黃 輝，蔣勁松，周明朗，代國勝，冀慶軍，何 苗，柴 偉，孫敬武

1.亳州市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，安徽亳州 236800；2.中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院/安徽省立醫(yī)院，安徽合肥 230032

過敏性鼻炎(AR)是臨床中較為常見的嚴重變態(tài)反應性鼻炎，一般情況下AR多指外界刺激機體后導致機體出現(xiàn)過敏原感應性增高的應激反應，在臨床中主要表現(xiàn)為鼻黏膜病變[1]。有研究指出，AR的臨床發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，且臨床中多表現(xiàn)為鼻塞、鼻炎及連續(xù)性噴嚏[2]。雖然 AR對患者生命無法造成威脅，但由于其根治難度大且反復發(fā)作，嚴重影響患者生活質量[3]。因此，尋找AR患者發(fā)病的影響因素，對其制訂針對性干預措施以降低AR發(fā)病率和改善患者臨床癥狀具有重要意義。有研究表明，多類細胞及因子參與AR的發(fā)展，其中一類細胞的失衡為主要因素，這類細胞有嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞等，由于這類細胞產生的炎性因子，導致呼吸道慢性炎癥發(fā)生[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞分裂周期相關蛋白5(CDCA5)在哮喘患者表達水平增高[5]，但CDCA5表達水平與AR關系鮮見報道。人類白細胞抗原(HLA)是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分，具有高度的多態(tài)性，是免疫遺傳學研究的重要組成部分。早期研究顯示，HLA基因多態(tài)性與AR發(fā)病有一定相關性[6]。細胞白細胞介素-23(IL-23)在Th17細胞的分化中具有重要作用，IL-23-Th17與多種疾病的發(fā)生相關，如關節(jié)炎、鼻竇炎、鼻息肉等[7-10]，但目前關于IL-23水平與AR的研究報道較少。筆者選取AR患者和健康者外周血單個核細胞，進行CDCA5、HLA-DPB1差異表達基因分析及IL-23血清水平差異分析，以期探討外周血CDCA5、HLA-DPB1、IL-23表達水平與AR發(fā)病的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集亳州市人民醫(yī)院耳鼻喉科AR患者52例作為病例組，其中男33例，女19例；年齡22～63歲；鼻炎病程2～10年；伴哮喘13例；有AR家族史15例；工作環(huán)境：室內28例，室外24例。另選取同期36例體檢健康者作為對照組，其中男22例，女14例；年齡20～60歲；工作環(huán)境：室內21例，室外15例。兩組年齡、性別、工作環(huán)境比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：(1)病例組：由亳州市人民醫(yī)院醫(yī)生根據《變應性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)》[11]AR診斷標準確診為AR患者；(2)對照組：無呼吸道相關疾病,無過敏性疾病如鼻竇炎、皮炎等。排除標準：存在糖尿病、肝腎功能不全、免疫缺陷疾病或營養(yǎng)不良。根據《變應性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)》[11]將患者分為輕度組(間斷性鼻癢、打噴嚏3～5個/次)、中度組(鼻癢頻繁但能忍受，打噴嚏>5～10個/次，出現(xiàn)間斷性鼻塞)、重度組(出現(xiàn)蟻行感鼻癢，打噴嚏>10個/次，鼻子堵塞嚴重)。

1.2方法

1.2.1外周血淋巴細胞分離 取2 mL外周血，新鮮肝素抗凝血加入等體積磷酸鹽緩沖液混勻后，滴加細胞分離液，使用離心機2 000 r/min，離心20 min。管內層次分明，第2層為淋巴細胞層，取出第2層加入生理鹽水混勻后，離心20 min，得到淋巴細胞。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)檢測CDCA5 mRNA相對表達水平 提取細胞總RNA并進行反轉錄為cDNA，按照試劑盒操作說明進行，所需引物序列為：CDCA5上游引物5′-CTC CAA ACT CAC CGA GGT CC-3′，CDCA5下游引物5′-GCA GCT TCA AAC TCG GCA TT-3；GAPDH上游引物5′-CCT GCA CCA CCA ACT GCT TA-3′，GAPDH下游引物5′-AGT GAT GGC ATG GAC TGT GG-3′。每個樣本3個復孔，并繪制溶解曲線，計算ΔCT值。

1.2.3HLA-DPB1基因分型 取血液2 mL，用試劑盒提取樣品基因組DNA。PCR-SBT為主的分型方法對HLA-DPB1基因進行DNA序列測定和等位基因分型。DPBl序列特異性引物是參考文獻[12]的方法設計合成的。

1.2.4血清IL-23及IgE檢測 通過雙抗體夾心-酶聯(lián)免疫吸附試驗對血清IL-23水平進行測定。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IgE水平，根據操作說明進行檢測。

2 結 果

2.1兩組CDCA5 mRNA相對表達水平比較 對照組CDCA5 mRNA相對表達水平為1.25±0.12，病例組為1.62±0.16，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.49，P<0.05)，見圖1。進一步以CDCA5 mRNA相對表達水平的中位數(shù)為界值，分析CDCA5 mRNA相對表達水平高低不同者患AR的概率，結果顯示，CDCA5高表達組患AR的比例為95.4%，明顯高于CDCA5低表達組(5.89%)(P<0.05)。

圖1 兩組CDCA5相對表達水平比較

2.2兩組HLA-DPB1基因分型比較 檢測020102、0202、040101、0501、0502、0602、0901、13010902 8種HLA-DPB1等位基因，檢測結果符合Hadry-Weinberg平衡。HLA-DPB1*0502和HLA-DPBI*040101在病例組和對照組中頻率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.63，P<0.05)，見表1。經Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，HLA-DPBI*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的風險。

表1 HLA-DPB1等位基因分布比較[n(%)]

2.3兩組血清IL-23和IgE水平比較 與對照組比較，病例組IL-23、IgE水平升高(P<0.05)。見表2。AR患者血清IL-23水平和血清總IgE水平呈正相關(r=0.479，P<0．001)，見圖2。

表2 兩組血清IL-23和IgE水平比較

圖2 IL-23與IgE相關性散點圖

2.4不同程度AR患者CDCA5 mRNA相對表達水平及IL-23、IgE水平比較 重度組CDCA5 mRNA相對表達水平、IL-23及IgE水平高于中度組和輕度組，中度組CDCA5 mRNA相對表達水平、IL-23及IgE水平高于輕度組(P<0.05)。見表3。

表3 不同程度AR患者CDCA5 mRNA相對表達水平、IL-23及IgE水平比較

3 討 論

AR是一種炎癥疾病，它是由IgE介導的鼻黏膜病變。有研究發(fā)現(xiàn)，AR患者機體炎性反應水平升高[13]。AR臨床癥狀以閉塞、連續(xù)性噴嚏和鼻癢為主，病情嚴重時會累及周圍組織器官，對患者造成嚴重不良影響[14]。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)，某些基因的不同等位基因與AR發(fā)展相關聯(lián)，但由于AR發(fā)病受家族遺傳及環(huán)境等諸多因素影響[15]，研究者還不能得出普遍性結論。因此，本研究探討CDCA5、HLA-DPB1差異表達及IL-23血清水平差異與AR發(fā)病的相關性十分有意義。

CDCA5屬于細胞分裂周期相關家族蛋白的一員。CDCA5是細胞分裂周期中染色單體分離與結合所必需的一種調節(jié)因子。CDCA5保證了細胞減數(shù)分裂與有絲分裂中染色體有序分離，在DNA修復中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5與乳腺癌、胃癌等腫瘤發(fā)生及疾病預后相關[16-17]。有研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5與哮喘有關，在哮喘患者中CDCA5表達水平明顯升高[5],而AR與哮喘兩類疾病在發(fā)病機制病理改變中有很大程度相似。在AR發(fā)病過程中存在廣泛的淋巴細胞增殖和分化，但CDCA5在調節(jié)AR炎性反應中發(fā)揮的作用需進一步研究分析。筆者發(fā)現(xiàn)，與體檢健康者比較，AR患者的外周血淋巴細胞中CDCA5 mRNA相對表達水平升高，說明CDCA5表達水平可能與AR發(fā)生相關。筆者進一步比較CDCA5 mRNA相對表達水平與AR發(fā)生的概率發(fā)現(xiàn)，CDCA5 mRNA高表達者患AR的比例明顯高于CDCA5 mRNA低表達者。以上結果說明CDCA5可能與AR的發(fā)生密切相關，相關分子調控機制還需進一步研究。

近年來有研究者發(fā)現(xiàn)，HLA基因在免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用，其與哮喘、過敏性皮炎都存在一定關系[6]。也有研究報道顯示，HLA基因與鼻息肉發(fā)病的相關性，發(fā)現(xiàn)HLA基因是鼻息肉發(fā)病的易感基因與保護基因[18]，但目前關于HLA基因與AR的研究較少。有學者研究韓國人HLA-DPB1與哮喘可能相關，HLA-DPB1*0301是哮喘伴阿司匹林耐受不良的一項易感標志物[19]。本研究結果顯示，病例組與對照組檢測出8種等位基因，頻率最高的等位基因為HLA-DPB1*0501，在病例組和對照組中的頻率分別為34.6%和55.6%。孫筱放等[20]進行了HLA-DPB1基因DNA分型的檢測，檢測出12種等位基因，其中頻率最高等位基因為HLA-DPB1*0501(基因頻率37.4%)。最高頻率基因型與本研究一致，本研究只檢測出8種基因型，推測是由于此次選取的樣本太小及其余等位基因在人群中占比較低。筆者比較病例組與對照組各等位基因頻率，共發(fā)現(xiàn)有HLA-DPB1*0502與HLA-DPB1*040101，在組間差異明顯，經過Logistic回歸分析有HLA-DPB1*040101基因(OR=0.48，95%CI=0.300～1.555)、HLA-DPB1*0502基因(OR=0.57，95%CI=0.040～0.934)提升了患AR的風險。

部分研究者根據“IgE依賴性機制學說”，認為IgE與AR患病相關，IgE通過肥大細胞脫顆粒分泌出多種炎性介質，引發(fā)鼻黏膜炎癥[7]。IL-23是IL-12細胞因子家族的成員，它除了具有與IL-12相同的p40亞基外，還具有一個IL-12沒有的p19亞基[8]。IL-23主要產生于活化的巨噬細胞，其參與T淋巴細胞、抗原提呈細胞分泌免疫因子，對免疫相關功能起調節(jié)作用，與人體諸多自身免疫疾病有關聯(lián)[9-10]。有研究表明，大鼠敲除IL-23基因后，機體免疫受損，機體內抗原提呈刺激T淋巴細胞分泌炎癥因子的能力下降明顯[21]。本研究結果表示，AR患者IL-23水平升高，且IL-23與IgE呈正相關，這表明IL-23可能是觸發(fā)IgE介導Ⅰ型過敏反應產生的調節(jié)因子。提示IL-23與AR發(fā)病密切相關，具體機制有待后續(xù)研究。本研究結果顯示，AR重度患者CDCA5 mRNA相對表達水平、IL-23、IgE水平高于AR輕、中度患者。猜測IL-23可能通過調節(jié)JAK/STAT3信號途徑，抑制相關凋亡因子表達，引起嗜酸性粒細胞的聚集浸潤，從而參與AR的發(fā)展。IL-23作用于嗜酸性粒細胞促進其凋亡，當IL-23水平降低時嗜酸性粒細胞凋亡延遲從而導致AR病情加重。這也表明了CDCA5、IL-23與AR疾病的發(fā)展有關，這可能成為判斷AR疾病走向的預測性指標，若要運用于臨床，后續(xù)還需補充大量試驗證明。

綜上所述，CDCA5、HLA-DPB1基因及血清IL-23水平可能在AR的發(fā)生與發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用，相關分子調控機制還需進一步研究。CDCA5、HLA-DPB1、IL-23可能作為評價AR疾病進展的預測分子，并作為治療和預防AR的潛在分子靶標。