李 祥 丘志河 謝衛(wèi)勇 黃 剛 閔水平 王安森

(廣東省深圳市龍崗區(qū)骨科醫(yī)院1 骨科，2 康復(fù)科，深圳市 518116，電子郵箱：xpj764@163.com)

腰椎間盤突出癥(lumbar disc herniation,LDH)由椎間盤髓核或纖維環(huán)移位超過椎間盤間隙引起[1-2]，是坐骨神經(jīng)痛的最常見原因。據(jù)調(diào)查，腰背痛患者的LDH發(fā)生率為15%～45%，全球每年為LDH支付的醫(yī)療費(fèi)用達(dá)2 630萬美元，給社會造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。因此，尋找一種成本低、效益高的治療方法十分重要。舒筋活血湯具有活血化瘀、行氣止痛的功效，可減少炎癥導(dǎo)致的組織粘連，減輕組織損傷，促使淤血消散，有效緩解急性踝關(guān)節(jié)扭傷患者的疼痛[4]。環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX2)是一種在組織損傷部位釋放的誘導(dǎo)型酶，正常生理狀態(tài)下在多數(shù)組織中的表達(dá)量很低，但受到生長因子、細(xì)胞因子等刺激后則會迅速釋放，從而激發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在COX2作用下的代謝產(chǎn)物，因此，PGE2水平通常作為局部COX2活性的評價(jià)指標(biāo)[6]。COX2被認(rèn)為是調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答過程中PGE2產(chǎn)生的關(guān)鍵因素[7]。同時(shí)，PGE2和COX2之間存在一個(gè)正反饋環(huán)，PGE2的積累可能在一定條件下誘導(dǎo)COX2的高表達(dá)[8]。磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)是膜磷脂中催化脂肪酸水解釋放AA的超家族酶，是前列腺素合成的限速酶，也是許多炎癥過程的上游調(diào)節(jié)因子[9]。研究表明，抑制PLA2表達(dá)可改善LDH大鼠的神經(jīng)根疼痛和炎癥反應(yīng)[10]。因此本研究通過建立LDH大鼠模型，探討舒筋活血湯對LDH大鼠癥狀及髓核炎癥的影響，并基于PLA2活性、COX2/PGE2通路探討舒筋活血湯在LDH中的作用機(jī)制，旨在為LDH的臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體級雄性SD大鼠95只，6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，合格證號為SCXK(湘)2009-0004。所有動物均嚴(yán)格按照動物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，保持適宜的溫度和濕度。

1.2 藥品和試劑 舒筋活血湯：丹參、紅花各12 g，羌活、防風(fēng)、荊芥、獨(dú)活、當(dāng)歸各10 g，續(xù)斷、青皮、牛膝、五加皮各6 g，杜仲、枳殼各4 g；煎煮為湯藥，藥材選自本院中藥房的標(biāo)準(zhǔn)中藥材。吲哚美辛膠囊(蘇州第三制藥廠有限責(zé)任公司，25 mg/粒，批號：190509)；兔抗鼠PLA2、COX2、PGE2、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β抗體(英國Abcam公司，貨號：ab211573、ab188183、ab188761、ab215188、ab197447)；羊抗兔IgG(EnVision)二抗(美國CST公司，貨號：7074P2)；TRIzol試劑(美國Invitrogen公司，貨號：15596026)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司，貨號：RR036A)；SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司，貨號：RR820A)；二喹啉甲酸試劑盒(美國賽默飛公司，貨號：A53225)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?，貨號：KL-D3297)；注射用青霉素鈉(哈藥集團(tuán)制藥總廠，批號：A100809310)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 GIS-500凝膠成像儀(上海艾研生物科技有限公司，貨號：1708195)；高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠，型號：LG10-2.4A)；光學(xué)顯微鏡(濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司，貨號：CX43)；電泳儀、電轉(zhuǎn)化儀(北京君意生物科技有限公司，貨號：JY-SCZ2+、ZY5)。PHSJ-5T型pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.4 LDH大鼠模型的構(gòu)建 95只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取15只大鼠作為對照組，正常給予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠用于造模。造模方法：腹腔注射1%戊巴比妥鈉(劑量0.4 mL/100 g)進(jìn)行麻醉，麻醉成功后固定大鼠四肢，用手術(shù)剪剃除大鼠背部體毛，75%酒精消毒大鼠背部，鋪無菌單，用橡皮筋扎緊大鼠尾部，在無菌條件下取出每只大鼠第3、4尾椎間盤的髓核，從而造成尾椎間盤破裂形態(tài)，并將一根無菌“L”形不銹鋼柱(直徑約0.4 mm，長度4 mm)插入椎間孔，對背根神經(jīng)節(jié)造成穩(wěn)定的壓迫，將髓核置于生理鹽水中備用。最后進(jìn)行椎間盤的埋植，使用75%酒精常規(guī)消毒背部，以后背正中L5棘突為中心，作長約2 cm的切口，逐層切開皮膚、肌肉，將髓核植入L5和L6間的神經(jīng)根，隨后逐層縫合，肌肉注射青霉素鈉80萬U，傷口處涂抹紅霉素軟膏[11]。剔除死亡的5只大鼠，共成功造模75只LDH大鼠。

1.5 實(shí)驗(yàn)動物分組及給藥方法 將LDH大鼠隨機(jī)分成5組，包括模型組、吲哚美辛組、低劑量舒筋活血湯組、中劑量舒筋活血湯組、高劑量舒筋活血湯組，每組15只。于造模成功后第1天開始，按7.5 mg/kg的劑量[12]給予吲哚美辛組大鼠灌胃吲哚美辛懸液，1次/d，持續(xù)28 d。舒筋活血湯低中高劑量均按照人體和大鼠體表面積換算公式進(jìn)行計(jì)算[13]：大鼠與成人體表面積的折算系數(shù)為6.3，舒筋活血湯藥材總質(zhì)量為106 g，按體重70 kg成人每日1付為標(biāo)準(zhǔn)，則大鼠每日給藥劑量為9.54 g/kg，因此設(shè)置舒筋活血湯低、中、高劑量為9.54 g/kg、19.08 g/kg、38.16 g/kg，均于造模成功后第1天開始分別早晚灌胃給藥一次，持續(xù)給藥28 d。對照組和模型組給予灌胃3 mL生理鹽水，持續(xù)28 d。末次給藥結(jié)束后，觀察大鼠一般情況。

1.6 PLA2活性檢測 造模后第7、14、28天，每組分別取5只大鼠的移植髓核樣本(對照組同期取相同位置髓核)，60℃水浴30 min，冷卻后置于-80℃冰箱備用。取2只50 mL燒杯分別作為測定管和對照管，對照管加入底物緩沖液8 mL、15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL、髓核樣本0.4 mL；測定管加入底物緩沖液8 mL、0.5 mmol/L CaCl20.2 mL、髓核樣本0.4 mL。37℃水浴后，對照管加入0.5 mmol/L CaCl20.2 mL，測定管加入15 mmol/L乙二胺四乙酸1.1 mL?；靹蚝笥酶哽`敏度pH計(jì)分別測量兩管的pH值，用微量吸槍吸取新標(biāo)定的稀鹽酸(0.004 mol/L)將對照管的pH值滴定至測定管的pH值，記錄消耗的稀鹽酸體積(V)。一個(gè)PLA2活性單位是指37℃下每分鐘每毫升樣本反應(yīng)消耗1 nmol鹽酸，PLA活性(U)=V×ρ×106×2.5/t，V、ρ分別是所消耗鹽酸的體積(mL)和濃度(mol/L)，t為反應(yīng)時(shí)間(min)[11]。

1.7 熒光定量PCR法檢測大鼠神經(jīng)根部組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平 造模結(jié)束28 d后，每組選取剩余的5只大鼠，處死后取L5～L6棘突處神經(jīng)根組織約100 mg，放入研磨器中，加入2 mL磷酸鹽緩沖液，-4℃下1 000 r/min離心10 min取上清。按照TRIzol法提取血清總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×SYBR Mix 10 μL，dH2O 8 μL，上下游引物各0.5 μL，模板1 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。引物由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA的相對表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.8 蛋白免疫印跡法檢測大鼠神經(jīng)根部中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β蛋白相對表達(dá)水平 造模結(jié)束28 d后，每組選取剩余的5只大鼠，取L5～L6棘突處神經(jīng)根組織約100 mg，加入適量冷蛋白裂解液，4℃下12 000 r/min離心20 min后取上清液，采用二喹啉甲酸試劑盒進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。5%脫脂奶封閉2 h，加入PLA2(1 ∶1 000)、COX2(1 ∶1 000)、PGE2(1 ∶1 000)、TNF-α(1 ∶5 000)、IL-1β(1 ∶2 500)單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，5 min/次。加入羊抗兔IgG二抗(1 ∶15 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次(10 min/次)后電化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像儀觀察各組蛋白表達(dá)情況。采用ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行分析，并計(jì)算目的條帶與內(nèi)參β-actin的灰度值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，方差齊時(shí)多組間比較采用方差分析，組間進(jìn)一步比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)多組間比較采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)，Nemenyi法進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠的一般狀態(tài) 對照組大鼠飲食正常，精力充沛，步態(tài)正常；模型組大鼠活動減少，明顯跛行，或伴對側(cè)足趾異常等癥狀；吲哚美辛組大鼠飲食及排泄均正常，活動較多，與對照組相似；舒筋活血湯各劑量組大鼠較模型組癥狀減輕，步態(tài)基本正常，飲食逐漸恢復(fù)，劑量越高狀態(tài)越好。

2.2 各組大鼠髓核組織中PLA2活性的比較 與對照組相比，各時(shí)間點(diǎn)模型組大鼠PLA2活性均增強(qiáng)(均P<0.05)。與模型組相比，各時(shí)間點(diǎn)吲哚美辛組及低、中、高劑量舒筋活血湯組大鼠的PLA2活性均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠的PLA2活性仍較高(P<0.05)，但中、高劑量舒筋活血湯組大鼠PLA2活性水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠髓核組織中PLA2活性的比較(x±s，U)

2.3 各組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，吲哚美辛組及中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平以及中劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，但高劑量舒筋活血湯組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)水平的比較(x±s)

2.4 各組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相對表達(dá)水平的比較 與對照組相比，模型組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)。與模型組相比，吲哚美辛組及中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)。與吲哚美辛組相比，低劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、TNF-α、IL-1β蛋白水平以及中劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織PLA2、COX2、IL-1β蛋白水平均升高(均P<0.05)，但高劑量舒筋活血湯組上述蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表4、圖1。

表4 各組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白相對表達(dá)水平的比較(x±s)

圖1 各組大鼠神經(jīng)根組織中PLA2、COX2、PGE2、TNF-α及IL-1β蛋白的表達(dá)水平

3 討 論

LDH是脊柱外科的常見病和多發(fā)病，是引起下腰痛和腰腿痛的最常見原因。椎間盤由髓核和外纖維環(huán)組成，中央髓核是分泌膠原蛋白的部位，含有大量蛋白多糖，這些蛋白多糖有助于保持髓核水分，產(chǎn)生靜水壓力，從而抵抗脊柱的軸向壓縮[14]。在LDH患者中，由于纖維環(huán)突出甚至破裂，導(dǎo)致髓核擠出，髓核與椎間盤間隙的連續(xù)性完全喪失。另外，已有研究證實(shí)炎性反應(yīng)與LDH神經(jīng)痛密切相關(guān)，椎間盤內(nèi)容物擠出后會誘發(fā)免疫反應(yīng)[15]。當(dāng)髓核組織被擠出硬膜外間隙時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)變化會引發(fā)血管通透性增大、血管擴(kuò)張、免疫細(xì)胞黏附和遷移，導(dǎo)致該部位的炎癥細(xì)胞因子水平升高[15]。

中醫(yī)認(rèn)為，LDH主要由風(fēng)寒濕痹淤血引起。而舒筋活血湯中，羌活可發(fā)汗解表，散風(fēng)寒除濕；荊芥祛風(fēng)，消瘀血；防風(fēng)治療骨節(jié)痹痛；獨(dú)活治頸環(huán)不靈，腿足酸重麻木；牛膝除濕痹痿，強(qiáng)健筋骨；杜仲補(bǔ)肝腎，壯筋骨，治腰痛、足膝無力；當(dāng)歸具有補(bǔ)血活血、生血補(bǔ)心之效；青皮能攻氣滯，平肝止痛；續(xù)斷有助于接骨續(xù)筋，對于肝腎不足引起的腰痛、腳弱具有治療作用；紅花消瘀熱；枳殼行氣止痛，寬中下氣；五加皮祛痛風(fēng)痹。依照中醫(yī)辨證理論，舒筋湯可靈活加減，屈伸疼痛者可加伸筋草[16]。沈駿等[17]應(yīng)用自擬腰痹舒筋湯治療LDH患者取得了良好效果。本研究中LDH大鼠活動減少，明顯跛行，或伴對側(cè)足趾異常等癥狀，經(jīng)舒筋活血湯治療后，癥狀逐漸好轉(zhuǎn)。

PLA2在炎癥性疾病中具有顯著的生物學(xué)效應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示，造模后第7、14、28天，模型組大鼠髓核中的PLA2活性、神經(jīng)根組織中PLA2蛋白和mRNA的表達(dá)均較對照組升高，而各劑量舒筋活血湯組大鼠PLA2活性、中劑量和高劑量舒筋活血湯組神經(jīng)根組織中PLA2蛋白和mRNA的表達(dá)均較模型組降低(均P<0.05)。這提示PLA2在LDH的發(fā)病中發(fā)揮作用，而舒筋活血湯可降低LDH大鼠局部病灶的炎癥水平。

LDH發(fā)病時(shí)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是一種重要的疼痛機(jī)制，有研究顯示，在單核細(xì)胞浸潤之前，已有炎性細(xì)胞因子存在于擠出的髓核組織中[19]。有學(xué)者在對健康牛進(jìn)行椎間盤髓核植入后發(fā)現(xiàn)，腫脹的椎間盤在28 d內(nèi)產(chǎn)生了高水平的IL-6和PGE2，而封閉的椎間盤則沒有高水平的IL-6和PGE2表達(dá)[19]，表明椎間盤組織膨出可引起神經(jīng)根炎癥，這是導(dǎo)致LDH疼痛的關(guān)鍵因素。事實(shí)上，突出的髓核組織中存在多種炎癥因子，單核細(xì)胞浸潤、巨噬細(xì)胞成熟和擠壓組織的再吸收會誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α和PGE2釋放[20]。研究顯示，PLA2是膜磷脂代謝為AA的關(guān)鍵酶，AA又是COX2合成PGE2的主要底物，而PGE2是一種炎癥因子，可以導(dǎo)致神經(jīng)炎癥和疼痛[6，9]。因此，探究COX2、PGE2及其他炎癥因子水平的變化，對揭示LDH的致病機(jī)制具有重要作用。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，中、高劑量舒筋活血湯組大鼠神經(jīng)根組織中COX2、PGE2、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白表達(dá)水平均降低(均P<0.05)，這提示舒筋活血湯可能通過抑制COX2/PGE2通路，降低LDH大鼠體內(nèi)的炎癥水平。

綜上所述，高劑量(38.16 g/kg)的舒筋活血湯可能通過抑制PLA2活性和COX2/PGE2通路的表達(dá)，減輕LDH大鼠髓核內(nèi)炎癥水平，從而緩解LDH的癥狀。但本研究未對髓核組織進(jìn)行免疫組化或病理學(xué)觀察，存在一定的不足，有待后續(xù)深入研究。