朱嬌玉，姚 樂，趙 浩，江艷芬

心力衰竭主要是由于心臟組織結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，導(dǎo)致心臟的射血能力或心室充盈能力降低而引起的心血管臨床綜合征[1]。隨著我國老齡化越來越嚴(yán)重，心力衰竭已經(jīng)成為威脅人類生命健康的重要原因。研究顯示，心肌能量代謝異常、血流動(dòng)力學(xué)改變能夠誘導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生，這被認(rèn)為是心力衰竭發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。正常狀態(tài)下的心肌細(xì)胞能量代謝十分旺盛，而在心力衰竭病人體內(nèi)，常常存在心肌線粒體功能改變，導(dǎo)致能量代謝異常[3]。靈芝屬于多孔菌科植物紫芝和赤芝干燥的子實(shí)體，有較多生物學(xué)活性，對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)、氧化系統(tǒng)等均有治療功效[4]。靈芝多糖作為靈芝的活性成分，具有抗腫瘤、降血壓、調(diào)節(jié)免疫力、保護(hù)肝臟等作用[5]。以往研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖對(duì)心肌損傷也有治療作用，其可以保護(hù)缺血引起的心肌損傷[6]。靈芝多糖對(duì)高血糖引起的心肌纖維化有抑制功效，對(duì)心臟有保護(hù)作用[7]。研究表明，靈芝多糖發(fā)揮生物學(xué)作用與信號(hào)通路有關(guān)[8]。靈芝多糖能夠通過降低p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)通路的激活水平改善急性肺損傷[9]。p38MAPK是一個(gè)多功能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在很多生理和病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。p38MAPK在心力衰竭中高表達(dá)，并且下調(diào)p38MAPK信號(hào)通路抑制心肌損傷[11]。本研究探討靈芝多糖對(duì)心力衰竭心肌能量代謝和纖維化的影響，以期為靈芝多糖治療心力衰竭提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 靈芝多糖購自西安明澤生物科技有限公司；線粒體分離試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；p38抗體、p-p38抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)抗體購自南京歐凱生物科技有限公司；RM6420生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)購自成都儀器廠；Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司。SD大鼠(體重180～220 g)購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 模型構(gòu)建和分組 根據(jù)文獻(xiàn)[2]構(gòu)建心力衰竭大鼠模型。腹腔注射氯胺酮(50 mg/kg)及地西泮(5 mg/kg)將大鼠麻醉，然后將大鼠仰臥固定至手術(shù)臺(tái)上，剪去腹部的毛，消毒后，在腹部的正中間位置將皮膚切開，沿著腹部的白線將肌肉層切開，以生理鹽水浸泡后的紗布蓋住創(chuàng)面，將膈肌下的腎動(dòng)脈分支分離，以棉線穿到腹主動(dòng)脈下面區(qū)域，取直徑為1 mm的軟管放在腹主動(dòng)脈上，然后用棉線把導(dǎo)管和腹主動(dòng)脈結(jié)扎，將血流完全阻斷，抽出導(dǎo)管，導(dǎo)管直徑就是結(jié)扎以后的腹主動(dòng)脈內(nèi)徑?？p合創(chuàng)面，消毒，肌肉注射青霉素，觀察動(dòng)物清醒以后送回動(dòng)物房繼續(xù)飼養(yǎng)。將建模成功的心力衰竭大鼠模型分成模型組、靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組。曲美他嗪組大鼠按5.4 mg/kg曲美他嗪灌胃，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組大鼠按3.0 g/kg、6.0 g/kg靈芝多糖灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃8周。設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組不結(jié)扎，其余同模型組。對(duì)照組、模型組用等劑量生理鹽水灌胃。將造模過程中死亡的大鼠剔除，最后各組均剩余9只大鼠。記錄對(duì)照組、模型組、靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心率。取檢測心率后的大鼠，測定心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，然后取心臟組織，最后將心肌組織分成3部分。

1.3 心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測 用30 mg/kg的2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定大鼠，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，以絲線將距離心臟遠(yuǎn)端結(jié)扎，然后用動(dòng)脈夾把靠近心臟的位置夾住，從右頸總動(dòng)脈將含有0.05%肝素的生理鹽水導(dǎo)管插入左心室。記錄大鼠左室壓力上升最大速率(-dp/dtmax)、左室壓力下降最大速率(-dp/dtmax)、左室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)。

1.4 心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶檢測 取大鼠心肌組織，分離線粒體，分離步驟完全按照線粒體分離試劑盒進(jìn)行，檢測線粒體蛋白濃度，然后根據(jù)試劑盒操作說明分析ATP酶活性(每毫克每1 h組織蛋白內(nèi)的ATP酶將ATP分解生成1 μmol無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活力單位)。

1.5 右室、左室質(zhì)量指數(shù)檢測 取大鼠心臟和左心室、右心室，用電子天平稱量重量，然后計(jì)算右室質(zhì)量指數(shù)(右心室重量/全心重量)、左室質(zhì)量指數(shù)(左心室重量/全心重量)。

1.6 膠原容積分?jǐn)?shù)檢測 將大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定，按常規(guī)方法制作病理切片，然后進(jìn)行Masson染色，以IPP6.0系統(tǒng)檢測膠原容積分?jǐn)?shù)。

1.7 TGF-β1、p38、p-p38蛋白檢測 蛋白免疫印跡(Western Blot)法檢測蛋白表達(dá)，收集心肌組織，按照每0.1 g的組織中添加5倍體積的裂解溶液，在4 ℃中過夜。4 ℃，1 000 g離心5 min，吸取上清溶液即為電泳蛋白樣品。在蛋白樣品中加入等量體積的2×SDS上樣緩沖液，放在沸水浴中結(jié)合10 min。再將蛋白放在冰水混合物上備用。根據(jù)10%分離膠和5%濃縮膠常規(guī)配方制備SDS-PAGE凝膠，然后在每個(gè)孔內(nèi)加入40 μg的蛋白樣品，首先將電泳儀的電壓調(diào)整到60 V，觀察溴酚藍(lán)已經(jīng)進(jìn)入到分離膠以后，將電壓調(diào)整到120 V繼續(xù)電泳，等到溴酚藍(lán)染料進(jìn)入分離膠的底部邊緣以后，將凝膠拆下。再將凝膠放在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡。在冰浴條件下以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜100 min。取出硝酸纖維素(NC)膜，然后放在5%牛血清白蛋白溶液中，在室溫條件結(jié)合1 h。NC膜置于1∶1 000稀釋之后的一抗溶液(抗體以封閉液稀釋)中，放在4 ℃條件下結(jié)合過夜。NC膜再置于1∶2 000稀釋以后的二抗溶液(用封閉液稀釋)中，在室溫中結(jié)合1 h。滴加ECL顯色試劑。Image J分析目的條帶TGF-β1、p38、p-p38的灰度值以及內(nèi)參條帶甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的灰度值，以目的條帶灰度值÷內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心率比較 模型組大鼠心率明顯高于對(duì)照組，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心率明顯低于模型組，且靈芝多糖-2組大鼠心率低于靈芝多糖-1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠心率比較(±s) 單位：次/min

2.2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠LVSP、LVEDP水平較高，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠LVSP、LVEDP水平較低，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組LVSP、LVEDP水平較低，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(±s)

2.3 各組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶水平比較(±s)

2.4 各組大鼠右室、左室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)和TGF-β1蛋白水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠右室質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)和TGF-β1蛋白水平均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠右室質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)和TGF-β1蛋白水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組大鼠右室質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)和TGF-β1蛋白水平均較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1、表4。

圖1 Western Blot檢測大鼠心肌組織中TGF-β1蛋白表達(dá)條帶圖

表4 各組大鼠右室質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)、膠原容積分?jǐn)?shù)和TGF-β1蛋白水平比較(±s)

2.5 各組大鼠心肌組織中p38MAPK信號(hào)激活程度比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠p-p38蛋白水平較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，靈芝多糖-1組、靈芝多糖-2組、曲美他嗪組大鼠p-p38蛋白水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與靈芝多糖-1組比較，靈芝多糖-2組大鼠p-p38蛋白水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖2、表5。

圖2 Western Blot檢測大鼠心肌組織中p38、p-p38蛋白表達(dá)條帶圖

表5 各組大鼠心肌組織中p38、p-p38蛋白水平比較(±s)

3 討 論

靈芝內(nèi)含有多種活性成分，具有降血脂、調(diào)節(jié)血壓、增加免疫力等藥理學(xué)作用。靈芝多糖是從靈芝內(nèi)提取的多糖混合物，在很多疾病進(jìn)展中發(fā)揮保護(hù)作用，例如：靈芝多糖可以通過抑制腫瘤細(xì)胞的生長發(fā)揮抗腫瘤作用；通過刺激單核巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子調(diào)控機(jī)體免疫功能；通過降低肝臟中的脂肪顆粒改善脂肪肝進(jìn)程[12]。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明，靈芝多糖對(duì)心血管系統(tǒng)疾病也有改善作用，經(jīng)其治療后的缺血再灌注大鼠心臟功能得到改善[13]。靈芝多糖還可以抑制心肌纖維化，降低糖尿病心肌病心肌纖維化相關(guān)因子的表達(dá)[7]。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖干預(yù)后的心力衰竭大鼠心率明顯降低，LVSP、LVEDP水平下降，+dp/dtmax、-dp/dtmax水平升高，并且大鼠右室質(zhì)量指數(shù)、左室質(zhì)量指數(shù)均下降，說明靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心臟功能。

研究顯示，心力衰竭病人出現(xiàn)心肌能量代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)改變，誘導(dǎo)心肌纖維化[14]。線粒體是人體內(nèi)的能量代謝場所，正常狀態(tài)下的線粒體內(nèi)的能量代謝極為旺盛，為細(xì)胞功能發(fā)揮提供動(dòng)力[15]。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶能夠調(diào)控細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外Na+和Ca2+平衡，二者均是重要的蛋白酶[16]。Na+和Ca2+平衡是心房肌、心室肌以及蒲肯耶纖維動(dòng)作電位的動(dòng)力，也是調(diào)控細(xì)胞中鈣離子穩(wěn)定的關(guān)鍵，而心肌細(xì)胞中Ca2+水平對(duì)于心肌正常功能的維持有十分重要的作用，當(dāng)Na+-K+-ATP酶的活性降低后，細(xì)胞內(nèi)的Na+水平增加，K+水平降低，Na+和Ca2+交換，導(dǎo)致細(xì)胞中的Ca2+水平增加，減弱心肌的收縮功能[17]。Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的變化是細(xì)胞能量代謝變化的標(biāo)志[18]。心肌纖維化是心力衰竭誘導(dǎo)的必然病理結(jié)果，心臟膠原含量升高是心肌纖維化的標(biāo)志[19]。TGF-β1是心肌纖維化的標(biāo)志因子，其表達(dá)升高后標(biāo)志著纖維化程度升高[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靈芝多糖處理后的心力衰竭大鼠心肌組織中心肌線粒體蛋白濃度和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、心肌膠原含量和TGF-β1蛋白表達(dá)水平均降低，提示靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心肌能量代謝和心肌纖維化進(jìn)程。

信號(hào)通路是存在于人體內(nèi)的重要樞紐，在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生等過程中均發(fā)揮作用[21]。p38MAPK信號(hào)通路是MAPK信號(hào)通路的關(guān)鍵分支，而p38是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，其只有被磷酸化以后才能夠發(fā)揮作用[22]。p38MAPK信號(hào)通路與心力衰竭有關(guān)，其被過度激活后誘導(dǎo)心肌損傷，而下調(diào)p38MAPK信號(hào)通路的激活水平能夠改善心功能[23]。研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖能夠降低p38磷酸化水平從而改善小鼠急性肺損傷[9]。本研究結(jié)果顯示，靈芝多糖能夠降低心力衰竭大鼠心肌組織中p-p38表達(dá)水平，表明靈芝多糖可能通過抑制p38MAPK信號(hào)發(fā)揮抗心力衰竭作用。

綜上所述，靈芝多糖能夠改善心力衰竭大鼠心功能、抑制心肌纖維化、改善心肌能量代謝、降低p38MAPK信號(hào)激活水平，目前尚未探討靈芝多糖通過何種靶向機(jī)制影響p38MAPK發(fā)揮作用，在以后的實(shí)驗(yàn)中深入研究。