物的發(fā)酵后ACE抑制效果比較

將水牛脫脂乳、水牛乳清、荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清這4種底物調(diào)整為同一蛋白濃度，加入乳酸菌ZJUIDS09和ZJUIDS11進(jìn)行發(fā)酵，測定發(fā)酵上清液的ACE抑制率。如圖6，不同菌株發(fā)酵水牛脫脂乳和水牛乳清，ACE抑制率分別在77.25%～89.92%和34.22%～37.38%之間；不同菌株發(fā)酵荷斯坦脫脂乳和荷斯坦乳清，ACE抑制率分別在86.46%～88.48%和37.29%～41.32%之間；無論是荷斯坦脫脂乳還是水牛脫脂乳，發(fā)酵后的ACE抑制率都顯著高于乳清（P<0.05）；對(duì)比荷斯坦脫脂乳和水牛脫脂乳發(fā)酵后的ACE抑制率，發(fā)現(xiàn)二者并無顯著性差異（P＞0.05）；使用不同菌株發(fā)酵同一底物，發(fā)現(xiàn)其ACE抑制率無顯著性差異（P＞0.05）。

圖6 四種發(fā)酵底物的ACE抑制率Fig.6 ACE inhibitory rate of four different fermentation substrates

3 討論

具有產(chǎn)ACE抑制肽功能的乳酸菌研究[23]受到越來越多的關(guān)注，不同菌株的蛋白水解能力存在較大差異[24]，菌株發(fā)酵乳的蛋白水解度越高，則代表該菌株的蛋白酶解系統(tǒng)越豐富，可以將乳蛋白降解生成大量的多肽，產(chǎn)肽效果較好的菌株更具備生產(chǎn)ACEI肽的潛力。本試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的30多株菌進(jìn)行脫脂乳發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以水解度作為初篩指標(biāo)選出13株水解蛋白能力最強(qiáng)的菌株（P<0.05），水解度均在5%以上。

乳酸菌[25]酶解乳蛋白釋放出ACEI肽，這些短肽可以與ACE活性中心結(jié)合，從而阻礙血管緊張素Ⅱ的生成以及促進(jìn)緩激肽的降解，達(dá)到降血壓的功效。Li等[26]從41株干酪乳桿菌中，篩選出2株產(chǎn)ACE抑制肽效果最佳的菌株，抑制率最高達(dá)73.50%；Chen等[27]從59株瑞士乳桿菌中，篩選出3株產(chǎn)ACE抑制肽的菌株，抑制率最高達(dá)81.71%；Pihlanto等[28]篩選出25種具有ACE抑制率的乳酸菌發(fā)酵乳，ACE抑制率在5%～74%之間，IC50在0.42～0.52 mg/mL之間；Tsai等[29]使用乳酸菌（嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌）和蛋白酶發(fā)酵脫脂乳，測定發(fā)酵上清的IC50值為0.27 mg/mL；Leclerc等和Fuglsang等[30?31]使用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳，測定發(fā)酵乳清的IC50為0.16～1.1 mg/mL。本研究從13株水解蛋白能力較強(qiáng)的菌株中篩選出6株產(chǎn)ACEI肽效果較好的菌株，其中羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11發(fā)酵乳的ACE抑制率分別達(dá)87.39%和90.41%，IC50值分別為0.31和0.25 mg/mL，與上述菌株相比ACE抑制率更強(qiáng)。這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)篩選出的菌株，具有較豐富的蛋白酶系統(tǒng)，其細(xì)胞壁蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶及氨基肽酶，可以高效地酶解牛乳蛋白，產(chǎn)生的活性肽可以有效且穩(wěn)定地與ACE活性中心結(jié)合，從而抑制ACE的活性。

乳酸菌發(fā)酵乳釋放的生物活性肽應(yīng)能抵抗胃腸蛋白酶的消化才能發(fā)揮作用[32?33]。一些肽序列在發(fā)酵后是無活性的，但是經(jīng)過胃腸蛋白酶消化后會(huì)被激活，一些發(fā)酵產(chǎn)生的活性肽在經(jīng)過胃腸蛋白酶消化后會(huì)被水解成小的滅活片段，因此模擬胃腸消化后的ACE抑制率是發(fā)酵乳在人體內(nèi)發(fā)揮作用的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)從6株產(chǎn)ACEI肽效果較好的乳酸菌中，通過模擬胃腸消化篩選出2種抗消化的菌株發(fā)酵乳，分別是ZJUIDS09和ZJUIDS11。這兩種菌株發(fā)酵乳在經(jīng)過胃腸液消化后，ACE抑制率均有所下降，ZJUIDS09菌株發(fā)酵乳下降至70.13%，ZJUIDS11菌株發(fā)酵乳下降至76.39%。Chen等[34]使用植物乳桿菌L69（Lactobacillus plantarumL69）發(fā)酵山羊奶，通過體外胃腸液消化后發(fā)現(xiàn)，消化前的ACE抑制率可達(dá)79.11%，經(jīng)胃消化后降至70.22%，最后在腸道環(huán)境中維持59.89%，發(fā)酵乳經(jīng)過胃腸消化后ACE抑制率會(huì)降低。這與本試驗(yàn)結(jié)果較一致，原因可能是乳酸菌生產(chǎn)的ACE抑制肽經(jīng)胃腸蛋白酶消化后釋放出了一些小的失活片段。相比其他學(xué)者的試驗(yàn)結(jié)果，本試驗(yàn)篩選的這兩種菌株發(fā)酵乳在經(jīng)過胃腸液消化后的ACE抑制率仍較為穩(wěn)定。因此，ZJUIDS09和ZJUIDS11為富產(chǎn)ACE抑制肽的潛力菌株。

膽鹽和酸耐受性試驗(yàn)旨在測試乳酸菌是否能夠通過模擬人體胃酸和腸道環(huán)境，從而提高存活的定植概率。本次試驗(yàn)篩選的兩種乳酸菌的酸耐受率均在60%以上，與嗜酸乳桿菌相當(dāng)[35]，具有良好的耐酸性。大部分乳酸菌在膽鹽中的存活率都處于0.2%～0.4%之間[36?38]，本試驗(yàn)中的羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09的膽鹽存活率為0.26%，比瑞士乳桿菌ZJUIDS11更有可能在腸道中存活甚至定植。此外，抗菌特性表明這兩株菌的代謝產(chǎn)物能在一定程度上抵御腸道有害菌的侵害，羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09對(duì)金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果，瑞士乳桿菌ZJUIDS11對(duì)單增李斯特菌有較好的抑制效果?？股孛舾行越Y(jié)果表明菌株的安全性較好，羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09對(duì)氯霉素較敏感，瑞士乳桿菌ZJUIDS11對(duì)紅霉素較敏感。

不同來源（牛、水牛）牛乳的理化特性存在顯著差異，不同類型的乳蛋白（乳清蛋白、酪蛋白、脫脂乳）生產(chǎn)的生物活性肽在結(jié)構(gòu)和功能上也有著顯著區(qū)別[39]。本試驗(yàn)將荷斯坦脫脂乳、荷斯坦乳清、水牛脫脂乳和水牛乳清調(diào)整為同一蛋白濃度，經(jīng)過菌株發(fā)酵后對(duì)比ACE抑制率，發(fā)現(xiàn)以脫脂乳作為發(fā)酵底物時(shí)的ACE抑制率比乳清高一倍（P<0.05），這表明乳酸菌酶解酪蛋白時(shí)生產(chǎn)的ACE肽在效果上比乳清蛋白強(qiáng)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)荷斯坦脫脂乳和水牛脫脂乳發(fā)酵后的ACE抑制率無顯著性差異（P＞0.05），原因可能是牛乳蛋白的序列具有很大的同源性。因此，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，荷斯坦脫脂乳更適合作為菌株的發(fā)酵底物。其中的降壓肽的分離及功效評(píng)定仍需進(jìn)一步研究確定。

4 結(jié)論

本研究通過比較蛋白水解度、ACE抑制率、模擬胃腸消化后的ACE抑制率，篩選到2株富產(chǎn)抗消化ACE抑制肽的乳酸菌，分別是羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11，ACE抑制率分別為87.39%±2.44%和90.41%±0.99%，IC50值分別為0.31和0.25 mg/mL。在益生特性方面，兩株菌對(duì)酸和膽鹽都有良好的耐受性，且不具備耐藥性，對(duì)人體健康不存在潛在威脅。經(jīng)過底物篩選比較得，這兩株菌的最佳發(fā)酵底物為荷斯坦脫脂乳。研究結(jié)果表明羅伊氏乳桿菌ZJUIDS09和瑞士乳桿菌ZJUIDS11發(fā)酵乳產(chǎn)ACE抑制肽的能力較好，具有開發(fā)降壓發(fā)酵乳制品的潛力。