涂 鵬，史大偉，宛瑞杰，田秀君，竇海偉，袁 青，陳小華，辛德莉

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院/北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所/熱帶病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

流行性感冒(以下稱流感)是流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，傳染性強(qiáng)，人群普遍易感，部分患者可出現(xiàn)肺炎等并發(fā)癥或基礎(chǔ)疾病加重發(fā)展成重癥病例，甚至可能導(dǎo)致死亡。流感樣病例(ILI)指發(fā)熱(體溫≥38 ℃)伴咳嗽或咽痛之一的患者[1]。目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)ILI主要檢測(cè)甲型/乙型流感病毒(InfA-InfB)[2-3]，感染人流感病毒主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系[4]。有研究者對(duì)流感季節(jié)的ILI進(jìn)行多重聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)近60%的ILI是由非流感病原體引起，ILI并非全部由流感病毒感染所致[5]。本研究對(duì)2019年12月至2020年2月北方部分地區(qū)的189份ILI咽拭子標(biāo)本進(jìn)行13種呼吸道病原體檢測(cè)，探究成人ILI中13種病原體分布情況及多重PCR毛細(xì)電泳片段分析法在病原體檢測(cè)中的應(yīng)用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年12月至2020年2月南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院、漯河市中醫(yī)院、北京中日友好醫(yī)院、開(kāi)封市中醫(yī)院、黑龍江省紅十字醫(yī)院(哈爾濱)、秦皇島市第二醫(yī)院、濰坊市第二人民醫(yī)院治療成人ILI的咽拭子標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：以《全國(guó)流感監(jiān)測(cè)方案(2017年版)》[1]ILI為標(biāo)準(zhǔn)，即發(fā)熱(體溫≥38 ℃)，伴咳嗽或咽痛之一者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)病程>72 h；(2)有明確細(xì)菌感染或明確診斷為其他疾病；(3)新型冠狀病毒陽(yáng)性。本研究共收集到189例患者非重復(fù)性ILI咽拭子標(biāo)本189份，其中男73例，女116例；年齡16～60歲；南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院48例，漯河市中醫(yī)院19例，中日友好醫(yī)院7例，開(kāi)封市中醫(yī)院57例，黑龍江省紅十字醫(yī)院(哈爾濱)46例，秦皇島市第二醫(yī)院5例，濰坊市第二人民醫(yī)院7例。本研究經(jīng)本院倫理會(huì)批準(zhǔn)(批件號(hào)：2021-P2-113-01)。

1.2方法

1.2.1咽拭子標(biāo)本采集 采集咽拭子標(biāo)本采用尼龍材質(zhì)植絨拭子，所有入組病例采集咽拭子后放入咽拭子管中，置于-80 ℃或-20 ℃冰箱中冷凍保存,標(biāo)本統(tǒng)一經(jīng)冷鏈運(yùn)輸?shù)街行膶?shí)驗(yàn)室，集中進(jìn)行流感病毒核酸檢測(cè)。

1.2.2核酸提取 采用核酸提取或純化試劑BD-Micro型試劑盒(寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20190212)。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.2.313種呼吸道病原體多重檢測(cè) 13種呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒購(gòu)自寧波海爾施基因科技有限公司(批號(hào)210118005)。病原體包括InfA、人腺病毒(HADV)、博卡病毒(Boca)、人鼻病毒(HRV)、甲型流感病毒HINI(2009)(InfA-H1N1)、季節(jié)性流感病毒(InfA-H3N2)、副流感病毒(HPIV)、人偏肺病毒(HMPV)、InfB、肺炎支原體(MP)、肺炎衣原體(CP)、冠狀病毒(HCOV)、人呼吸道合胞病毒(RSV)。

1.3多重PCR毛細(xì)電泳片段分析

1.3.1多重RT-PCR擴(kuò)增與PCR產(chǎn)物毛細(xì)電泳片段分離 應(yīng)用13種呼吸道病原體多重檢測(cè)試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司,批號(hào)210118005)。具體操作按照試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行。

1.3.2結(jié)果判定 檢測(cè)數(shù)據(jù)由ABI公司的“Genemapper software”軟件進(jìn)行分析，各病原體對(duì)應(yīng)擴(kuò)增片段信息如下：InfA 102.5 nt、HADV 112.7/114.7 nt、Boca 121.1 nt、HRV 129.5 nt、InfA-H1N1 158.6 nt、HPIV 179.1 nt、CP 188.2 nt、HMPV 199.9 nt、InfB 207.0 nt、MP 212.3 nt、InfA-H3N2 241.0 nt、HCOV 261.7 nt、RSV 276.7 nt，nt是“Nucleotide”的縮寫。待測(cè)樣品有人RNA、DNA特征峰且峰高度高于該毛細(xì)管中標(biāo)準(zhǔn)品高峰的說(shuō)明標(biāo)本核酸未明顯降解且核酸提取成功，反之則說(shuō)明取樣失敗、核酸嚴(yán)重降解或核酸提取失敗。IC作為內(nèi)置PCR內(nèi)參監(jiān)控整個(gè)操作流程,若其他特征峰明顯，由于競(jìng)爭(zhēng)擴(kuò)增原因IC峰可能降低甚至消失,滿足以上條件后再對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果峰型圖進(jìn)行判讀,比對(duì)各個(gè)毛細(xì)管泳道目的位點(diǎn)峰與該道標(biāo)準(zhǔn)品的高峰和低峰來(lái)判定陰陽(yáng)性[6]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.113種呼吸道病原體分布情況 189份ILI咽拭子標(biāo)本中有180份(95.24%)檢測(cè)出病原體，9份未檢測(cè)出病原體。單一病原體150份(83.33%)，多種病原體30份(16.67%)；未見(jiàn)Boca、HPIV、CP、RSV。180份病原體陽(yáng)性標(biāo)本中有145份(80.56%)檢測(cè)出流感病原體，35份(19.44%)檢測(cè)出非流感病原體。145份流感病原體陽(yáng)性標(biāo)本中120份(82.76%)檢測(cè)出單一流感病原體，25份(17.24%)同時(shí)檢測(cè)出流感病原體與非流感病原體。35份非流感病原體陽(yáng)性標(biāo)本中30份(85.71%)檢測(cè)出單一的非流感病原體，5份(14.29%)檢測(cè)出多種非流感病原體。見(jiàn)表1。

表1 ILI咽拭子標(biāo)本中13種呼吸道病原體分布情況[n(%)]

2.2不同年齡段病原體分布情況 不同年齡段僅InfA-H3N2陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，>25～45歲InfA-H3N2陽(yáng)性率低于其他組(P<0.05)。不同年齡段標(biāo)本病原體陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同年齡段ILI病原體分布情況[n(%)]

年齡(歲)nMP陽(yáng)性HCOV陽(yáng)性HMPV陽(yáng)性HADV陽(yáng)性單一病原體感染混合感染>15～25619(14.75)0(0.00)0(0.00)0(0.00)53(86.89)6(9.84)>25～457710(12.99)2(2.60)0(0.00)1(1.30)57(74.03)15(19.48)>45～60425(11.90)0(0.00)1(2.38)0(0.00)32(76.19)8(19.05)>6092(22.22)0(0.00)0(0.00)0(0.00)8(88.89)1(11.11)χ21.101---4.0372.873P0.816---0.2380.403

2.3不同地區(qū)病原體分布情況 不同地區(qū)標(biāo)本病原體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同地區(qū)標(biāo)本流感、InfA-H3N2、MP陽(yáng)性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。北京、南陽(yáng)、開(kāi)封、哈爾濱地區(qū)流感陽(yáng)性率高于其他地區(qū)(P<0.05)；北京、南陽(yáng)、開(kāi)封地區(qū)InfA-H3N2陽(yáng)性率高于其他地區(qū)(P<0.05)，但3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；秦皇島、濰坊地區(qū)MP陽(yáng)性率高于其他地區(qū)(P<0.05)，但兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同地區(qū)ILI病原體分布情況[n(%)]

續(xù)表3 不同地區(qū)ILI病原體分布情況[n(%)]

3 討 論

流感是一種常見(jiàn)呼吸道傳染性疾病，甲型和乙型流感每年呈現(xiàn)季節(jié)性流行特點(diǎn)，其中甲型流感可引起全球大流行。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，流感每年能導(dǎo)致29萬(wàn)～64萬(wàn)人死亡，高于世界衛(wèi)生組織之前預(yù)測(cè)的25萬(wàn)～50萬(wàn)人[7]，給全球衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。《中國(guó)成人流行性感冒診療規(guī)范急診專家共識(shí)》[8]指出，快速鑒定流感病毒亞型對(duì)及時(shí)救治感染病例及制定有效的流感疫情防控措施有至關(guān)重要的作用。既往研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)甲型流感的年度周期性隨緯度增加而增強(qiáng)，且呈多樣化的空間模式和季節(jié)性特征，在北緯≥33°的北方地區(qū)呈冬季流行模式，每年1-2月為單一年度高峰；在北緯<27°的南方地區(qū)，每年4-6月為單一年度高峰；二者之間的中緯度地區(qū)每年1-2月和6-8月為雙周期高峰；而乙型流感在我國(guó)大部分地區(qū)的寒冷季節(jié)單發(fā)[9]。

本研究對(duì)北方地區(qū)189份成人ILI咽拭子標(biāo)本的病原體學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，145份流感陽(yáng)性標(biāo)本中有111份為InfA-H3N2、23份InfA、7份InfA-H1NI、4份InfB，以InfA-H3N2為主，與馬春娜等[10]、李靜等[11]、陳斌等[12]、舒暢等[13]及國(guó)家流感中心發(fā)布的流感監(jiān)測(cè)周報(bào)[14]報(bào)道北方地區(qū)流感季流感病毒流行株流行情況相同。本研究結(jié)果顯示，不同地區(qū)標(biāo)本流感、MP、InfA-H3N2陽(yáng)性率存在差異性，可能與不同地方流感進(jìn)入流感季的時(shí)間不同及不同地區(qū)流感優(yōu)勢(shì)株的占比不同有關(guān)。不同年齡段InfA-H3N2陽(yáng)性率存在差異性，>25～45歲InfA-H3N2陽(yáng)性率低于其他年齡組?？赡茉撃挲g段人群機(jī)體狀態(tài)優(yōu)于其他組，不同地區(qū)標(biāo)本InfA-H3N2檢測(cè)陽(yáng)性率存在差異性可能與樣本量有關(guān)。

本研究對(duì)流感病原體進(jìn)行檢測(cè)的同時(shí)也對(duì)引起常見(jiàn)呼吸道感染的非流感病原體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，145份流感陽(yáng)性標(biāo)本中有23份混合MP感染，2份混合HRV感染，35份檢測(cè)出非流感病原標(biāo)本中有MP26份、HCOV2份、HADV1份、HMPV1份、MP合并HRV3份、MP合并HCOV2份。提示引起ILI的病原體中非流感病原體并不在少數(shù),也可見(jiàn)混合感染的存在。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)ILI病原體主要進(jìn)行InfA/InfB的病原體監(jiān)測(cè)，很少涉及非流感病原體的檢測(cè)[2-3]。張揚(yáng)等[15]、翁堅(jiān)等[16]對(duì)ILI病毒病原體譜特征分析發(fā)現(xiàn)，引起ILI的病毒并非只有流感病毒，也有HRV、HMPV、HPIV、 HADV等其他常見(jiàn)呼吸道病毒，但均未發(fā)現(xiàn)MP、CP。本研究發(fā)現(xiàn)，成人ILI病原體中MP的陽(yáng)性率并不低。史大偉等[17]使用相同的檢測(cè)方法對(duì)北京地區(qū)兒童冬季ILI病毒病原體分析發(fā)現(xiàn)，引起ILI的有RSV、HMPV、HRV、HADV、HCOV、MP等非流感病原體，但針對(duì)成人ILI的13種病原體檢測(cè)研究鮮見(jiàn)報(bào)道?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案(試行第8版)》[18]中指出新型冠狀病毒肺炎主要與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒等其他已知病毒性肺炎及肺炎支原體感染鑒別，尤其是對(duì)疑似病例要盡可能采取包括快速抗原檢測(cè)和多重核酸檢測(cè)等方法，對(duì)常見(jiàn)呼吸道病原體進(jìn)行檢測(cè)。本研究使用多重PCR毛細(xì)電泳片段分析法能同時(shí)檢測(cè)流感病毒、HADV、RSV、MP等13種病原體，能滿足當(dāng)前疫情防控檢測(cè)需要；與傳統(tǒng)的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)相比，多重PCR毛細(xì)電泳片段分析法能同時(shí)對(duì)流感病毒亞型和非流感病原體進(jìn)行鑒定，縮短了病原體檢測(cè)時(shí)間，并且靈敏度與特異度更高，有助于有效控制抗菌藥物的使用及流感疫情發(fā)展[19-20]。但由于本研究部分地區(qū)病例較少,研究時(shí)間主要集中在流感季節(jié)，結(jié)果存在一定局限性,接下來(lái)應(yīng)擴(kuò)大樣本量并對(duì)全年標(biāo)本進(jìn)行收集，以期更好地評(píng)估ILI中病原體分布情況。

綜上所述，2019年12月至2020年2月冬季我國(guó)北方地區(qū)的成人流感病毒主要以InfA-H3N2為主；非流感病毒也可引起ILI，以MP感染較多見(jiàn)，也可見(jiàn)HCOV、HADV、HMPV感染；部分ILI可有混合感染，以InfA-H3N2合并MP感染為主。多重PCR毛細(xì)電泳片段分析不僅能縮短不同病原體檢測(cè)時(shí)間，還能滿足當(dāng)下疫情防控檢測(cè)的需要，更能為臨床ILI病原體診斷提供科學(xué)性證據(jù)，減少臨床抗菌藥物的濫用情況，降低抗菌藥物耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。