楊慧軒，羅 欣，梁榮蓉，楊嘯吟，朱立賢，毛衍偉，董鵬程，韓廣星，張一敏,*

（1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安 271018；2.國(guó)家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系臨沂站，山東 臨沂 276000）

近年來(lái)，隨著食品工業(yè)科技的不斷發(fā)展，肉類(lèi)產(chǎn)品加工、包裝、貯藏和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)逐步系統(tǒng)完善，傳統(tǒng)的抑菌保鮮方式已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代肉類(lèi)工業(yè)的需求。乳酸菌作為新型生物抑菌劑便成為了傳統(tǒng)抑菌方式良好替代產(chǎn)品。乳酸菌因其能夠產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素及其他抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物，在大量的實(shí)驗(yàn)研究中證明是控制食源性病原體天然且有效的菌株[1]。因此，乳酸菌作為生物抑菌劑的良好備選菌株，成為化學(xué)食品添加劑的優(yōu)良替代品并逐漸成為保障食品安全的重要物質(zhì)。目前已有很多研究將乳酸菌作為生物抑菌劑應(yīng)用于肉與肉制品中，但是不同的研究中所選用的乳酸菌菌株、被接種的肉制品種類(lèi)、應(yīng)用的環(huán)境條件、作用的靶向菌群及獲得的抑菌效果不盡相同，乳酸菌在使用過(guò)程中存在的問(wèn)題和缺陷以及乳酸菌自身潛在的安全性問(wèn)題也都缺乏系統(tǒng)綜述。所以，肉類(lèi)工業(yè)很難將其中某一項(xiàng)的研究結(jié)果應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。因此，將已有研究成果進(jìn)行系統(tǒng)的歸類(lèi)、總結(jié)，進(jìn)而給出乳酸菌在肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)中的使用建議，對(duì)于推動(dòng)生物抑菌劑在肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用十分必要。

本文對(duì)乳酸菌的主要抑菌機(jī)制和其在肉中不同的包裝方式、使用方式、代謝環(huán)境、加工方式和溫度變化條件下的微生物污染防控效果以及潛在的安全性問(wèn)題展開(kāi)了綜述和討論，并對(duì)乳酸菌作為生物抑菌劑在肉類(lèi)及其制品中的實(shí)際應(yīng)用現(xiàn)狀和存在的問(wèn)題系統(tǒng)總結(jié)，以期為乳酸菌在肉類(lèi)產(chǎn)業(yè)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1 乳酸菌在肉與肉制品應(yīng)用中的主要抑菌機(jī)制

乳酸菌與一些常見(jiàn)致病菌之間存在相互作用機(jī)制，這也已成為其作為生物抑菌劑的重要研究?jī)?nèi)容，因此乳酸菌的生物保護(hù)效果及其機(jī)制受到了廣泛的關(guān)注。乳酸菌本身的代謝活動(dòng)以及代謝過(guò)程中釋放的有機(jī)酸、過(guò)氧化氫和細(xì)菌素等代謝產(chǎn)物[2]，都是其抑制常見(jiàn)致病菌及腐敗菌等目標(biāo)菌的有效作用物質(zhì)。乳酸菌的相關(guān)抑菌機(jī)制已有較為廣泛的研究及綜述，如圖1所示，乳酸菌對(duì)目標(biāo)菌株的抑制機(jī)制主要包括：1）有機(jī)酸、細(xì)菌素、過(guò)氧化氫等對(duì)細(xì)菌屏障結(jié)構(gòu)造成破壞，影響其通透性和穩(wěn)定性，造成細(xì)胞質(zhì)外流等；2）乳酸和乙酸等弱酸解離對(duì)細(xì)菌質(zhì)子梯度的干擾；3）上述抗菌物質(zhì)在進(jìn)入目標(biāo)菌細(xì)胞后，可鈍化抑制酶活性，對(duì)細(xì)菌DNA合成、RNA轉(zhuǎn)錄等過(guò)程造成干擾；4）乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)底物的競(jìng)爭(zhēng)性利用。

圖1 乳酸菌的抑菌機(jī)制Fig. 1 Hypothetic mechanisms for antibacterial effect of lactic acid bacteria

1.1 有機(jī)酸

乳酸菌在對(duì)糖發(fā)酵后，產(chǎn)生乳酸和乙酸等其他有機(jī)酸，其主要通過(guò)與目標(biāo)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的磷脂及脂多糖作用從而對(duì)目標(biāo)菌株的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞[3]；目標(biāo)菌株主動(dòng)運(yùn)輸H+消耗大量ATP導(dǎo)致生長(zhǎng)代謝速率降低[4]；影響質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)梯度從而破壞目標(biāo)菌的跨膜運(yùn)輸系統(tǒng)[5]；H+在細(xì)胞內(nèi)聚集造成了胞內(nèi)滲透壓的升高，胞內(nèi)微環(huán)境的改變使得細(xì)菌酶變性或鈍化，對(duì)DNA合成、RNA轉(zhuǎn)錄等造成干擾[6]。但是乳酸菌生產(chǎn)有機(jī)酸的能力和類(lèi)型會(huì)受到乳酸菌種類(lèi)、培養(yǎng)成分和生長(zhǎng)條件的影響，這對(duì)其實(shí)際應(yīng)用造成了困難，例如?zcelik等[7]發(fā)現(xiàn)在鳳尾魚(yú)浸出液肉湯中乳酸菌的乳酸、乙酸和琥珀酸產(chǎn)量以及在鮭魚(yú)浸出液肉湯中甲酸的產(chǎn)量均要高于MRS肉湯。目前有機(jī)酸在肉類(lèi)加工業(yè)中，尤其是肉牛屠宰末端已廣泛應(yīng)用。通常認(rèn)為乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸中乳酸和乙酸為主要抑菌物質(zhì)[8]，但是乳酸菌自然產(chǎn)生的單種有機(jī)酸濃度往往低于部分菌株的最小抑菌濃度。此外，存在一些耐酸性較強(qiáng)的霉菌和酵母菌，El-Gazzar等[9]發(fā)現(xiàn)寄生曲霉菌在含有0.50%和0.75%乳酸的培養(yǎng)基中依然可以生長(zhǎng)。因此，不同有機(jī)酸之間的協(xié)同抑菌效應(yīng)[10]還需進(jìn)一步闡明。

1.2 細(xì)菌素

細(xì)菌素通常是一種核糖體合成的抗菌肽，一般情況下，各種革蘭氏陽(yáng)性菌都能產(chǎn)生細(xì)菌素，其中乳酸菌細(xì)菌素研究最為廣泛[11]。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素具有多種分類(lèi)方式，其主要分為I類(lèi)羊毛硫抗生素（含羊毛硫氨酸抗生素）和II類(lèi)羊毛硫抗生素（可進(jìn)一步分為IIa、IIb、IIc和IId）[12]兩大類(lèi)。大部分細(xì)菌素可通過(guò)連接或嵌入目標(biāo)菌株細(xì)胞膜并在上面形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄，從而使得目標(biāo)菌死亡[13]。Héquet等[14]在火腿中對(duì)比使用了產(chǎn)細(xì)菌素的清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）2512和不產(chǎn)細(xì)菌素的清酒乳桿菌L110，雖然二者有相近的培養(yǎng)基酸化速率，但產(chǎn)細(xì)菌素處理組中英諾克李斯特菌（Listeria innocua）數(shù)量更低，且整個(gè)貯藏期60 d內(nèi)目標(biāo)菌株均未顯著生長(zhǎng)。同樣，Castilho等[15]發(fā)現(xiàn)在整個(gè)貯藏期間，添加產(chǎn)細(xì)菌素的彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）處理組中的單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogene）（后簡(jiǎn)稱為“單增李斯特菌”）細(xì)胞數(shù)均低于清酒乳桿菌ATCC 15521（不產(chǎn)細(xì)菌素）處理組1～2（lg（CFU/g）），在以細(xì)菌素為控制變量時(shí)，不同的處理之間的減菌效果差異顯著。但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，也應(yīng)考慮到乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素是否會(huì)對(duì)其他有益菌株或協(xié)同菌株產(chǎn)生抑制作用[16]，肉中的脂肪和蛋白酶是否會(huì)干擾其抑菌性等問(wèn)題。雖然存在一些對(duì)細(xì)菌素敏感的菌株，但細(xì)菌素的特異性相較于其他特異性殺菌物質(zhì)如噬菌體等還相對(duì)較弱。此外，乳酸菌細(xì)菌素對(duì)于目標(biāo)菌株的完全清除能力不足，因此，基于細(xì)菌素進(jìn)行靶點(diǎn)抑菌的研究，需深入了解細(xì)菌素的產(chǎn)生和作用方式的機(jī)制。同時(shí)還需對(duì)細(xì)菌素毒理學(xué)研究和動(dòng)物攝食后分子去向進(jìn)行進(jìn)一步探索，使得產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌菌株更加安全有效地投入食品安全領(lǐng)域。

1.3 競(jìng)爭(zhēng)性抑制

乳酸菌與其他微生物共培養(yǎng)時(shí)，其自身有關(guān)碳水化合物、能量產(chǎn)生和氨基酸代謝有關(guān)的蛋白質(zhì)有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象產(chǎn)生。Orihuel等[17]在研究蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）與大腸桿菌共培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)蒙氏腸球菌與氨基酸的生物合成和代謝有關(guān)的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）過(guò)度表達(dá)，此外，該研究還檢測(cè)到與糖酵解、烯醇化有關(guān)的酶和與細(xì)胞分裂相關(guān)的酶均過(guò)度表達(dá)，表明乳酸菌能夠通過(guò)促進(jìn)糖酵解和細(xì)胞分裂以抑制大腸桿菌的生存。Yang Dong等[18]在分析雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）和單增李斯特菌共培養(yǎng)的差異蛋白的實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)中參與蛋白質(zhì)和核酸生物合成的酶數(shù)量增加，包括核糖體蛋白、轉(zhuǎn)移RNA谷氨酰轉(zhuǎn)移酶和翻譯延伸因子，這些酶數(shù)量的增加都促進(jìn)了蛋白質(zhì)的翻譯。共培養(yǎng)能夠使乳酸菌在糖代謝、能量產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分裂和氨基酸代謝中許多蛋白過(guò)表達(dá)，以此加快自身代謝速率，并提高其與其他菌株競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)底物的能力，從而達(dá)到抑制目標(biāo)菌株生長(zhǎng)的目的。

1.4 過(guò)氧化氫

研究表明乳酸菌懸液中產(chǎn)生的過(guò)氧化氫（H2O2）可以在懸液中積累，并有顯著的抑菌作用。H2O2已作為抑菌物質(zhì)廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[19]。H2O2導(dǎo)致細(xì)菌的DNA、細(xì)胞蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜脂質(zhì)氧化是其抑菌的主要機(jī)制[20-21]。Ito等[22]從不同的食品中分離出193 株乳酸菌，其中有27 株可在懸液中積累相對(duì)較多的H2O2，實(shí)驗(yàn)中乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）AI 62產(chǎn)生的H2O2對(duì)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica）等其他致病菌均有顯著抑菌作用。乳酸菌產(chǎn)生的H2O2量會(huì)受到環(huán)境氣體狀態(tài)的影響，相較未暴露在空氣的狀態(tài)，其在空氣條件下會(huì)產(chǎn)生2～3 倍的H2O2，這可能與煙酰胺腺嘌呤羥基二核苷酸（nicotinamide adenine hydroxy dinucleotide，NADH）氧化酶在空氣中具有較高的氧氣利用率有關(guān)[23]。振蕩培養(yǎng)也會(huì)使菌株的生長(zhǎng)環(huán)境通入更多的氧氣，Collins等[24]研究表明在振蕩培養(yǎng)下，部分嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）產(chǎn)生了更多的H2O2（40～50 mg/kg），而未振搖狀態(tài)下H2O2的產(chǎn)生量?jī)H為5 mg/kg，這也可能與振蕩培養(yǎng)中細(xì)胞鏈的長(zhǎng)度比在靜態(tài)培養(yǎng)的長(zhǎng)度較短有關(guān)。此外，乳酸菌與乳酸和低水平的乳酸鈉結(jié)合后也可產(chǎn)生一定水平的H2O2，這種方式為延長(zhǎng)食品貨架期提供了一種相對(duì)經(jīng)濟(jì)的方法[25]。雖然H2O2有著良好的抑菌效果，但是上述的研究中，均以乳酸菌所產(chǎn)生的H2O2為主要抑菌方式，如何讓H2O2在食品中有效積累并顯著抑菌還需要后續(xù)大量研究進(jìn)行探索。

1.5 其他抑菌途徑

乳酸菌除了上述抑菌機(jī)制外，還有其他多種抑菌途徑。羅伊乳桿菌（Lactobacillus reuteri）可在厭氧條件下代謝生成羅氏菌素（3-羥基丙醛），其對(duì)革蘭氏陰性菌有較好的抑菌能力，在發(fā)酵乳制品中添加使用也未對(duì)品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[26]；微生物胞外多糖具有增稠、增黏和充當(dāng)乳化劑等多方面的應(yīng)用潛力，乳酸菌可以產(chǎn)生不同類(lèi)型的胞外多糖，其中硫酸多糖可單獨(dú)或結(jié)合其他抗菌物質(zhì)控制病毒和細(xì)菌的生長(zhǎng)[27]；生物膜是一種細(xì)胞固定化的自然形式，其可在多種類(lèi)型的表面形成，來(lái)抵御消毒和清洗，致病性和致腐性的微生物生物膜對(duì)食品工業(yè)造成了巨大的安全風(fēng)險(xiǎn)[28]，乳酸菌可通過(guò)釋放抗菌代謝物和胞外多糖，及通過(guò)對(duì)生長(zhǎng)因子和黏附位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制有害微生物生物膜的形成[29]。此外，乳酸菌酸性發(fā)酵液還可降低介導(dǎo)群體感應(yīng)的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactone，AHL）信號(hào)分子的釋放，從而對(duì)生物膜的形成產(chǎn)生抑制[30]。

乳酸菌的多種代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸、細(xì)菌素和H2O2均有顯著的抑菌能力，并且可以通過(guò)不同抑菌途徑對(duì)細(xì)菌的生物膜進(jìn)行清除或抑制。但是，上述抑菌途徑中的代謝產(chǎn)物大部分是在適宜乳酸菌生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行富集，在肉中實(shí)際應(yīng)用時(shí)乳酸菌的抑菌產(chǎn)物產(chǎn)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于理想環(huán)境條件下的產(chǎn)量；因此，乳酸菌在肉中如何有效抑菌，這些抑菌途徑如何協(xié)同作用，其中的機(jī)制還需進(jìn)一步闡明。

表1總結(jié)了乳酸菌在抑制一些主要食源性致病菌如單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌O157:H7以及肉中常見(jiàn)的腐敗菌如假單胞菌和熱殺索絲菌等的作用效果，總體來(lái)看，乳酸菌接種到不同的肉類(lèi)及其制品中后，都可對(duì)目標(biāo)菌株產(chǎn)生抑制作用，并且適應(yīng)大部分低溫貯藏溫度范圍（即使產(chǎn)生溫度波動(dòng)）。此外，盡管抑菌效果不同，乳酸菌基本適用常見(jiàn)的肉類(lèi)包裝方式和加工方式。下文從肉與肉制品的包裝條件、乳酸菌的使用方式、乳酸菌的

代謝環(huán)境、肉制品的加工方式和乳酸菌接種后溫度變化條件下，乳酸菌對(duì)肉中微生物的防控作用展開(kāi)論述。

表1 乳酸菌對(duì)肉制品中微生物污染的防控效果Table 1 Efficacy of lactic acid bacteria in preventing and controlling microbial contamination in meat products

2 乳酸菌在肉與肉制品中的應(yīng)用效果的影響因素

2.1 包裝方式

細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化會(huì)受到貯藏包裝類(lèi)型的很大影響，在一般情況下，冷鮮肉在真空包裝條件下的優(yōu)勢(shì)菌群常見(jiàn)為乳酸菌[43-45]，因此，乳酸菌在真空包裝中具有更長(zhǎng)時(shí)間的抑菌效果[1,14,40]。Aymerich等[1]在冷熏三文魚(yú)肉中測(cè)試了3種具有潛在抑菌能力的乳酸菌在低溫下對(duì)單增李斯特菌的抑制效果，結(jié)果顯示清酒乳桿菌的抑菌效果最好，相較于對(duì)照組單增李斯特菌數(shù)量降低了3.44（lg（CFU/g）），并且在貯藏21 d內(nèi)均未顯著增長(zhǎng)。這些結(jié)果表明，肉源乳酸菌可作為生物抑菌劑在真空環(huán)境下提高食品安全性。而在MAP中，填充的CO2可以使微生物延滯期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期的生長(zhǎng)速率降低，所以在貯藏前期，MAP對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)也有一定的抑制作用，這也許是Saraoui等發(fā)現(xiàn)乳酸菌在蝦肉貯藏第一周前期對(duì)單增李斯特菌未有顯著抑菌作用，但在后期又發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌數(shù)降至低于檢測(cè)閾值的原因[34]。有研究表明，在冷藏條件下，50% CO2+50% N2的MAP比真空和空氣包裝更好地提高了魚(yú)肉制品的品質(zhì)，延長(zhǎng)了其貨架期[46]。并且在相同的MAP環(huán)境下，不同的乳酸菌組合方式也顯著影響抑菌效果[41]。因此，保證產(chǎn)品品質(zhì)的前提下延長(zhǎng)肉類(lèi)產(chǎn)品貨架期，還需進(jìn)一步探究確定適宜的氣體成分、乳酸菌組和方式及接種濃度。乳酸菌在托盤(pán)包裝或者在空氣中（無(wú)包裝或無(wú)菌培養(yǎng)皿）維持效用的時(shí)間相對(duì)較短，因?yàn)橐话阍诳諝鈼l件下，假單胞菌等易成為優(yōu)勢(shì)菌群。Duan Xingxing等[47]發(fā)現(xiàn)在無(wú)菌培養(yǎng)皿中添加含有100 mg/mL抗菌物質(zhì)的副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）發(fā)酵液可將生鮮雞肉貨架期延長(zhǎng)4 d，在貯藏期8 d時(shí)對(duì)照組和處理組中假單胞菌的相對(duì)豐度各為89.7%和63.1%，雖然乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)顯著延長(zhǎng)了貨架期，但假單胞菌在菌群結(jié)構(gòu)中的優(yōu)勢(shì)地位并沒(méi)有改變。在無(wú)包裝或托盤(pán)包裝下，乳桿菌科的相對(duì)豐度會(huì)因假單胞菌等細(xì)菌的生長(zhǎng)而降低[48]，但其仍然是貯藏期間的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)菌株，仍可能會(huì)存在一定的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)作用，減緩肉類(lèi)產(chǎn)品中的菌群結(jié)構(gòu)向腐敗能力強(qiáng)的菌群演變。Danielski等[36]發(fā)現(xiàn)麥芽芳香卡諾桿菌可以抑制托盤(pán)包裝的熟火腿中英諾克李斯特菌生長(zhǎng)，且不影響貯藏過(guò)程中的產(chǎn)品品質(zhì)。在冷藏溫度下，不同包裝條件中的乳酸菌都可提供較好的生物保護(hù)作用，特別是在更適宜其生長(zhǎng)的真空包裝中。因此對(duì)肉與肉制品使用乳酸菌作為生物抑菌劑時(shí)，應(yīng)結(jié)合恰當(dāng)?shù)陌b方式，通過(guò)制造適宜其生長(zhǎng)的包裝環(huán)境，增強(qiáng)其抑菌效果，從而提高產(chǎn)品安全性。

2.2 使用方式

雖然人們通過(guò)添加乳酸菌來(lái)保藏食物已有較長(zhǎng)的歷史，但隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，與之相適應(yīng)的使用方式同樣需要不斷地開(kāi)發(fā)和探索。Bomdespacho等[42]用嗜酸乳桿菌逐步替代漢堡肉中亞硝酸鹽（嗜酸乳桿菌分別與未添加、75 mg/kg和150 mg/kg亞硝酸鹽聯(lián)合使用），各處理組在貯藏6 d時(shí)凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌、亞硫酸鹽還原梭狀芽胞桿菌和大腸桿菌均未顯著生長(zhǎng)；該研究表明，乳酸菌作為生物抑菌劑，即使在減少部分或全部腌制鹽的情況下，仍能有效地維持加工肉制品的安全性；但僅靠單一乳酸菌并不能完全控制所有微生物的生長(zhǎng)，如酸耐受性較好的大腸菌群在第6天時(shí)，已由0 d的2.28（lg（CFU/g））增長(zhǎng)到了4.78（lg（CFU/g）），這也許可以通過(guò)和產(chǎn)其他細(xì)菌素的乳酸菌混合使用來(lái)彌補(bǔ)這一缺陷。Comi等[41]使用多種乳酸菌進(jìn)行不同比率混合，發(fā)現(xiàn)其可將揮發(fā)性鹽基氮含量降低到300 mg/kg以下，從而延緩牛肉餅的腐敗，將貨架期延長(zhǎng)至12 d。但不同種類(lèi)和數(shù)量的乳酸菌組合產(chǎn)生的抑菌效果差異顯著，這可能與不同乳酸菌之間的生長(zhǎng)速率和代謝途徑有關(guān)，并且乳酸菌之間的協(xié)同效應(yīng)或者代謝產(chǎn)物之間的協(xié)同效應(yīng)仍需進(jìn)一步探究。Saraoui等[34]將魚(yú)乳球菌和廣布肉桿菌兩種乳酸菌混合或單獨(dú)應(yīng)用在熟制蝦肉中，這兩種保護(hù)菌株之間不存在協(xié)同效應(yīng)，混合使用與單獨(dú)使用廣布肉桿菌具有相同的抑制效果。但也有研究發(fā)現(xiàn)魚(yú)乳球菌能有效去除貯藏初期廣布肉桿菌產(chǎn)生的不良風(fēng)味，因此，在水產(chǎn)品的生物抑菌策略中使用二者的混合制劑是一種較好的選擇。此外，恰當(dāng)?shù)穆?lián)用方式可以增強(qiáng)抑菌效果，Castellano等[38]使用的乳酸菌并未產(chǎn)生顯著的殺菌效果，但其將Na2EDTA與乳酸菌聯(lián)用后，其在整個(gè)貯藏期內(nèi)都產(chǎn)生了顯著的抑菌效果，原因可能為Na2EDTA的螯合作用能夠去除革蘭氏陰性菌細(xì)胞保護(hù)性外膜中脂多糖層中的二價(jià)陽(yáng)離子，從而使它們對(duì)疏水肽（如細(xì)菌素）敏感，因此增強(qiáng)了乳酸菌的抑菌能力。乳酸菌可與傳統(tǒng)的抑菌劑聯(lián)合使用產(chǎn)生抑菌效果，是極有潛力替代傳統(tǒng)抑菌劑的抗菌物質(zhì)，同時(shí)，不同乳酸菌之間的聯(lián)用或混合使用能夠發(fā)揮更好的抑菌效果，但其中的協(xié)同抑菌機(jī)制需要進(jìn)一步闡明。

2.3 代謝基質(zhì)環(huán)境

乳酸菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)種類(lèi)繁多，其范圍可從一些簡(jiǎn)單的初級(jí)代謝產(chǎn)物到生物轉(zhuǎn)化、多肽合成和蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)生的復(fù)雜化合物，例如有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、二乙酰、細(xì)菌素和抗菌肽，且均具有不同的抗菌活性范圍[49]。由表1可以看出，乳酸菌在不同的肉類(lèi)基質(zhì)上均可以有效控制致病菌或腐敗菌的生長(zhǎng)，但值得注意的是，將體外抑菌實(shí)驗(yàn)篩選出來(lái)的乳酸菌直接或者間接使用在肉類(lèi)產(chǎn)品中時(shí)，并不能達(dá)到理想效果，甚至沒(méi)有顯著的抑菌效果。Castilho等[15]使用乳酸菌部分純化的細(xì)菌素抑制單增李斯特菌的生長(zhǎng)，但細(xì)菌數(shù)量未顯著下降，這可能是細(xì)菌素與磷脂結(jié)合或因甲酰-谷氨?；D(zhuǎn)移酶失活等因素造成的結(jié)果，這也可能是7 d時(shí)乳酸鏈球菌素處理香腸中又檢測(cè)到單增李斯特菌的原因。研究表明，類(lèi)似于乳酸鏈球菌素、片球菌素等細(xì)菌素的擴(kuò)散都會(huì)受到環(huán)境中如pH值、鹽濃度、亞硝酸鹽和硝酸鹽、脂肪含量、可擴(kuò)散的水相和可溶解的脂肪表面等因素的影響[50]。另一重要的代謝產(chǎn)物有機(jī)酸也在肉類(lèi)基質(zhì)環(huán)境中存在同樣的問(wèn)題，乳酸菌在體外實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基中會(huì)積累大量有機(jī)酸，產(chǎn)生顯著的抑菌效果[49]，但是Morales等[39]發(fā)現(xiàn)在體外肉湯抑菌實(shí)驗(yàn)中，清酒乳桿菌處理組在貯藏5 d時(shí)莓實(shí)假單胞菌計(jì)數(shù)已經(jīng)接近檢出下限，卻與在肉中接種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（清酒乳桿菌并未顯示出有效的減菌效果）相矛盾。培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度是乳酸菌產(chǎn)生有機(jī)酸的關(guān)鍵因素，培養(yǎng)基中的碳水化合物利用率越高，有機(jī)酸的含量就越高，pH值降低也就越快，從而產(chǎn)生拮抗效果。而肉類(lèi)中的葡萄糖主要以糖原形式儲(chǔ)存于肌細(xì)胞中，乳酸菌較難代謝這些葡萄糖，因此不容易達(dá)到理想的抑菌效果[51]。乳酸菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)要求非常嚴(yán)格，一般在含有大量酵母提取物和蛋白水解物的培養(yǎng)基上才能獲得最佳的生長(zhǎng)與細(xì)菌素生產(chǎn)條件，因此，使用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基往往會(huì)過(guò)高估計(jì)乳酸菌的生長(zhǎng)能力[52]，這導(dǎo)致在肉中直接接種乳酸菌而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物遠(yuǎn)遠(yuǎn)會(huì)低于培養(yǎng)基中的產(chǎn)量。在篩選可作為生物抑菌劑的乳酸菌時(shí)，體外肉湯和固體培養(yǎng)基上對(duì)目標(biāo)菌株的拮抗效果雖然是很重要的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但仍需與實(shí)際的肉類(lèi)添加基質(zhì)相結(jié)合，以此確定恰當(dāng)?shù)慕臃N濃度或使用方式來(lái)確保乳酸菌在肉中的抑菌效果。

2.4 加工方式

隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，食品種類(lèi)也持續(xù)增加，相應(yīng)的食品加工技術(shù)也層出不窮，這就要求乳酸菌要與現(xiàn)代加工技術(shù)相適應(yīng)。Arief等[37]在羊肉香腸中添加植物乳桿菌IIA-2C12后發(fā)現(xiàn)，乳酸菌能很好地適應(yīng)煙熏香腸的加工工藝，其生長(zhǎng)活性未受到干燥、冷熏等加工工藝的影響，植物乳桿菌將大腸桿菌數(shù)控制在約1（lg（CFU/g））（對(duì)照組中大腸桿菌數(shù)已接近4（lg（CFU/g））），并且無(wú)沙門(mén)氏菌檢出（對(duì)照組沙門(mén)氏菌檢出呈陽(yáng)性）。輻照殺菌技術(shù)[53]因具較強(qiáng)的微生物清除能力被應(yīng)用于食品殺菌當(dāng)中，Morales等[39]發(fā)現(xiàn)與輻照的雞肉相比，在未輻照的雞肉中觀察到了更大的生物保護(hù)潛力，這也許與生鮮肉中初始的微生物菌群有關(guān)，與輻照肉相比，未輻照肉中的天然微生物可以提供額外的抑制目標(biāo)菌株的能力[54]。由表1可以看出，乳酸菌對(duì)不同切分方式下的肉類(lèi)均有顯著的抑菌作用，可適應(yīng)塊狀[39]或糜狀肉[35]的預(yù)處理加工，另外，無(wú)論是在塊狀肉上噴灑或涂抹，還是在肉糜中添加乳酸菌、細(xì)菌素等其他抗菌物質(zhì)擴(kuò)散到靶細(xì)胞的距離也是影響乳酸菌抑菌的重要因素[50]。此外，抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性也會(huì)受到加工方式的影響，例如在攪碎程度更高的肉糜中，大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶被釋放出來(lái)，這會(huì)大大降低細(xì)菌素的抑菌效果，肉中脂肪也會(huì)吸附肽類(lèi)物質(zhì)，使其拮抗作用下降[55]。此外，表1中所列的研究中，接種乳酸菌后致病菌的降低量較小，但是相較于對(duì)照組這仍具有顯著的抑菌效果，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中致病菌較低的初始污染水平，乳酸菌所產(chǎn)生的抑制效應(yīng)對(duì)食品安全有著較高的應(yīng)用價(jià)值。

2.5 溫度

溫度是影響乳酸菌代謝的重要因素，由表1可知乳酸菌在低溫狀態(tài)下具有一定的生物保護(hù)潛力，也有部分學(xué)者對(duì)變溫狀態(tài)下乳酸菌的抑菌能力展開(kāi)探究。Costa等[31]將乳酸菌與致病菌在鯛魚(yú)片上共培養(yǎng)，結(jié)果顯示在環(huán)境溫度4～8 ℃或2.5～12.0 ℃范圍不斷波動(dòng)條件下，清酒乳桿菌仍可有效控制單增李斯特菌的生長(zhǎng)；還通過(guò)不同溫度條件下在魚(yú)（海鯛）汁中單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的微生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推導(dǎo)出微生物交互作用模型，用來(lái)模擬等溫和非等溫條件下在MAP下魚(yú)片上微生物的交互作用，為乳酸菌抑制致病菌提供預(yù)測(cè)建模工具，便于優(yōu)化生物保護(hù)方法，提高了乳酸菌使用的可靠性和安全性。賈珊珊[56]則模擬了冷鏈在極度破壞的情況下，于溫度波動(dòng)較大范圍（4～28 ℃）內(nèi)使用乳酸菌來(lái)控制生鮮雞肉中的產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clotridium perfringens），結(jié)果顯示發(fā)酵乳桿菌抑制作用最好，產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量與溫度波動(dòng)前無(wú)顯著差異。雖然食品冷鏈物流已逐漸普及，但是運(yùn)輸期間可能會(huì)發(fā)生如冷卻設(shè)備故障、冷卻能力下降等問(wèn)題造成冷鏈溫度的波動(dòng)，而乳酸菌可以在溫度波動(dòng)時(shí)發(fā)揮生物保護(hù)作用，為冷鮮肉類(lèi)產(chǎn)品提供一定的安全保障，是一種極具潛力的抑菌方法。

3 乳酸菌對(duì)肉制品品質(zhì)的影響

在肉制品中添加乳酸菌不僅可以有效控制不良微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)還可以改善組織結(jié)構(gòu)、硬度、彈性和咀嚼性等品質(zhì)特性。Slima等[33]在牛肉香腸中使用植物乳桿菌代替亞硝酸鹽，在貯藏5 d和10 d后與對(duì)照組相比產(chǎn)品硬度顯著降低，這讓消費(fèi)者更易接受該類(lèi)產(chǎn)品。Arief等[37]也發(fā)現(xiàn)添加了植物乳桿菌的香腸有著更柔軟的質(zhì)地，這可能是由于該菌中蛋白水解酶的存在增加了香腸中粗蛋白的含量，同時(shí)乳酸菌的脂解過(guò)程可能對(duì)降低產(chǎn)品脂肪含量有著重要作用，這也使得處理組中香腸有著較低的脂肪含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)6.39%）和較高的蛋白質(zhì)含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)19.36%）。

肉色是肉類(lèi)產(chǎn)品非常重要的感官特性，消費(fèi)者通常將此作為生鮮肉及其制品新鮮度和品質(zhì)的重要參考標(biāo)準(zhǔn)。Zhang Yimin等[40]發(fā)現(xiàn)清酒乳桿菌在抑菌的同時(shí)，貯藏后期可以顯著提高牛排的L*值，從而提高牛排品質(zhì)。Gou Mengxing等[57]研究表明乳酸菌中的硝酸還原酶和一氧化氮合成酶均參與了NO生成，而NO與亞硝基肌紅蛋白（nitrosylmyoglobin，Mb-NO）的形成有關(guān)，Chen Xi等[58]得到的研究結(jié)果也說(shuō)明了這一現(xiàn)象，植物乳桿菌CMRC6和清酒乳桿菌CMRC15兩菌株可能具有亞硝酸鹽還原酶活性，促進(jìn)肌紅蛋白的亞硝化作用，從而使得香腸呈現(xiàn)出典型的粉紅色。此外，還有研究表明，乳酸菌具有在肉中部分或全部取代亞硝酸鹽的潛力[33,42]。

乳酸菌對(duì)于糖類(lèi)的代謝可將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸，從而降低pH值。Zhang Yulong等[59]發(fā)現(xiàn)接種發(fā)酵的酸肉其pH值降低速度明顯高于自然發(fā)酵方式，并且180 d貯藏末期具有更低的終pH值。Jones等[60]在羊肉中使用了3 株清酒乳桿菌混合制劑，發(fā)現(xiàn)不論是高濃度（3 000 CFU/cm2）或低濃度（30 CFU/cm2）接種乳酸菌，都在肉表面形成了穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)菌群，其代謝產(chǎn)物乳酸和乙酸均降低了羊肉表面pH值，并且高濃度處理組在貯藏前期pH值降低速度更快。但較低的pH值會(huì)造成較酸的口感，加入乳酸菌可能會(huì)降低肉類(lèi)產(chǎn)品在口味上的可接受性[37]。

總體來(lái)看，乳酸菌作為生物抑菌劑在肉與肉制品中的應(yīng)用，會(huì)一定程度上改善生鮮肉及其制品的色澤、營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)、感官特性等，提高其商業(yè)價(jià)值，同時(shí)乳酸菌的代謝活動(dòng)會(huì)降低肉中的pH值，能夠抑制食品腐壞和致病微生物，保證食品的質(zhì)量和安全，但這也造成了一些肉制品口味的變化，可能會(huì)令其食用的可接受性降低。因此，如何讓乳酸菌在提供生物保護(hù)功能的同時(shí)降低其對(duì)肉與肉制品風(fēng)味的不良影響將是未來(lái)的重要研究方向。

4 乳酸菌的安全性

目前，許多乳酸菌被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）認(rèn)定為公認(rèn)安全（generally recognized as safe，GRAS）[61]，并且具有歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）確定的安全合格推定（qualified presumption of safety）地位[62]，近年來(lái)，我國(guó)食品安全標(biāo)準(zhǔn)與監(jiān)測(cè)評(píng)估司也已將彎曲乳桿菌[63]、瑞士乳桿菌[64]等乳酸菌作為“三新食品”中的新食品原料加入食品中。雖然大部分乳酸菌在使用過(guò)程或安全性檢測(cè)中并未發(fā)現(xiàn)安全問(wèn)題，但是隨著越來(lái)越多的乳酸菌被開(kāi)發(fā)利用于肉類(lèi)工業(yè)，這增加了其作為生物抑菌劑的使用風(fēng)險(xiǎn)。Maragkoudakis等[35]研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和發(fā)酵乳桿菌均對(duì)臨床中重要的抗生素如氨芐西林、四環(huán)素和萬(wàn)古霉素敏感，但對(duì)氯霉素和紅霉素則不敏感。還有研究表明，糞腸球菌的gelE和sprE基因上游便存在與金黃色葡萄球菌調(diào)節(jié)毒力因子表達(dá)的agr基因具有同源性的基因[65]，并且該菌多種毒力因子編碼在信息素響應(yīng)質(zhì)粒上，這些質(zhì)?？梢栽诩S腸球菌之間高頻轉(zhuǎn)移[66]，此外，糞腸球菌具有不同的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制（信息素響應(yīng)質(zhì)粒、結(jié)合質(zhì)粒和非結(jié)合質(zhì)粒），這都增加了其在食品中作為生物抑菌劑的風(fēng)險(xiǎn)[66]?？梢酝ㄟ^(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)等來(lái)研究乳酸菌可能存在的毒力因子，確定其在食品中的毒力風(fēng)險(xiǎn)，評(píng)估菌株的安全性，這也需要未來(lái)研究中不斷擴(kuò)充有潛在致病性的毒力因子類(lèi)型與組合。

5 結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌作為從自然環(huán)境或加工食品中分離出的生物抑菌劑，在食品中能夠充當(dāng)活性抑菌成分，具有傳統(tǒng)化學(xué)減菌劑不可比擬的優(yōu)勢(shì)。大量研究已經(jīng)表明其對(duì)食品中的腐敗菌及致病菌具有良好的抑制作用，并且可在多種肉類(lèi)產(chǎn)品和不同的環(huán)境條件下發(fā)揮抑菌作用，這些都證明乳酸菌作為生物抑菌劑在食品安全領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

但乳酸菌作為生物抑菌劑應(yīng)用于肉類(lèi)工業(yè)中還要經(jīng)歷很長(zhǎng)的歷程。1）乳酸菌在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，往往受制于生長(zhǎng)環(huán)境，如在不同包裝之間或者肉類(lèi)呈現(xiàn)方式之間抑菌能力會(huì)產(chǎn)生差異，因此合適的菌株選用以及合理的添加方式仍需大量實(shí)驗(yàn)探究；2）乳酸菌細(xì)菌素在肉類(lèi)產(chǎn)品中應(yīng)用時(shí)，往往會(huì)受制于肉中的蛋白酶分解和脂類(lèi)物質(zhì)的吸附等，因此在肉中添加以細(xì)菌素的產(chǎn)生為目標(biāo)的乳酸菌時(shí)，如何讓細(xì)菌素在肉中正常發(fā)揮抑菌作用還要進(jìn)一步研究；3）不同乳酸菌之間的合理組合會(huì)提高產(chǎn)品質(zhì)量及抑菌效果，因此，備選的乳酸菌菌株還需大量開(kāi)發(fā)擴(kuò)充，以提高其使用的合理性和可靠性；4）應(yīng)該建立配套完善的乳酸菌安全性檢測(cè)系統(tǒng)，未來(lái)還要不斷挖掘潛在的毒力因子類(lèi)型和組合，使得乳酸菌更好、更安全地應(yīng)用于肉類(lèi)食品領(lǐng)域。