楊 慧 李相勇

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○四醫(yī)院血液腫瘤科二區(qū)，江蘇省無錫市 214000，電子郵箱：bhpbnl@163.com)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，多發(fā)于50歲以上人群，且男性患病率略高于女性[1]。但隨著飲食結構變化、工作壓力增加、幽門螺旋桿菌感染、攝入過多食鹽以及遺傳等因素的影響，發(fā)病人群呈年輕化趨勢[2]。胃癌早期患者無明顯癥狀，或出現(xiàn)類似胃慢性疾病癥狀，如噯氣、上腹不適等非特異性癥狀，容易被忽視；隨著疾病的進展可出現(xiàn)上腹痛、體重下降等；晚期則出現(xiàn)消瘦、貧血、厭食等癥狀；在病程終末期時，患者會表現(xiàn)為惡病質等腫瘤并發(fā)癥[3-4]。放療是臨床上治療癌癥的常用手段之一，但是胃癌細胞對放射線不敏感，導致放療的治療效果不理想，因此，如何提升胃癌細胞放射敏感性成為許多學者的研究方向。miRNA是一組在轉錄后水平調控多個基因表達的非編碼小RNA，其表達失調與眾多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關，在胃癌組織中也存在具有癌基因或抑癌基因功能的miRNA[5]。研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA-520a(microRNA-520a,miR-520a)在乳腺癌中表達上調并發(fā)揮抑癌基因功能[6]，但miR-520a在胃癌中的表達情況鮮見研究報告。本研究探究上調miR-520a對胃癌細胞放射增敏性的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌MGC-803細胞株購于上海澳音生物科技有限公司(批號：CBP60485)。RPMI 1640培養(yǎng)基購于艾美捷科技有限公司(批號：67685TT)；Transwell小室購于上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司(型號：AZE189217)；T7RNAi反轉錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司(批號：SV30010)；蛋白緩沖液購于上海振譽生物科技有限公司(批號：AR1112)。Janus激酶3(Janus kinase 3,JAK3)、信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、磷酸化JAK3(phosphorylated JAK3,p-JAK3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3,p-STAT3)抗體購于上?？泼羯锟萍加邢薰?批號：SH3004201、BJ-S963932、YP0756、ARG57812)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：復蘇胃癌MGC-803細胞后用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并放置于含有5% CO2的37℃恒溫箱中，當細胞密度長至80%～90%時，使用胰蛋白酶消化傳代進行后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞轉染：取對數生長期的胃癌MGC-803細胞，制備成濃度為1×105個/mL的細胞懸液，放置于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL細胞懸液。將細胞分為空白組、下調組、上調組， 每組設置2個復孔。當細胞生長至對數生長期時，空白組、下調組、上調組分別加入常規(guī)細胞培養(yǎng)液、p-Genesil(上海研生實業(yè)有限公司)與Lipofectamine 2000試劑(廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司)、p-Genesil-miR-520a(深圳子科生物科技有限公司)與Lipofectamine 2000試劑，2 mL/孔，轉染48 h。

1.2.3 鑒定miR-520a轉染情況：轉染48 h后，收集細胞，采用實時熒光PCR法鑒定miR-520a轉染情況。采用TRIzol法提取細胞的RNA，并檢測其純度和濃度，應用T7RNAi反轉錄試劑盒進行反轉錄反應，合成cDNA。使用Primer 5.0軟件設計引物，引物由上海生工生物技術有限公司合成。miR-520a上游引物為5′-GGGGAAAGTGCTTCCCTTT-3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物為5′-AACAGCCTCAAGATCATCAGCAA-3′，下游引物為5′-GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3′。采用PCR法進行擴增，根據PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]說明書配置反應體系。反應條件設置為95℃變性5 min后，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT算法計算miR-520a相對表達量。實驗重復5次。

1.2.4 檢測細胞增殖、凋亡情況：(1)采用四甲基偶氮唑鹽法檢測細胞增殖率。收集轉染48 h后處于對數生長期的細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后將其制成細胞懸液，按2×103個/孔的濃度將細胞接種于96孔板，每組設3個復孔，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后于每孔加入20 μL四甲基偶氮唑鹽，避光孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μg二甲基亞砜后于搖床上低速震蕩10 min，使用酶標儀(山東萊恩德智能科技有限公司)測定450 nm波長下每孔的吸光度值，細胞增殖率=(細胞組吸光度值/空白孔吸光度值-1)×100%。(2)采用脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)法檢測細胞凋亡情況。收集轉染48 h后處于對數生長期的細胞，用0.125%胰蛋白酶消化后將其制成細胞懸液，使用TUNEL法檢測細胞凋亡。將細胞浸洗、固定、封閉后，滴加顯色液進行標記，復染細胞核出現(xiàn)藍色熒光(陰性細胞)或綠色熒光(陽性細胞)，使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況，細胞凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。實驗重復5次。

1.2.5 檢測細胞遷移、侵襲情況：(1)采用細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力。收集各組轉染48 h后處于對數生長期的細胞，將細胞接種至24孔板，待細胞增長到80%時，使用100 μL的槍頭,垂直劃3條直線，使用磷酸緩沖鹽溶液清洗2～3次后加入含0.5%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，24 h后于倒置顯微鏡下觀察各組細胞的遷移數量。(2)采用Transwell小室檢測細胞侵襲能力。收集每組轉染48 h后處于對數生長期的細胞，使用胰酶消化細胞后，用磷酸緩沖鹽溶液清洗1～2次，采用10 g/L的牛血清白蛋白重懸細胞并將細胞密度調整至1×105個/mL，在Transwell小室中加入150 μL細胞懸液，將細胞懸液放置Transwell小室的上室，下室接種含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后計數進入下室的細胞量，即使用乙醇固定下室細胞5 min，再使用結晶紫溶液染色，用外科尖刀片將細胞擦拭，放在玻片上用中性樹膠片長期保存，倒置顯微鏡下計數并拍照，觀察細胞侵襲狀況，隨機選取3個不同視野計數并取平均值。實驗重復5次。

1.2.6 放射增敏作用評價[7]：各組細胞經轉染48 h后，對各組轉染細胞進行射線照射(srt100放療劑量儀，北京康科達有限公司)，照射培養(yǎng)皿覆蓋有機玻璃板2 cm，源皮距100 cm，劑量率為3.2 Gy/min，總劑量為4.0 Gy。對細胞濃度進行調整之后靜置培養(yǎng)，2周后使用1%固定液固定0.5 h，鏡下計數≥50個細胞。集落形成率(%)=培養(yǎng)皿中的集落數/細胞培養(yǎng)皿中的細胞接種數×100%。細胞存活分數(survival fraction，SF)=某劑量照射后的培養(yǎng)皿內的集落數/(該劑量的接種數×集落形成率)；根據多靶單機模型計算各組平均致死量(D0)、2 Gy劑量下對應的SF值(SF2)和放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)；SER=其他組的D0/空白組D0。實驗重復5次。

1.2.7 檢測JAK3/STAT3信號通路蛋白表達水平：采用蛋白免疫印跡法檢測JAK3/STAT3信號通路蛋白表達量。各組細胞轉染48 h后取生長至對數期的細胞，加入細胞裂解液提取各組細胞蛋白并使用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度，制備電泳液，上樣50 μg蛋白后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜，加入10%脫脂奶粉，25℃條件下封閉1 h，一抗(1 ∶1 000)4℃ 孵育過夜，TBST洗膜3次，5 min/次，二抗(1 ∶4 000)室溫孵育1 h，洗膜3次，5 min/次，將ECL發(fā)光劑中A液和B液按照1 ∶1混合后滴加至聚偏二氟乙烯膜，于暗室曝光后，以β-肌動蛋白為內參蛋白，使用ImageQuantTMLAS 4000顯影儀掃描條帶，用ImageJ軟件分析蛋白條帶光密度。實驗重復5次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組樣本間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組細胞miR-520a轉染情況 轉染48 h后，上調組細胞的miR-520a相對表達量高于空白組，下調組miR-520a相對表達量低于空白組及上調組(均P<0.05)。見表1。

表1 轉染后3組細胞miR-520a相對表達量的比較(x±s)

2.2 3組細胞增殖和凋亡情況 穩(wěn)定轉染24 h、48 h、72 h后，上調組細胞增殖率低于空白組及下調組，下調組細胞增殖率高于空白組；轉染72 h后，上調組及下調組細胞凋亡率均高于空白組，且上調組高于下調組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組細胞增殖和凋亡情況的比較(x±s，%)

2.3 3組細胞遷移和侵襲情況 上調組細胞遷移、侵襲數少于空白組及下調組，但下調組細胞遷移、侵襲數多于空白組(均P<0.05)。見表3、圖1和圖2。

表3 3組細胞遷移和侵襲情況的比較(x±s，個)

圖1 各組細胞遷移能力的情況(×400)

圖2 各組細胞侵襲能力的情況(結晶紫染色，×400)

2.4 各組細胞放射增敏情況 集落形成實驗結果顯示，上調miR-520a水平后胃癌細胞集落數減少，提示其可增加放射增敏作用，見圖3。在放射學參數方面，上調組SF2值、D0值和SER大于空白組及下調組，下調組SF2值、D0值和SER小于空白組(均P<0.05)。見表4。

圖3 各組細胞集落形成情況(吉姆薩染色，×200)

表4 3組細胞放射生物學參數的比較(x±s)

2.5 3組細胞JAK3/STAT3信號通路蛋白表達情況 上調組JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白相對表達量低于空白組及下調組，下調組JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白相對表達量高于空白組(均P<0.05)。見表5、圖4。

表5 3組細胞JAK3/STAT3信號通路蛋白相對表達量的比較(x±s)

圖4 3組細胞JAK3/STAT3信號通路蛋白表達情況

3 討 論

胃癌具有較高的病死率，了解胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制可為臨床制定新的治療方法提供客觀依據[8]。有學者發(fā)現(xiàn)，一些miRNA在胃癌組織中異常表達，其參與調節(jié)胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲過程[9-10]。檢測miRNA在胃癌患者組織、血液、糞便中的表達情況，對胃癌的診斷、療效評估及預后判斷有重要的價值[11]。miR-520a屬于人類miR-520家族，該家族定位于人類19號及X染色體，并參與干細胞胚胎的調控。有研究顯示，miR-520a在食管鱗癌組織中呈過度表達，具有抑癌基因的功能，且miR-520a可通過靶向STAT3等基因，從而在肺癌、肝癌、乳腺癌、血液系統(tǒng)腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤生長、促進凋亡、增加放射敏感等作用[12]。還有研究表明，miR-520a在結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗癌等細胞中特異性表達，且參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13-14]。謝德玲等[14]的研究顯示，miR-520a-3p在卵巢癌細胞中呈低表達，上調miR-520a-3p表達后卵巢癌細胞的增殖、遷移、侵襲能力顯著降低。劉波等[15]研究發(fā)現(xiàn)，下調miR-520b可抑制腎癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結果顯示，上調miR-520a表達后，胃癌MGC-803細胞增殖率降低、凋亡率升高，細胞遷移和侵襲數量減少。這說明上調胃癌MGC-803細胞中miR-520a的表達，能夠有效抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。

大多數腫瘤細胞均存在一定的放射耐受現(xiàn)象，臨床研究顯示，放療后放射野內的腫瘤仍可能會復發(fā)[16]。胃癌的主要病理類型為腺癌，其對放療相對不敏感，但胃周圍鄰近的重要器官等對放射耐受性較低，易造成放射損傷[17]。若單靠加大放射劑量以取得良好的放療效果對機體損傷較大，如何優(yōu)化放射增敏方法，提高胃癌細胞對放射的敏感性是提高放療療效的關鍵。吳越菲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，上調miR-520a可增強胃癌細胞的放療敏感性。禹璽等[19]也發(fā)現(xiàn)，上調miR-520a-3p可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、促進細胞凋亡，增加細胞對紫杉醇敏感性。本研究結果也顯示，上調miR-520a表達后，胃癌MGC-803細胞的集落數減少，放射敏感性參數D0、SF2和SER均升高，說明上調miR-520a表達能夠提高胃癌MGC-803細胞的放射敏感性，具有一定的放射增敏作用。

JAK3/STAT3信號通路是眾多細胞因子信號傳導的共同途徑，JAK3/STAT3的表達變化與細胞增殖、分化、凋亡、炎癥以及免疫調節(jié)等許多重要的生物學過程密切相關。研究顯示，JAK3/STAT3可通過負調節(jié)相關因子影響其他信號通路，JAK3/STAT3信號通路過度活化，可導致靶細胞的生物學功能異?；钴S，進而對機體造成嚴重損傷[20-21]。有研究顯示，參芪扶正注射液可通過抑制STAT3通路進而抑制人胃癌細胞SGC7901增殖[22]。還有研究顯示，STAT3磷酸化后可介導腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，而C-Jun氨基末端激酶3可以使STAT3發(fā)生磷酸化，抑制C-Jun氨基末端激酶3活性后，可以抑制STAT3核轉位和腫瘤形成[22-23]。本研究結果顯示，上調miR-520a后，胃癌MGC-803細胞的JAK3、STAT3、p-JAK3、p-STAT3蛋白表達均下降，說明上調miR-520a可使JAK3/STAT3信號通路激活受到抑制，進而抑制細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡。

綜上所述，上調miR-520a表達水平可以抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲，促進細胞凋亡，并可增強細胞的放射增敏性，其可能通過影響JAK3/STAT3信號通路的表達發(fā)揮作用。