常 青，鄭寶東,2，張 怡,2，曾紅亮,2,*

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.福建省特種淀粉品質(zhì)科學與加工技術重點實驗室，福建 福州 350002）

生姜（Zingiber officinaleRoscoe），是姜科、姜屬的多年生草本植物的新鮮根莖，是我國藥食兩用的特產(chǎn)經(jīng)濟作物，產(chǎn)量居全球首位[1]。生姜中淀粉質(zhì)量占干質(zhì)量的40%～70%，是生姜根莖中主要的碳水化合物。目前，生姜主要以鮮姜、干姜和姜粉為主，其深加工產(chǎn)品較少，研究主要集中于生姜小分子活性物質(zhì)上，大量的淀粉在經(jīng)過提取之后被丟棄，造成了資源的浪費[2]。前期研究表明，生姜淀粉顆粒呈三角形片狀，與大宗淀粉顆粒存在明顯的差異，為特異性的淀粉顆粒；而且生姜淀粉中天然抗性淀粉顆粒約占70%以上，其中直鏈淀粉占35%，加工過程中易老化生成III型抗性淀粉[3]。

抗性淀粉在小腸內(nèi)不能被健康人體所利用，但能在大腸中被腸道微生物發(fā)酵或部分發(fā)酵代謝，產(chǎn)生短鏈脂肪酸、乳酸和其他少量氣體[4]。抗性淀粉分為5大類，分別為I型物理包埋淀粉、II型天然抗性淀粉顆粒、III型回生淀粉、IV型化學改性淀粉和V型淀粉酯質(zhì)復合物[5]?？剐缘矸圩鳛橐环N新型的膳食纖維，以多種方式參與調(diào)控機體脂質(zhì)代謝、膽固醇合成和分解、脂肪酸的攝入和氧化、膽汁酸的合成和代謝等生理過程，在維持或改善脂質(zhì)代謝平衡、防止脂肪過度沉積中發(fā)揮著重要的作用[6-8]。膽汁酸是機體重要代謝信號分子，不僅能夠參與機體營養(yǎng)物質(zhì)的消化代謝，還能參與機體脂質(zhì)、葡萄糖和能量平衡的調(diào)節(jié)[9]。膽汁酸可分為初級膽汁酸和次級膽汁酸，初級膽汁酸在肝臟中膽汁酸合成酶的催化下由膽固醇轉(zhuǎn)化而來；次級膽汁酸是初級膽汁酸經(jīng)膽囊分泌到腸道中，在腸道菌群的催化下經(jīng)過修飾及轉(zhuǎn)化等作用生成[10-11]。機體膽汁酸池的容量和組成變化會引起血清中膽汁酸代謝輪廓譜的變化，而血清膽汁酸的含量和組成可影響肝腸膽汁酸的循環(huán)[12]。

因此，本研究采用高脂飼料誘導SD大鼠形成高脂血癥動物模型，以普通飼料為正常對照（normal control，NC），以辛伐他汀為陽性對照（positive control，PC），以高直鏈玉米淀粉（high amylose maize starch，HMS）為普通對照，采用灌胃方式，研究3種生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠生理指標的影響，分別測定大鼠攝食量，體質(zhì)量增加量，大鼠血清中甘油三酯（total triglyeride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TCHO）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）及谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）水平等血脂指標；采用光學顯微鏡觀察血管、結(jié)腸和肝臟等組織病理學特征，并測定結(jié)腸絨毛長度、黏膜厚度等腸道形態(tài)學指標。在此基礎上，采用靶向代謝組學技術測定血清中25種初級和次級膽汁酸含量，構(gòu)建血清膽汁酸代謝輪廓譜，以期為生姜抗性淀粉調(diào)控腸道菌群介導膽汁酸代謝機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級SD雄性大鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物編號：20170005031590，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005。

新鮮生姜 福建省三明市大田生姜專業(yè)合作社；動物飼料 閩侯縣吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司；辛伐他汀上海信誼萬象藥業(yè)股份有限公司；蘇木素-伊紅染液（hematoxylin-eosin staining，HE） 武漢谷歌生物科技有限公司；碳酸利多卡因注射液 四環(huán)藥業(yè)股份有限公司；乙腈、甲醇 美國Fisher Scientific公司；其余試劑藥品均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

AU2700全自動生化分析儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國AB SCIEX公司；Viscotek TDA305max多檢測器凝膠滲透色譜儀英國Malvern公司；病理切片機 上海徠卡儀器有限公司；組織攤片機 浙江省金華市科迪儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗性淀粉的制備

生姜原淀粉、II型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 2，GRS2）、III型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 3，GRS3）、IV型生姜抗性淀粉（ginger resistant starch type 4，GRS4）的制備和純化方法參考常青[13]的方法進行，獲得的GRS2、GRS3和GRS4中抗性淀粉質(zhì)量分數(shù)分別為（95.78±2.44）%、（95.36±2.16）%和（92.46±1.97）%。

1.3.2 飼料的制備

高脂飼料配方：89.25%（質(zhì)量分數(shù)，下同）普通飼料、5.00%蛋黃粉、5.00%豬油、0.50%膽固醇和0.25%豬膽鹽。普通飼料符合GB 14924.3—2010《實驗動物 配合飼料營養(yǎng)成分》。

1.3.3 動物分組和給藥方法

動物實驗在福建中醫(yī)藥科學研究院比較醫(yī)學中心SPF級動物實驗室內(nèi)開展，動物實驗倫理審查編號：FJATCM-IAEC2020016。

動物分組和給藥方法如下：雄性大鼠84只，適應性飼養(yǎng)1周，期間自由飲水飲食。按體質(zhì)量隨機分成2組，一組12只給予基礎飼料，一組72只給予高脂飼料，喂養(yǎng)2周后，將基礎飼料組分別淘汰體質(zhì)量最高和最低的3只，剩余6只為NC組，繼續(xù)喂養(yǎng)普通飼料4周，每日灌胃生理鹽水2 mL/100 gmb。高脂飼料組喂養(yǎng)2周后，淘汰體質(zhì)量較高的肥胖敏感大鼠18只和體質(zhì)量較低的肥胖抵抗大鼠18只，剩余36只大鼠隨機分為6組，每組6只。

高脂模型（hyperlipidemic model，HM）組：喂養(yǎng)高脂飼料4周，每日灌胃生理鹽水2 mL/100 gmb。

PC組：繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，同時給予4 mg/kg辛伐他?。ㄐ练ニ?0 mg/片，溶于50 mL蒸溜水中，得0.2 mg/mL懸液），灌胃劑量為2.0 mL/100 gmb，每日1次，共喂養(yǎng)4周。

GRS2、GRS3、GRS4、HMS組：繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)4周，同時分別灌胃GRS2、GRS3、GRS4、HMS淀粉懸濁液（0.125 g/mL），灌胃劑量為0.25 g/100 gmb，每日1次，共喂養(yǎng)4周。

淀粉灌胃劑量0.25 g/100 gmb是根據(jù)中國居民膳食指南中60 kg成人每日推薦膳食纖維攝入量20～35 g/d和其他抗性淀粉最佳劑量來確定的，如香蕉抗性淀粉等[14]。

1.3.4 體質(zhì)量和臟器指數(shù)的測定

在造模開始時（第1周）、給藥前（第3周）和給藥后（第7周），分別測定各組大鼠體質(zhì)量。4周給藥處理結(jié)束后，處死大鼠時，迅速分離肝臟、腎臟、脾臟、胸腺及心臟，用生理鹽水漂洗后，再用濾紙吸干表面水分，稱質(zhì)量。臟器指數(shù)計算如公式（1）所示。

1.3.5 大鼠血脂指標的測定

各組大鼠喂養(yǎng)2周后，禁食12 h但不禁水，眼眶取血1 mL置于裝有肝素鈉的離心管中，血樣送解放軍四七六醫(yī)院檢驗科測定血脂各項指標（包括TG、TCHO、HDL-C、LDL-C濃度）。實驗期間，每日稱體質(zhì)量1次，調(diào)整給藥量。第7周處死時，取腹主動脈血清0.5 mL置于離心管中，血液標本送解放軍四七六醫(yī)院檢驗科測定血脂指標。

1.3.6 血管病理學觀察

取主動脈上端約1 cm，根據(jù)標準組織切片技術，固定于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中，主動脈組織固定7 d后，進行石蠟包埋，制作組織切片及HE染色，HE染色流程參照Zeng Hongliang等[15]的方法進行，用于血管病理學觀察。

1.3.7 結(jié)腸組織病理學觀察

制作結(jié)腸組織切片厚度為2～3 mm，將固定好的結(jié)腸組織用無菌水清洗后，分別經(jīng)70%（體積分數(shù)，下同）、80%、90%、100%乙醇梯度脫水1 h，脫水后在乙醇和二甲苯混合液（1∶1，V/V）中浸泡40 min，再放置于二甲苯中浸泡40 min。待組織透明后立刻浸蠟，在52～54、54～56 ℃和56～58 ℃ 3種不同熔點的石蠟中各處理2 h。待蠟塊接近凝固后放入水中加速凝固，修理、切片，約厚5～6 μm。結(jié)腸組織切片的染色和觀察參照黃燦燦[16]的方法進行。

1.3.8 肝臟組織病理學觀察

大鼠解剖取肝臟后，取面積約為0.5 cm厚度為4 μm的組織用生理鹽水清洗干凈，在清洗后用吸水紙將殘留液擦干后，用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛進行固定，密封過夜，然后經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、切片、貼片、HE染色和固封等處理后制作肝臟組織切片。光學顯微鏡下從低到高倍數(shù)進行肝臟組織病理學觀察。

1.3.9 血清膽汁酸靶向代謝組學測定

1.3.9.1 膽汁酸標準液的配制

精確稱取膽汁酸標準品1 mg，加甲醇溶解并定容至1 mL，漩渦混勻，即可得標準品儲備溶液。

取上述標準品儲備溶液各10 μL，加體積分數(shù)50%甲醇稀釋至1 mL，得10 000 ng/mL工作液；再逐步稀釋得標準品質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000 ng/mL工作液，裝入1.5 mL的離心管中，待用。

采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用進行檢測，具體參數(shù)如下：色譜條件：LC30A色譜儀，Waters BEH C18色譜柱（150 mm×2.1 mm、1.7 μm），柱溫40 ℃，進樣量為1 μL。流動相A（0.1%（體積分數(shù)，下同）甲酸-水溶液），流動相B（0.1%甲酸-乙腈）。質(zhì)譜條件：QTRAP 6500+質(zhì)譜儀，采用負離子模式檢測，氣簾氣為35，噴撞氣為中等強度，離子化電壓為－4 500 V，溫度為500，噴霧氣為40，輔助加熱氣為50。標準品的總離子流圖如圖1所示。

圖1 膽汁酸標準品總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of bile acid standards

以目標標準溶液的色譜峰面積為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標繪制線性回歸標準曲線。標準曲線方程如表1所示，所有標準曲線方程的R2均大于0.99，說明方程線性良好。

表1 膽汁酸標準品的線性方程Table 1 Linear calibration equations for bile acid standards

1.3.9.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測膽汁酸

精確移取100 μL血清樣本，加入400 μL甲醇，漩渦混勻30 s，低溫超聲30 min（5 ℃、40 kHz），－20 ℃靜置30 min，在4 ℃條件下13 000×g離心15 min，取上清液200 μL上機檢測。實驗采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，對樣品中的目標物進行定性定量檢測，色譜與質(zhì)譜參數(shù)條件同1.3.9.1節(jié)。色譜流動相梯度如表2所示，流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為0.1%甲酸-乙腈。

表2 液相色譜檢測膽汁酸的流動相梯度Table 2 Gradient mobile phase program for liquid chromatography of bile acids

1.3.9.3 膽汁酸質(zhì)量濃度的計算

在定量軟件SCIEX OS中采用默認參數(shù)對各離子碎片進行自動識別和積分，并輔助人工檢查。以分析物的質(zhì)譜峰面積為縱坐標，以分析物的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制線性回歸標準曲線。將樣品分析物的質(zhì)譜峰面積，代入線性方程中，計算上樣溶液中膽汁酸的質(zhì)量濃度。血清中的膽汁酸質(zhì)量濃度計算如公式（2）所示。

式中：ρ為上機測定的質(zhì)量濃度/（ng/mL）；V1為定容的體積/mL；V2為取樣體積/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用CaseViewer成像軟件和圖像分析系統(tǒng)定量分析血管、結(jié)腸、肝臟的染色組織切片。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和多重比較。采用OriginPro 8.5及GraphPad Prism 8.0軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血癥大鼠模型的建造

高脂飼料喂養(yǎng)2周后大鼠的血脂指標如表3所示，相對于正常飼料喂養(yǎng)組，高脂飼料組的大鼠TG、TCHO和LDL-C濃度顯著增大（P＜0.05），而高脂飼料組大鼠血脂指標HDL-C濃度顯著降低（P＜0.05）。這表明采用高脂飼料喂養(yǎng)大鼠2周后可成功造成高脂血癥大鼠模型，這與金柑多糖降血脂機制中高脂血癥大鼠的造模結(jié)果[15]一致。

表3 高脂飼料喂養(yǎng)兩周對大鼠血脂指標的影響Table 3 Effect of high-fat diet feeding for two weeks on lipid profile in rats

2.2 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響

生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響如表4所示，造模開始時，各適應性喂養(yǎng)1周的大鼠的體質(zhì)量無顯著性差異，體質(zhì)量均在130 g左右。采用高脂飼料喂養(yǎng)2周后，給藥前的高脂血癥大鼠的體質(zhì)量顯著高于NC組的大鼠體質(zhì)量（P＜0.05），而HM、PC、GRS2、GRS3、GRS4組和HMS組大鼠體質(zhì)量無顯著性差異。經(jīng)過4周的灌胃辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS，各組大鼠體質(zhì)量均高于NC組大鼠；相對HM組，PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠的體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05），其中，PC組和GRS4組大鼠體質(zhì)量最小，且兩組無顯著性差異（P＞0.05）。這表明生姜抗性淀粉能顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量，該結(jié)果與RS2型香蕉抗性淀粉[17]、RS3型鷹嘴豆抗性淀粉[18]和RS4型甘薯抗性淀粉[19]對高脂血癥動物體質(zhì)量影響結(jié)果一致，抗性淀粉可在一定程度上控制高脂動物的體質(zhì)量增長。

表4 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effect of ginger resistant starch on body mass in hyperlipidemic rats

2.3 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠臟器指數(shù)的影響

生姜抗性淀粉對高血脂癥大鼠肝臟、腎臟、脾臟、胸腺和心臟等臟器指數(shù)的影響如表5所示，經(jīng)過4周的給藥處理，各組大鼠的腎臟和心臟的臟器指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。相對于HM組大鼠，灌胃4周辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能顯著降低大鼠的肝臟指數(shù)（P＜0.05），PC組和GRS4組效果最佳，這表明高脂飼料會損害大鼠的肝臟，使之出現(xiàn)腫大現(xiàn)象，而生姜抗性淀粉可在一定程度上減輕大鼠的脂肪肝損傷，該結(jié)果與大米抗性淀粉對高脂小鼠肝臟指數(shù)影響的結(jié)果[20]一致。就脾臟指數(shù)來說，HM組大鼠顯著高于其他組大鼠，NC和PC組大鼠脾臟指數(shù)最低，且兩者無顯著差異；生姜抗性淀粉組及HMS組之間無顯著性差異。NC組大鼠的胸腺臟器指數(shù)最低，其他組之間無顯著差異。這表明高脂飼料喂養(yǎng)會在一定程度上損害大鼠的免疫器官。

表5 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠臟器指數(shù)的影響Table 5 Effect of ginger resistant starch on visceral organ indexes of hyperlipidemic rats

2.4 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血脂指標的影響

生姜抗性淀粉對高血脂癥大鼠血脂指標的影響如表6所示，相對于HM組，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低大鼠血清的TG和TCHO濃度（P＜0.05），且3種生姜抗性淀粉組大鼠的TG和TCHO濃度均顯著小于HMS組大鼠，這表明生姜抗性淀粉能降低高脂血癥大鼠的血脂水平，尤其是GRS3和GRS4的效果最佳。HDL-C能將外周組織如血管壁內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟進行分解代謝，即膽固醇逆轉(zhuǎn)運，可減少膽固醇在血管壁的沉積[15]。由表6可知，PC、生姜抗性淀粉和HMS組大鼠的HDL-C濃度顯著高于HM組大鼠，且顯著高于NC組，這與其他抗性淀粉對大鼠血清HDL-C濃度的影響不一致，比如甘薯抗性淀粉組的HDL-C濃度低于NC組[21]。HDL-C可以將身體的膽固醇運輸?shù)缴眢w各個器官，來提高身體免疫力，防止動脈出現(xiàn)硬化的情況[22]。Zanoni等[23]發(fā)現(xiàn)在SCARB1基因缺失的人群中，雖然HDL-C濃度顯著高于正常人，但他們患心血管疾病的風險比常人更高，缺失了這個基因的人群無法利用HDL-C從外周運輸來的膽固醇，機體為了代償而產(chǎn)生更多HDL-C，以將更多的外周膽固醇運回肝臟。但事實是，產(chǎn)生更多的HDL-C也無法將外周膽固醇運回肝臟并代謝掉。因此，適當濃度水平的HDL-C才有益機體健康[24]。相對于HM組，灌胃PC、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低大鼠的LDL-C濃度，尤其是PC組大鼠的LDL-C濃度最低，這是因為辛伐他汀是通過抑制3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A，HMG-CoA）還原酶降低LDL-C濃度的他汀類藥物[25]。LDL-C則會把攜帶的膽固醇堆積在動脈壁上[26]，含量過高會引起動脈硬化，生姜抗性淀粉能夠降低這種風險。

表6 生姜抗性淀粉對高血脂癥大鼠血脂指標的影響Table 6 Effect of ginger resistant starch on blood lipid indexes in hyperlipidemic rats

生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠ALT和AST活力的影響如圖2所示，PC、GRS2、GRS3、GRS4組及HMS組大鼠血清AST、ALT含量均顯著低于HM組（P＜0.05）。當肝細胞發(fā)生炎癥、中毒、壞死等時會造成肝細胞的受損，轉(zhuǎn)氨酶便會釋放到血液里，使血清轉(zhuǎn)氨酶活力升高[27]。動物體內(nèi)最重要的轉(zhuǎn)氨酶為ALT和AST，二者活力都是肝功能測試的重要指標。生姜抗性淀粉可以降低血清中ALT和AST的活力，這說明生姜抗性淀粉可以減輕肝臟損傷。

圖2 生姜抗性淀粉對高血脂癥大鼠AST活力（A）和ALT活力（B）的影響Fig. 2 Effect of ginger resistant starch on the activities of AST (A) and ALT (B) in hyperlipidemic rats

2.5 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血管病理學影響

高脂血癥大鼠心臟動脈血管病理學顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示，NC組大鼠血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)連續(xù)且完整，血管層次清楚；內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮下未見炎癥細胞浸潤及脂質(zhì)性物質(zhì)；中層及血管外模結(jié)構(gòu)完整清晰，未見組織細胞脫落；血管中膜層菱形平滑肌細胞排列整齊，存在少量的纖維成分，未見脂肪細胞（圖3A）。HM組大鼠血管內(nèi)膜增厚并在血管內(nèi)呈現(xiàn)隆起、折疊狀態(tài)；血管外壁組織細胞松散脫落，細胞間隙增寬（圖3B紅色箭頭）；血管內(nèi)膜中存在水腫現(xiàn)象，有水泡狀細胞浸潤；血管中膜層存在大量圓形泡狀脂肪細胞，平滑肌細胞出現(xiàn)增生，細胞生長排列紊亂且穿透內(nèi)膜生長并向血管內(nèi)膜遷移；血管組織形態(tài)發(fā)生病變（圖3B）。PC組大鼠血管組織形態(tài)經(jīng)藥物灌胃得到有效改善，血管層次、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及血管外壁較HM組有所改善。以上結(jié)果與金柑多糖對高脂血癥大鼠血管病理學影響的結(jié)果[15]一致。GRS2組和HMS組中可見少量圓形泡狀脂肪細胞（圖3D、G紅色箭頭），其泡狀脂肪細胞明顯少于HM組（圖3C）。經(jīng)生姜抗性淀粉GRS3、GRS4組灌胃后的高脂血癥大鼠血管狀態(tài)均有不同程度的改善，血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)連續(xù)且完整，血管層次清楚（圖3E、F），且生姜抗性淀粉效果優(yōu)于HMS。

圖3 高脂血癥大鼠血管病理學觀察結(jié)果Fig. 3 Observation of vascular pathology in hyperlipidemic rats

2.6 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠結(jié)腸組織病理學的影響

大鼠結(jié)腸位于右髂窩內(nèi)，續(xù)于盲腸，在第3骶椎平面連接直腸，由升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和乙狀結(jié)腸4 段組成，結(jié)腸大部分固定于腹后壁[28]。結(jié)腸橫切面由內(nèi)到外依次為：黏膜（包括上皮層、固有層、黏膜肌層）、黏膜下層（為疏松的結(jié)締組織）、肌層（為內(nèi)環(huán)形、外縱行兩層平滑?。┖屯饽ぃòɡw維膜或漿膜）[29]。生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)的影響如圖4所示，NC組大鼠結(jié)腸肌層厚，組織結(jié)構(gòu)緊密，細胞排列整齊；結(jié)腸絨毛在結(jié)腸內(nèi)呈折疊狀態(tài)整齊排列，絨毛與黏膜連接緊密（圖4A箭頭）。HM組大鼠結(jié)腸肌層較NC組薄，基層外表面組織結(jié)構(gòu)松散，杯狀細胞數(shù)量明顯減少，細胞有脫落現(xiàn)象，結(jié)腸絨毛稀疏，僅在結(jié)腸內(nèi)表面附著，結(jié)腸內(nèi)空間空洞（圖4B方框和箭頭），由此可知，高脂膳食破壞了大鼠結(jié)腸黏膜層的完整性，對結(jié)腸結(jié)構(gòu)造成了損傷。PC組大鼠結(jié)腸肌層、黏膜及絨毛狀態(tài)均有所改善（圖4C箭頭）。經(jīng)生姜抗性淀粉GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血癥大鼠結(jié)腸狀態(tài)較HM組有明顯改善，結(jié)腸組織隱窩和杯狀細胞結(jié)構(gòu)清晰，其肌層厚度、黏膜厚度及絨毛長度增加（圖4D～F箭頭）。HMS組大鼠結(jié)腸組織有一定的程度的損傷，結(jié)腸內(nèi)容出現(xiàn)了糜爛（圖4G方框），杯狀細胞數(shù)量明顯減少，且結(jié)構(gòu)不清晰，基底層變薄，絨毛長度變短（圖4G箭頭）。

圖4 高脂血癥大鼠結(jié)腸組織病理學觀察Fig. 4 Histopathological observation of colon tissue in hyperlipidemic rats

通過CaseViewer圖像分析系統(tǒng)對各組大鼠結(jié)腸肌層厚度、黏膜厚度和絨毛長度進行測定，測定結(jié)果如圖5所示，生姜抗性淀粉組和PC組大鼠的結(jié)腸肌層厚度、結(jié)腸黏膜厚度和結(jié)腸絨毛長度顯著高于HM組大鼠，且生姜抗性淀粉GRS3對大鼠結(jié)腸黏膜和肌層的保護效果最好。其原因可能是生姜抗性淀粉的添加調(diào)節(jié)了結(jié)腸腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)，改變腸道微環(huán)境，使結(jié)腸絨毛長度及狀態(tài)得到保護，提高了結(jié)腸對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，從而改善了結(jié)腸肌層及黏膜狀態(tài)，使結(jié)腸的功能得到顯著提高。該結(jié)論與薏苡仁抗性淀粉對高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)影響的結(jié)果[30]一致。

圖5 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠結(jié)腸形態(tài)的影響Fig. 5 Effect of ginger resistant starch on colonic morphology in hyperlipidemic rats

2.7 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠肝臟組織病理學影響

高脂血癥大鼠肝臟病理學顯微鏡觀察結(jié)果（放大100 倍）如圖6所示，NC組大鼠肝臟組織及細胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉輪廓清晰，肝細胞結(jié)構(gòu)完整清晰并呈多邊形，細胞邊界清晰，細胞核位于細胞中央形狀呈圓形，細胞質(zhì)豐富清澈，肝索以中央靜脈為中心成放射狀向四周排列（圖6A方框）。HM組大鼠均出現(xiàn)了一定的肝細胞代謝病變，大鼠肝臟小葉輪廓不清晰，肝細胞著色較正常細胞著色淺，胞漿顏色淺淡，細胞質(zhì)中出現(xiàn)了大小不等的圓形脂肪空泡（圖6B箭頭），肝細胞體積較正常肝細胞變大變圓，細胞核偏離細胞中心而被擠在細胞邊緣，肝竇明顯變窄或消失，腺泡內(nèi)多見點狀或灶狀壞死，匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細胞浸潤現(xiàn)象，并見明顯的肝纖維化，肝小葉中央靜脈周顯現(xiàn)膽固醇結(jié)晶。PC組大鼠的肝臟細胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞質(zhì)中的脂肪泡的數(shù)量較HM組明顯減少（圖6C箭頭），肝細胞染色加深，細胞水樣病變顯現(xiàn)消失，細胞核回歸細胞中心位置，肝細胞腺泡病變壞死現(xiàn)象消失；GRS2組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞質(zhì)中的脂肪泡大小及數(shù)量較HM組明顯減少（圖6D箭頭），肝細胞著色深，肝臟小葉輪廓清晰，細胞核未見偏離細胞中心，肝臟病變現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)。GRS3組大鼠肝細胞結(jié)構(gòu)清晰完整，細胞質(zhì)中僅見少量脂肪泡（圖6E箭頭所示），肝臟小葉輪廓清晰，肝竇形狀未見變窄，肝臟病變好轉(zhuǎn)。GRS4組（圖6F）大鼠肝臟病變現(xiàn)象明顯好轉(zhuǎn)，細胞質(zhì)中未見圓形脂肪泡，肝匯區(qū)炎癥現(xiàn)象消失，肝細胞著色深，肝臟小葉輪廓清晰。HMS組大鼠肝細胞病變現(xiàn)象稍有好轉(zhuǎn)，細胞質(zhì)中仍可見一定數(shù)量的圓形脂肪空泡（圖6G箭頭）。以上結(jié)果與紫花蕓豆抗性淀粉對高脂血癥大鼠肝臟及腸屏障損傷的修復作用中肝臟病理學觀察結(jié)果[31]一致。結(jié)果表明，對大鼠長期進行高脂喂養(yǎng)，經(jīng)過消化吸收后的一部分脂肪進入肝臟，脂肪進入肝臟后貯存并形成脂肪肝，造成肝臟的一系列病變。經(jīng)GRS2、GRS3、GRS4灌胃后的高脂血癥大鼠，其肝臟細胞質(zhì)中的脂肪空泡數(shù)量較HM組明顯減少，脂肪空泡明顯變小，3種生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠肝臟保護作用較HMS的效果好。

圖6 高脂血癥大鼠肝臟組織病理學觀察Fig. 6 Histopathological observation of liver tissue in hyperlipidemic rats

2.8 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清初級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響

采用靶向代謝組學技術測定25種膽汁酸，其中，初級膽汁酸10種、次級膽汁酸15種。生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清初級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響如圖7所示，各組中游離型初級膽汁酸（膽酸、鵝脫氧膽酸、β-鼠膽酸和α-鼠膽酸）質(zhì)量濃度明顯高于結(jié)合型初級膽汁酸（?；悄懰?、?；?α-鼠膽酸、?；?β-鼠膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸）質(zhì)量濃度，這表明，大鼠血清中主要以游離型初級膽汁酸為主[32]。生姜抗性淀粉組大鼠血清中游離型初級膽汁酸整體上顯著低于HM組大鼠，尤其是GRS3和GRS4組大鼠，這與生姜抗性淀粉對高血脂癥大鼠血脂指標影響的結(jié)果一致。PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中?；悄懰帷⑴；?α-鼠膽酸、甘氨膽酸等結(jié)合型初級膽汁酸質(zhì)量濃度無顯著差異。PC組、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中?；?β-鼠膽酸質(zhì)量濃度均顯著低于HM組大鼠，而GRS4和HMS組大鼠的?；蛆Z脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸卻顯著高于HM組大鼠，這可能與膽汁酸之間的轉(zhuǎn)化有關[33]。以上結(jié)果表明，生姜抗性淀粉主要是通過降低血清中的游離型初級膽汁酸來調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂代謝。

圖7 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清初級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響Fig. 7 Effect of ginger resistant starch on serum primary bile acid contents in hyperlipidemic rats

2.9 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清次級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響

生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清次級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響如圖8所示，高脂血癥大鼠血清中主要含有脫氧型次級膽汁酸，如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、?；秦i脫氧膽酸、鼠脫氧膽酸、?；敲撗跄懰?、甘氨熊脫氧膽酸和甘氨脫氧膽酸等，其中，豬脫氧膽酸和熊脫氧膽酸等游離型脫氧型次級膽汁酸的質(zhì)量濃度最高。相對于HM組，PC、生姜抗性淀粉組和HMS組大鼠血清中豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、ω-鼠膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸、別膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、豬膽酸、石膽酸和7-酮基石膽酸等質(zhì)量濃度整體上顯著降低，其中，GRS3、GRS4組和HMS組降低血清中上述次級膽汁酸質(zhì)量濃度的效果最佳。而GRS2組大鼠血清中次級膽汁酸7-脫氫膽酸、鼠脫氧膽酸和熊果膽酸等質(zhì)量濃度高于HM組。GRS2能夠增加大鼠血漿中上述次級膽汁酸的質(zhì)量濃度，可能是因為其可影響結(jié)腸中微生物組成和結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)肝腸軸中膽汁酸組成和質(zhì)量濃度的變化[34]。GRS3和GRS4主要降低大鼠血清中脫氧型次級膽酸（如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸和甘氨熊脫氧膽酸等）質(zhì)量濃度。

圖8 生姜抗性淀粉對高脂血癥大鼠血清次級膽汁酸質(zhì)量濃度的影響Fig. 8 Effect of ginger resistant starch on serum secondary bile acid contents in hyperlipidemic rats

3 結(jié) 論

本實驗研究表明，相對HM組，辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS能顯著降低高脂血癥大鼠的體質(zhì)量和肝臟指數(shù)，辛伐他汀和GRS4效果最佳。辛伐他汀、生姜抗性淀粉和HMS均能顯著降低高脂血癥大鼠血清的TG、TCHO、LDL-C濃度，顯著降低ALT和AST活力，顯著提高HDL-C含量，GRS3和GRS4的效果最佳。由組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，GRS3和GRS4能改善高脂血癥大鼠血管層次、內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及血管外壁結(jié)構(gòu)；增加結(jié)腸肌層厚度、黏膜厚度及絨毛長度，使結(jié)腸組織隱窩和杯狀細胞結(jié)構(gòu)清晰；減少肝臟細胞質(zhì)中的脂肪空泡數(shù)量和大小，且效果優(yōu)于HMS。此外，生姜抗性淀粉GRS3和GRS4能夠顯著降低血清中的游離型初級膽汁酸（如膽酸、鵝脫氧膽酸、β-鼠膽酸和α-鼠膽酸）和脫氧型次級膽酸（如豬脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、脫氧膽酸、牛磺豬脫氧膽酸和甘氨熊脫氧膽酸）的質(zhì)量濃度，GRS3和GRS4主要通過降低血清中的游離型初級膽汁酸和脫氧型次級膽酸含量來改善高脂血癥大鼠的血脂代謝。