宋璐霞，張 杰，馬 丹，樊懿萱，劉啟予，趙 麟，徐 浩，3

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是發(fā)生于動脈血管壁(主要累及大中肌性動脈)的慢性疾病，是冠心病、高血壓等多種心腦血管疾病的危險因素。巨噬細(xì)胞作為動脈粥樣硬化斑塊中的主要炎性細(xì)胞，在促進(jìn)早期斑塊形成、稀釋纖維帽和核心壞死成分、增強(qiáng)免疫應(yīng)答反應(yīng)等方面具有重要作用[1]。巨噬細(xì)胞在不同因素刺激下發(fā)生表型的分化即巨噬細(xì)胞極化，可分為M1、M2 型巨噬細(xì)胞。M1 型巨噬細(xì)胞能夠分泌促炎因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β、趨化因子配體-5(CCL-5)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)等[2]參與炎癥反應(yīng)過程；而M2型巨噬細(xì)胞則主要參與組織重塑及炎癥消退過程[3]。

丹參為唇形科植物丹參的干燥根和根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰的功效。丹參酮ⅡA為丹參的脂溶性有效活性成分，已有大量臨床及基礎(chǔ)研究顯示其具有抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用，在保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用[4-6]。然而，丹參酮ⅡA從影響巨噬細(xì)胞極化角度探索抗炎作用的實(shí)驗(yàn)證據(jù)尚待完善。故本實(shí)驗(yàn)以脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞為體外炎癥細(xì)胞模型為研究對象，從巨噬細(xì)胞極化角度出發(fā)探討丹參酮ⅡA抗炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及藥品 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司；丹參酮ⅡA購自美國APExBIO公司，N184611337769；LPS購自Solarbio公司，L8880。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司，C11885500BT)；CCK-8 試劑盒(賽百科公司，F(xiàn)25)；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、TurboFectTMTransfection Reagent、SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Sybr qpcr mix均購自THERMO公司；T4 DNA Ligase(Transgen公司，F(xiàn)L101-01)；封閉專用脫脂奶粉(北京普利萊公司，P622，2021MOAP1622)；10x電轉(zhuǎn)液(北京Solarbio公司，D1060，批號20210220)；5xTris-甘氨酸電泳緩沖液(北京Solarbio公司，D1060)；二哇啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)定量試劑盒(北京普利萊公司，P1511)；4×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離膠緩沖液(北京Solarbio公司，S1051，批號20201217)；一抗：Sirt1、F4/80、β-actin(Abcam公司，ab189494、ab6640、ab8227)、CD206/MMR(RD公司，AF2535)，過氧化物酶增生激活受體-γ(PPAR-γ)、iNOS、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-kBp65、Arg1抗體(CST公司)；二抗：山羊抗兔IgG HRP、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor?647)Abcam公司；驢抗兔 IgG(minimal x-reactivity)、FITC標(biāo)記抗鼠二抗均購自Biolegend公司；Sirt1干擾RNA由湖州河馬生物設(shè)計合成；各指標(biāo)引物由北京梓熙生物科技有限公司合成。YCP系列氣套二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(中國華曦公司)；BeamCyte-1026流式細(xì)胞儀(中國必達(dá)科公司)；3-30K低溫離心機(jī)(德國 Sigma公司)；Nanodrop lite分光光度計(購自美國THERMO公司)；熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)儀(美國Applied Biosystems公司)；SDS-PAGE電泳系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7巨噬細(xì)胞使用10% FBS-DMEM培養(yǎng)基(含100 kU/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞形態(tài)，RAW264.7最佳形態(tài)為小的圓形透亮細(xì)胞[7]，待細(xì)胞生長密度為80%～90%后使用 0.25%的胰蛋白酶消化2 min進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.2 Sirt1干擾技術(shù) 采用qPCR法篩選最佳Sirt1敲降效果的siRNA(引物序列見表1)，構(gòu)建干擾載體，將慢病毒包裝質(zhì)粒混合物及表達(dá)質(zhì)粒使用無菌超純水分別稀釋為終濃度為1.0 μg/μL 的質(zhì)粒溶液。在無菌1.5 mL EP管中加入400 μL無血清培養(yǎng)基，加入1.5 μg核心質(zhì)粒和1.5 μg病毒包裝質(zhì)粒，及6 μL turbofect充分混勻，靜置15～20 min，將混合液逐滴加入HEK-293T細(xì)胞中，48 h后吸取上清，補(bǔ)入培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后收集上清，將兩次收集的上清液混合，得到病毒液。0.45 μm濾膜過濾病毒液，-80 ℃保存用于后續(xù)感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞模型。

表1 mSirt1 siRNA合成序列

1.3.3 丹參酮ⅡA給藥濃度篩選 于96孔板中以1×105

每孔接種RAW264.7細(xì)胞，分為對照組及丹參酮ⅡA各劑量組(濃度分別為5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=[(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對照組OD-空白組OD)]×100%，選定細(xì)胞給藥濃度。

1.3.4 炎癥模型構(gòu)建與分組 使用100 ng/mL LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h構(gòu)建巨噬細(xì)胞炎癥模型。分為空白組、模型組、Sirt1敲降組(模型+Sirt1 RNA干擾)、丹參酮ⅡA組(模型+丹參酮ⅡA)及Sirt1敲降+丹參酮組(模型+Sirt1 RNA干擾+丹參酮ⅡA)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 各組細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL，取100 μL 細(xì)胞懸液，加入對應(yīng)的一抗 4 ℃孵育30 min，二抗 4 ℃、避光孵育30 min，經(jīng)1%多聚甲醛 4 ℃固定30 min后上機(jī)檢測。M1型巨噬細(xì)胞以F4/80+/iNOS標(biāo)記，M2型巨噬細(xì)胞以F4/80+/CD206+標(biāo)記。

1.3.6 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)指標(biāo) 收集各組細(xì)胞，使用5倍細(xì)胞體積RIPA裂解液提取巨噬細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白法測定蛋白濃度，以每孔20 μg蛋白質(zhì)上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，加入Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1等一抗，4 ℃孵育過夜，第2日應(yīng)用TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，電化學(xué)發(fā)生(ECL)法顯影成像，Image J軟件對各組條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.3.7 RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)情況 收集并提取各組細(xì)胞mRNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，各組細(xì)胞 Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1的 mRNA 表達(dá)水平(引物序列見表2)。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)處理5 min，循環(huán) 1 次；95 ℃變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次，每組設(shè)3個復(fù)孔。相對表達(dá)量計算公式：RQ=2-(△Ctq-ΔCtcb)，△Ctq=待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct值，△Ctcb=對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值。

表2 各指標(biāo)引物序列

2 結(jié) 果

2.1 qPCR篩選siRNA 提取各組Sirt1表達(dá)干擾細(xì)胞的mRNA行qPCR檢測。與對照組比較，si-RNA-NC組、Si-RNA-1組、Si-RNA2組對Sirt1基因表達(dá)的干擾差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，si-RNA-3組對Sirt1基因表達(dá)的干擾差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞對Sirt1表達(dá)的影響(±s)

2.2 CCK-8法檢測各濃度丹參酮ⅡA細(xì)胞存活率 與對照組比較，丹參酮ⅡA 5 μg/mL組、丹參酮ⅡA 10 μg/mL組、丹參酮ⅡA 20 μg/mL組RAW264.7巨噬細(xì)胞存活率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明丹參酮ⅡA對RAW264.7細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒作用。詳見表4。本實(shí)驗(yàn)選擇丹參酮ⅡA 20 μg/mL濃度進(jìn)行后續(xù)藥物干預(yù)。

表4 不同濃度丹參酮ⅡA對RAW264.7細(xì)胞活力影響(±s)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組M1型、M2型巨噬細(xì)胞 本實(shí)驗(yàn)流式圖像分析均使用雙參數(shù)散點(diǎn)圖，按照“十”字四象限進(jìn)行設(shè)置(Q1-1至Q1-4)，每象限內(nèi)以“%”表示不同細(xì)胞亞群分布百分比。橫坐標(biāo)及縱坐標(biāo)分別表示各熒光標(biāo)記的抗體與目標(biāo)細(xì)胞表面結(jié)合熒光強(qiáng)度。M1型巨噬細(xì)胞以F4/80+/iNOS+為標(biāo)記，Q1-2象限內(nèi)表示M1型巨噬細(xì)胞分布情況。與模型組比較，Sirt1敲降組M1巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，丹參酮ⅡA組及Sirt1敲降+丹參酮組M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量則明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.001)；在對Sirt1基因敲降基礎(chǔ)上予丹參酮ⅡA干預(yù)后能明顯減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖1、表5。

圖1 各處理組對M1型巨噬細(xì)胞分布影響

表5 各組對M1型巨噬細(xì)胞分布百分比比較(±s)單位：%

M2型巨噬細(xì)胞以F4/80+/CD206+為標(biāo)記，圖2中Q1-2象限中為M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)情況。與模型組比較，丹參酮ⅡA組及Sirt1敲降+丹參酮組M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，Sirt1基因敲降使M2型巨噬細(xì)胞數(shù)下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組M2巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見表6。

圖2 各組M2型巨噬細(xì)胞分布情況

表6 各組對M2型巨噬細(xì)胞分布百分比比較(±s)單位：%

2.4 Western Blot檢測各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達(dá) 與模型組比較，丹參酮ⅡA能夠明顯上調(diào)Sirt1以及M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白Arg1表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，減少炎癥相關(guān)NF-κB以及M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，丹參酮ⅡA能上調(diào)PPAR-γ蛋白表達(dá)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在對細(xì)胞進(jìn)行Sirt1基因敲降后，敲降組Sirt1、PPAR-γ明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NF-κB、iNOS、Arg1表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組Sirt1表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PPAR-γ及Arg1表達(dá)增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NF-κB、iNOS呈下降趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖3、表7。

圖3 丹參酮ⅡA 對Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達(dá)影響

表7 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1蛋白表達(dá)比較(±s)

2.5 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達(dá)比較 與空白組比較，模型組Sirt1、PPAR-γ mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，NF-κB及iNOS mRNA表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；與模型組比較，丹參酮ⅡA組能夠明顯上調(diào)Sirt1、PPAR-γ、Arg1 mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，抑制NF-κB、iNOS mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，Sirt1敲降組Sirt1、PPAR-γ mRNA表達(dá)減少，NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達(dá)升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與Sirt1敲降組比較，Sirt1敲降+丹參酮組Sirt1、PPAR-γ、Arg1 mRNA表達(dá)增多，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NF-κB、iNOS mRNA表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表8。

表8 各組Sirt1、PPAR-γ、NF-κB、iNOS、Arg1 mRNA表達(dá)影響(±s)

3 討 論

動脈粥樣硬化所致的血管管腔狹窄及易損斑塊的破裂繼發(fā)血栓是冠心病的主要病理改變，這與中醫(yī)學(xué)中的“血瘀”“血脈瘀阻”有諸多相似之處。陳可冀院士團(tuán)隊(duì)采用病證結(jié)合方法，提出冠心病主要中醫(yī)病機(jī)為“心血瘀阻，血脈不通”，并提出“瘀毒致變”引發(fā)急性心血管事件的假說[8-9]，推動了活血解毒中藥治療冠心病的臨床實(shí)踐與科學(xué)研究。丹參作為活血化瘀的主要藥物，被廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療實(shí)踐中。

炎癥反應(yīng)貫穿了動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的全過程，巨噬細(xì)胞作為斑塊進(jìn)展的主要參與者，M1 型巨噬細(xì)胞增多導(dǎo)致炎性因子分泌增加，損傷內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致斑塊纖維帽變薄更易破損，成為易損斑塊，加速疾病進(jìn)展；M2 型巨噬細(xì)胞增多則導(dǎo)致脂質(zhì)核心外部的M2型巨噬細(xì)胞可吞噬凋亡的M1型巨噬細(xì)胞，有助于炎癥消退，防止斑塊破裂，使斑塊趨于穩(wěn)定，抑制動脈粥樣硬化發(fā)展[10-11]。沉默信息調(diào)節(jié)因子Sirtuin(Sirt)家族蛋白(Sirt-7)具有廣泛的生物學(xué)作用，包括參與脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等[12]。Sirt1基因表達(dá)缺失會介導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13]，抑制PPAR-γ激活、誘導(dǎo)NF-κB活化促使巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞極化[14]。反之，PPAR-γ表達(dá)上調(diào)能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2表型極化。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞中Sirt1能夠催化NF-κB去乙?；种破溥^度激活，降低組織因子表達(dá)和動脈血栓形成[15]，降低凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(Lox-1)進(jìn)而緩解泡沫細(xì)胞形成，增加易損斑塊穩(wěn)定性[16]?？梢?，Sirt1/PPAR-γ/NF-κB信號通路在調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，抑制炎癥反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化進(jìn)展，維持斑塊穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。然而巨噬細(xì)胞的種類不僅止于M1、M2型，與人類疾病發(fā)展密切相關(guān)的部分巨噬細(xì)胞的起源和特征仍尚未明確，比如CD169+巨噬細(xì)胞、TCR+巨噬細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠明顯下調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中M1型巨噬細(xì)胞分布，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞數(shù)量，上調(diào)Sirt1、PPAR-γ、Arg1等通路蛋白及mRNA表達(dá)，抑制NF-κB、iNOS蛋白和mRNA表達(dá)。在對RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型進(jìn)行Sirt1基因敲降后，M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量較模型組明顯升高，M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量則有所下降但差異不明顯，但總體呈促炎趨勢。對應(yīng)的Sirt1、PPAR-γ蛋白及mRNA明顯減少，然而Arg1并沒有如預(yù)期中下調(diào)，反而有所升高，NF-κB、iNOS蛋白和mRNA表達(dá)升高。M1和M2型巨噬細(xì)胞極化是一個動態(tài)而連續(xù)的過程，因此考慮處于二者轉(zhuǎn)化過程中巨噬細(xì)胞可能會同時表達(dá)個別標(biāo)志物，故推測這是Sirt1敲除后導(dǎo)致Arg1不降反增的可能原因。

綜合上述研究結(jié)果，認(rèn)為丹參酮ⅡA能夠通過調(diào)控Sirt1/PPAR-γ/NF-κB 信號通路，調(diào)控M1、M2型巨噬細(xì)胞極化抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，進(jìn)而緩解動脈粥樣硬化發(fā)展，但在此過程中其他類型巨噬細(xì)胞是否參與以及如何干預(yù)，有待深入探索。