李 素，王守偉，朱 寧，吳倩蓉，陳 松，臧明伍，趙 冰,3，張順亮，喬曉玲,*，潘曉倩，劉 夢(mèng)，劉博文

（1.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京 100068；2.河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司，河南 漯河 462000；3.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068）

醬牛肉是我國(guó)重要的傳統(tǒng)肉制品，此類產(chǎn)品具有風(fēng)味獨(dú)特、高蛋白、低脂肪的特點(diǎn)，同時(shí)含有豐富的礦物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。加工工藝的差異會(huì)影響醬牛肉的營(yíng)養(yǎng)成分和質(zhì)構(gòu)特性等食用品質(zhì)，而二次殺菌后產(chǎn)品品質(zhì)劣變更為嚴(yán)重，比如生成高溫蒸煮味和組織質(zhì)地變差等。為改善醬牛肉產(chǎn)品食用品質(zhì)，探究其品質(zhì)劣變機(jī)理，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了部分研究。陳立業(yè)等[1]發(fā)現(xiàn)定量鹵制工藝的醬牛肉食用品質(zhì)優(yōu)于常規(guī)煮制的醬牛肉；有學(xué)者發(fā)現(xiàn)超聲波輔助腌制可有效地提升醬牛肉的食用品質(zhì)[2-3]。經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，針對(duì)醬牛肉產(chǎn)品風(fēng)味成分分析的相關(guān)研究較多，Zou Yunhe等[4]研究了超聲輔助腌制對(duì)辣牛肉風(fēng)味物質(zhì)的影響；吳倩蓉等[5]研究了加工工藝對(duì)醬牛肉中蛋白質(zhì)降解及風(fēng)味物質(zhì)的影響；Zang Mingwu[6]等對(duì)7種典型五香醬牛肉的揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行了研究。高溫殺菌技術(shù)可以有效延長(zhǎng)產(chǎn)品貨架期，不同的殺菌條件可以影響產(chǎn)品的風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)等特性[7-9]，也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)及產(chǎn)品結(jié)構(gòu)造成較大程度的破壞。蛋白質(zhì)是肉制品中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，肉品中蛋白質(zhì)特性對(duì)肉制品的食用品質(zhì)有重要影響[10-11]。為深入了解加工工藝對(duì)蛋白質(zhì)影響機(jī)理，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了一些研究，其中，Sharedeh等[12]對(duì)滾揉腌制促進(jìn)肉的鹽分滲透效果進(jìn)行了評(píng)估；Deb-Choudhury等[13]分析了pH值、溫度和時(shí)間對(duì)食品中蛋白質(zhì)品質(zhì)特性的影響；康懷彬等[14]以牛背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)高溫加熱能顯著改變牛肉蛋白質(zhì)的化學(xué)作用力及肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)。但是，經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，鮮有針對(duì)醬牛肉產(chǎn)品從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化角度開(kāi)展的加工工藝影響其品質(zhì)的機(jī)理研究。此外，肌肉的微觀結(jié)構(gòu)由肌纖維、水分、蛋白質(zhì)等組成，肉制品水分分布情況也會(huì)影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[15]和產(chǎn)品的食用品質(zhì)[16]，因此，低場(chǎng)核磁共振弛豫測(cè)量法也被廣泛用于肌肉和肉中水分分布和流動(dòng)性變化分析。

醬牛肉加工過(guò)程中會(huì)發(fā)生質(zhì)量損失、蛋白變性、質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味變化等一系列物理化學(xué)變化[17-18]，部分變化會(huì)使得產(chǎn)品品質(zhì)發(fā)生劣變。蛋白質(zhì)是醬牛肉中的主要成分之一，深入分析加工過(guò)程中產(chǎn)品蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，有助于明確醬牛肉品質(zhì)形成機(jī)理，也可以為其他牛肉類高溫產(chǎn)品生產(chǎn)加工提供參考。鑒于鮮有針對(duì)傳統(tǒng)醬牛肉產(chǎn)品開(kāi)展的從原料至最終產(chǎn)品水分分布和蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究，本研究以醬牛肉為研究對(duì)象，選取原料肉和滾揉腌制、鹵制及不同二次殺菌溫度（90、100、110、120 ℃）樣品，對(duì)其蛋白質(zhì)濁度、相互作用力、結(jié)構(gòu)變化和水分分布的規(guī)律進(jìn)行研究，為醬牛肉產(chǎn)品品質(zhì)精細(xì)化調(diào)控提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛腱 河北福成五豐食品股份有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、Tris、KCl、尿素、NaOH、β-巰基乙醇國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

M2e多功能酶標(biāo)儀 德國(guó)MD公司；Sorvall LYNX4000高速離心機(jī)、Nicolet iS10傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；LGJ-30D冷凍干燥機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司；SU8020場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；NMI20-040-I核磁共振分析儀 上海紐邁電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

參照文獻(xiàn)[19]中方法進(jìn)行醬牛肉加工，其中滾揉腌制用水量為牛肉質(zhì)量的10%。依次對(duì)醬牛肉加工過(guò)程中原料肉、滾揉腌制樣品、鹵制樣品取樣，鹵制后產(chǎn)品采用4種溫度（90、100、110、120 ℃）殺菌20 min，殺菌完成后分別取樣。所選取7個(gè)取樣點(diǎn)的牛肉樣品（原料肉、滾揉腌制樣品、鹵制樣品、90 ℃殺菌樣品、100 ℃殺菌樣品、110 ℃殺菌樣品、120 ℃殺菌樣品）依次編號(hào)為A、B、C、D、E、F、G。

1.3.2 蛋白質(zhì)提取

參考Visessanguan等[20]的方法并適當(dāng)調(diào)整，取適量不同加工點(diǎn)的樣品絞碎，按1∶20（m/V）加入冷卻磷酸鹽緩沖液（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L NaH2PO4），10 000 r/min勻漿2 min，然后離心（4 ℃、8 000 r/min，7 min），收集上清液為肌漿蛋白溶液；沉淀部分繼續(xù)加入20 倍體積的冷卻提取液（15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L NaH2PO4、0.7 mol/L NaCl），10 000 r/min勻漿2 min，4 ℃靜置過(guò)夜后離心，上清液為肌原纖維蛋白溶液。將制備的兩種蛋白溶液經(jīng)冷凍干燥得到蛋白質(zhì)凍干粉，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白含量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，取3次測(cè)定結(jié)果的平均值，蛋白質(zhì)凍干粉密封后－20 ℃下貯藏備用。

1.3.3 濁度的測(cè)定

取各樣品蛋白質(zhì)凍干粉，參照文獻(xiàn)[21]中方法測(cè)定濁度，平行測(cè)定3次，以350 nm波長(zhǎng)處吸光度A350nm表示濁度。

1.3.4 相互作用力相對(duì)含量的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[20]的方法并適當(dāng)調(diào)整，結(jié)果取3次測(cè)定結(jié)果的平均值。

溶液配制：配制6 mol/L的KCl溶液為S1反應(yīng)液；配制20 mmol/L Tris溶液調(diào)節(jié)pH值至8.0為S2反應(yīng)液；配制pH 8.0、含1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的20 mmol/L Tris溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0即S3反應(yīng)液；配制pH 8.0、含1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS和8 mol/L尿素的20 mmol/L Tris溶液，即S4反應(yīng)液；配制pH 8.0、含1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS、8 mol/L尿素和2%（體積分?jǐn)?shù)）β-巰基乙醇20 mmol/L Tris溶液，即S5反應(yīng)液；0.5 mol/L NaOH為S6反應(yīng)液。

樣品處理：取牛肉樣品各2.00 g，分別加入20 mL上述反應(yīng)液于室溫下振搖4 h，其中加入S5反應(yīng)液的樣品需先沸水浴2 min。樣品振搖結(jié)束后以6 000 r/min離心10 min，取上清液4 mL轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)50%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），使TCA終體積分?jǐn)?shù)為10%，樣品于4 ℃下靜置18 h后離心（4 ℃、3 000 r/min，3 min），棄去上清液，向沉淀中分次加入0.5 mol/L NaOH，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶定容，采用雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度，即不同反應(yīng)液中蛋白質(zhì)溶解度，以S1～S5反應(yīng)液中蛋白質(zhì)溶解度占S6反應(yīng)液中蛋白質(zhì)溶解度的百分比分別表征靜電相互作用力、范德華力、氫鍵、疏水相互作用力和二硫鍵相對(duì)含量。

1.3.5 掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)

取各樣品蛋白質(zhì)凍干粉粘貼于樣品銅臺(tái)，進(jìn)行真空離子濺射噴金處理，電壓為3 kV，鍍膜2～3 min后進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，放大倍數(shù)為5 000 倍，電子顯微鏡圖比例尺為10 μm。

1.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定

利用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定蛋白質(zhì)凍干粉的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。1 600～1 639 cm－1波段代表β-折疊結(jié)構(gòu)；1 640～1 650 cm－1波段代表無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（C=O與水形成氫鍵）；1 651～1 660 cm－1波段代表α-螺旋結(jié)構(gòu)；1 661～1 700 cm－1波段代表β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，根據(jù)峰面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。

1.3.7 水分分布的測(cè)定

將牛肉樣品切成長(zhǎng)寬高約1 cm×1 cm×2 cm的肉塊，置于核磁共振成像儀永磁場(chǎng)中心位置的射頻線圈中心，進(jìn)行磁共振波譜測(cè)定，共振頻率18 MHz，磁體強(qiáng)度0.5 T，線圈直徑為40 mm，磁體溫度為（32.00±0.01）℃。采用核磁共振分析軟件中的CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈沖序列測(cè)定樣品中的橫向弛豫時(shí)間T2，CPMG脈沖序列參數(shù)為：主頻23 MHz、偏移頻率286.781 3 kHz、90°脈沖時(shí)間17 μs，180°脈沖時(shí)間35 μs；采樣點(diǎn)數(shù)54 996；重復(fù)時(shí)間3 000 ms；累加次數(shù)4次；回波數(shù)2 000。結(jié)果取3次樣品測(cè)定的平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Orign 8.0軟件進(jìn)行繪圖，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著，利用Peakfit v4.12軟件分峰擬合，計(jì)算蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)濁度變化

吸光度可以用來(lái)反映蛋白質(zhì)聚集的程度，吸光度增加表示形成了大的聚合物。濁度可以反映蛋白質(zhì)溶液中懸浮粒子的大小及數(shù)量，蛋白分散時(shí)懸浮顆粒直徑小，濁度低；蛋白聚集后，懸浮顆粒直徑變大，濁度也對(duì)應(yīng)升高[22]。本研究用A350nm表征體系濁度。從圖1中可看出，醬牛肉加工過(guò)程中肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的濁度變化趨勢(shì)接近，原料肉質(zhì)中蛋白質(zhì)濁度較高，說(shuō)明原料肉中蛋白質(zhì)處于聚集狀態(tài)，懸浮顆粒直徑較大。滾揉工藝可以使蛋白質(zhì)濁度顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明通過(guò)滾揉過(guò)程蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被打散，溶解度增加，從而獲得較低的濁度。經(jīng)熱加工后濁度增高，說(shuō)明熱處理致使蛋白大量發(fā)生聚集、交聯(lián)、絮凝等變化，從而使蛋白溶液濁度上升。經(jīng)過(guò)二次殺菌后蛋白質(zhì)濁度呈波動(dòng)變化趨勢(shì)，其中，90 ℃殺菌樣品與110 ℃殺菌樣品濁度較高，100 ℃殺菌樣品和120 ℃殺菌樣品濁度較低，隨殺菌溫度升高，樣品濁度變化無(wú)明顯規(guī)律，說(shuō)明不同殺菌溫度條件下蛋白質(zhì)內(nèi)部基團(tuán)暴露程度可能有所不同，主要相互作用力也不同，從而影響了蛋白聚集體的差異。馬海霞等[23]對(duì)烏賊肌原纖維蛋白不同加熱溫度下的濁度變化進(jìn)行了研究，也發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高濁度升高，但達(dá)到一定溫度后濁度開(kāi)始有所降低。

圖1 醬牛肉樣品蛋白質(zhì)濁度變化Fig. 1 Changes in turbidity of sarcoplasmic and myofibrillar protein from spiced beef

2.2 蛋白質(zhì)相互作用力的變化

相互作用力可以影響蛋白質(zhì)在不同溶劑中溶解度，醬牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)分子間相互作用力會(huì)發(fā)生不同程度變化，進(jìn)而影響其品質(zhì)和加工性能。從圖2可以看出，樣品熟制前S1反應(yīng)液中蛋白質(zhì)溶解度較高，說(shuō)明蛋白質(zhì)間相互作用力主要是靜電相互作用力，且滾揉工藝顯著加強(qiáng)了蛋白質(zhì)間的靜電相互作用力（P＜0.05），熟制后蛋白質(zhì)溶解度顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明熱處理可以削弱蛋白質(zhì)間的靜電相互作用力，不同溫度二次殺菌后樣品中蛋白質(zhì)溶解度無(wú)顯著差異（P＞0.05）。S2反應(yīng)液用于提取水溶性蛋白質(zhì)，S2反應(yīng)液中變化趨勢(shì)與S1反應(yīng)液類似，即熟制前溶解度較高，熟制后溶解度降低，且滾揉工藝可以增加其溶解度；經(jīng)煮制及殺菌等熱處理后溶解度降低，說(shuō)明蛋白質(zhì)多肽鏈發(fā)生伸展和去折疊，改變了蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)，使其發(fā)生變性和聚集[24-25]，從而溶解度降低。原料肉中蛋白在S3反應(yīng)液中溶解度最高，說(shuō)明氫鍵是原料肉中主要相互作用力，且滾揉工藝顯著增加了蛋白質(zhì)間氫鍵相互作用力（P＜0.05），經(jīng)熟制后蛋白質(zhì)在S3反應(yīng)液中溶解度明顯降低，說(shuō)明高溫使氫鍵發(fā)生了斷裂，致使其含量急劇減少，這與其他學(xué)者研究結(jié)果[14,26]一致，但本研究中不同殺菌溫度處理后氫鍵含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。S4反應(yīng)液體系中的蛋白溶解度體現(xiàn)蛋白質(zhì)間疏水相互作用力，原料肉中疏水作用力最低，經(jīng)滾揉加工后疏水相互作用力增加，說(shuō)明滾揉工藝可以促進(jìn)疏水基團(tuán)的暴露，促進(jìn)疏水相互作用力提升，經(jīng)鹵制工藝后疏水相互作用力大幅降低，可能是由于較高的加熱溫度使得疏水基團(tuán)周?chē)乃肿佑行蚨冉档蚚27]；經(jīng)二次殺菌的樣品，隨溫度升高，疏水相互作用力有緩慢降低的趨勢(shì)（P＞0.05），也可能是由于殺菌過(guò)程中壓力的增加使得蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐步加強(qiáng)，蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)被改變[28]。蛋白質(zhì)在S5反應(yīng)液中溶解度均處于較高水平，用于表示蛋白質(zhì)間的二硫鍵，研究發(fā)現(xiàn)，原料肉中二硫鍵含量較低，經(jīng)滾揉和熱處理后其含量顯著升高（P＜0.05），可能是蛋白質(zhì)溶解度增高，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，暴露的巰基通過(guò)二硫鍵形成聚集，有研究表明熱處理可以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵的生成[29]。不同二次殺菌溫度對(duì)二硫鍵無(wú)顯著影響（P＞0.05）。

圖2 醬牛肉樣品中蛋白質(zhì)分子間相互作用力變化Fig. 2 Changes of protein-protein interactions in spiced beef

2.3 蛋白質(zhì)掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

醬牛肉加工過(guò)程中蛋白質(zhì)會(huì)發(fā)生不同程度變性，致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞。加工過(guò)程中肌漿進(jìn)行觀察蛋白及肌原纖維蛋白的微觀結(jié)構(gòu)采用掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。在不同的加工步驟下，肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的結(jié)構(gòu)有很大的不同，隨著加熱工藝的進(jìn)行，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸變得緊密，蛋白質(zhì)之間的連接增強(qiáng)，孔洞數(shù)目增多，孔徑減小，微觀結(jié)構(gòu)更加均勻細(xì)膩。

由圖3可知，原料樣品肌漿蛋白顆粒結(jié)構(gòu)完整，表面比較平滑，聚集度較好，質(zhì)地圓潤(rùn)，飽滿且結(jié)構(gòu)緊密。經(jīng)滾揉工藝加工后肌漿蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，開(kāi)始出現(xiàn)孔洞，蛋白質(zhì)質(zhì)地及光澤度也開(kāi)始下降。經(jīng)鹵制后蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步遭到破壞。樣品經(jīng)二次殺菌后其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞程度更高，蛋白質(zhì)顆粒破碎的更小、更細(xì)，此時(shí)，肌漿蛋白大部分變性，形成一種致密的結(jié)構(gòu)，殺菌溫度越高，肌漿蛋白質(zhì)變性程度越高。

圖3 醬牛肉樣品肌漿蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig. 3 Scanning electron microscopic images of sarcoplasmic proteins in spiced beef

從圖4中可以看出，原料樣品肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)比較完整，經(jīng)滾揉工藝后肌原纖維蛋白開(kāi)始斷裂，出現(xiàn)不規(guī)則孔洞。樣品經(jīng)鹵制后蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)開(kāi)始變得粗糙，邊緣不規(guī)則，有明顯的斷層感。樣品經(jīng)二次殺菌后蛋白結(jié)構(gòu)再次發(fā)生變化，經(jīng)90 ℃殺菌樣品中蛋白從各個(gè)方向進(jìn)行交聯(lián)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)逐漸開(kāi)始變得致密，隨著殺菌溫度逐漸升高，肌原纖維蛋白開(kāi)始形成規(guī)則形狀，分布也逐漸變得均勻，無(wú)明顯孔洞，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加致密均勻。

圖4 醬牛肉肌原纖維蛋白掃描電子顯微鏡圖Fig. 4 Scanning electron microscopic images of myofibrillar proteins in spiced beef

2.4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

醬牛肉加工過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的傅里葉變換紅外光譜如圖5所示。不同樣品的紅外吸收光譜呈現(xiàn)顯著差異。樣品在紅外區(qū)出現(xiàn)多個(gè)特征吸收峰，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在酰胺I帶（1 660 cm－1附近）、酰胺II帶（1 300 cm－1附近、1 570 cm－1附近）、酰胺A帶（3 300 cm－1附近）等處均有吸收峰出現(xiàn)。與原料肉相比，滾揉腌制工藝降低了肌漿蛋白中酰胺A帶的峰值，但增加了肌原纖維蛋白中酰胺A帶的峰值；鹵制工藝同時(shí)增加肌漿蛋白和肌原纖維蛋白酰胺A帶的峰值。隨著二次殺菌溫度的升高，肌漿蛋白酰胺A帶峰值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，而肌原纖維蛋白酰胺A帶峰值呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，說(shuō)明醬牛肉加工過(guò)程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的氫鍵伸縮振動(dòng)發(fā)生變化。1 900～1 200 cm－1波段不同樣品間吸光度差異較大，說(shuō)明滾揉腌制、鹵制、二次殺菌工藝對(duì)蛋白質(zhì)中雙鍵的伸縮振動(dòng)影響不同，1 650 cm－1處吸收峰的差異主要是由C=O造成的，這可能與C=O結(jié)構(gòu)的改變，包括羰基的氧化等有關(guān)。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)反映了其主鏈原子的空間排布情況，不包括側(cè)鏈的構(gòu)象變化。通常采用α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲這4種結(jié)構(gòu)的變化表征蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[30]。紅外光譜圖酰胺I帶的峰主要是由羰基的伸縮振動(dòng)造成的[31]，可直觀反映蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，因此可以通過(guò)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例分析蛋白質(zhì)變性情況，從而確定醬牛肉加工工藝對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

圖5 醬牛肉肌漿蛋白和肌原纖維蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig. 5 Fourier transform infrared spectra of sarcoplasmic and myofibrillar proteins in spiced beef

由表1可知，原料肉中肌漿蛋白的無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量最低，為7.85%。樣品經(jīng)過(guò)滾揉腌制后，肌漿蛋白中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著下降（P＜0.05），β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量顯著增加（P＜0.05）；鹵制后其二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量與滾揉樣品相比無(wú)顯著變化（P＞0.05）；二次殺菌后樣品中肌漿蛋白的α-螺旋相對(duì)含量再次下降，無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量整體上升，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量也發(fā)生變化。以上變化說(shuō)明滾揉工藝使蛋白質(zhì)的有序結(jié)構(gòu)被破壞，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低，鹵制工藝未對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)形成進(jìn)一步的破壞作用，二次殺菌處理后，維持α-螺旋穩(wěn)定的氫鍵繼續(xù)發(fā)生斷裂，隨殺菌溫度升高，α-螺旋、β-折疊總相對(duì)含量呈逐漸降低趨勢(shì)，說(shuō)明肌漿蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性破壞程度逐漸增高，無(wú)序性增加。

表1 肌漿蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 1 Proportion of secondary structures in sarcoplasmic proteins

由表2可知，原料肉中肌原纖維蛋白的無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量（8.98%）較低，樣品經(jīng)過(guò)滾揉腌制后，各二級(jí)結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)與肌漿蛋白中各二級(jí)結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)一致，即α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量顯著下降（P＜0.05），β-折疊和無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量顯著增加（P＜0.05）；與滾揉樣品相比，鹵制后樣品中β-折疊、無(wú)規(guī)卷曲總相對(duì)含量顯著降低（P＜0.05）；二次殺菌樣品中隨著殺菌溫度的升高，各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化趨勢(shì)，與肌漿蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)變化趨勢(shì)不一致，說(shuō)明不同蛋白質(zhì)可能具有不同的特征結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)，加工工藝的改變對(duì)不同蛋白質(zhì)的影響可能存在差異。

表2 肌原纖維蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 2 Proportion of secondary structures in myofibrillar proteins

2.5 醬牛肉不同狀態(tài)水分分布

采用核磁共振對(duì)醬牛肉樣品中水分的變化進(jìn)行檢測(cè)分析，采用CPMG序列和T2反演軟件得到醬牛肉的T2圖譜。表3是醬牛肉加工不同工藝點(diǎn)T2圖譜的具體數(shù)值，T21為結(jié)合水弛豫時(shí)間（0.1～10.0 ms），T22為束縛水弛豫時(shí)間（10～100 ms），T23為自由水弛豫時(shí)間（＞100 ms），分別將不同弛豫時(shí)間范圍內(nèi)的峰面積（A）進(jìn)行歸一化處理來(lái)表征不同狀態(tài)水分含量。T21代表與醬牛肉中大分子緊密結(jié)合的水，T22代表與醬牛肉中大分子結(jié)合比較緊密的水（束縛水），T23代表在醬牛肉中亞顯微結(jié)構(gòu)之間的自由水。醬牛肉中A22在A總中的占比最大，說(shuō)明水分主要以束縛水狀態(tài)存在。T2可反映不同狀態(tài)水分的流動(dòng)性，T2越短，水的流動(dòng)性越差，相同狀態(tài)水分的弛豫時(shí)間越長(zhǎng)，說(shuō)明水與肌肉結(jié)合狀態(tài)越松散[15]。由表3可知，原料肉經(jīng)滾揉工藝后，樣品T22顯著增加（P＜0.05），T23無(wú)顯著變化（P＞0.05），但A23顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明滾揉工藝使肌肉中束縛水流動(dòng)性增加，即滾揉增強(qiáng)了樣品的保水性，而自由水流動(dòng)性不變，但自由水含量增加。鹵制后，樣品A21、A22顯著減小（P＜0.05），A23、T23顯著增加（P＜0.05），說(shuō)明束縛水和結(jié)合水含量均減少，自由水含量和流動(dòng)能力增加，可能是加熱使蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，改變了束縛水和結(jié)合水與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力。不同二次殺菌溫度樣品間A21差異顯著（P＜0.05），100 ℃殺菌樣品中結(jié)合水含量最低；90、110、120 ℃二次殺菌處理組A22差異不顯著（P＞0.05），100 ℃殺菌樣品中束縛水含量最低，自由水含量最高；經(jīng)二次殺菌后，醬牛肉樣品總峰面積差異不顯著（P＞0.05），100 ℃殺菌樣品中總水分含量最高。

表3 醬牛肉樣品水分分布狀態(tài)Table 3 Water distribution in spiced beef

3 結(jié) 論

醬牛肉加工過(guò)程中肌漿蛋白及肌原纖維蛋白的濁度變化趨勢(shì)接近，原料肉中蛋白濁度最高，滾揉工藝可以將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打散，使?jié)岫冉档?，?jīng)熱加工后濁度會(huì)逐漸增高。滾揉工藝可以提高加醬牛肉蛋白質(zhì)間的相互作用力，提高其穩(wěn)定性，熱處理前氫鍵、二硫鍵是主要作用力，熱處理后，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用力主要是氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵，且二硫鍵在整個(gè)加工過(guò)程中均對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定具有較高的貢獻(xiàn)度，不同二次殺菌溫度對(duì)氫鍵、疏水相互作用力、二硫鍵無(wú)顯著影響（P＞0.05）。從電子掃描顯微鏡結(jié)果可知，醬牛肉加工過(guò)程中滾揉、鹵制及殺菌工藝均會(huì)破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，工藝過(guò)程增多，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞越嚴(yán)重，二次殺菌溫度越高對(duì)其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。滾揉腌制、鹵制工藝可顯著影響醬牛肉樣品中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同二次殺菌溫度處理后對(duì)各二級(jí)結(jié)構(gòu)影響不同。醬牛肉樣品經(jīng)滾揉工藝后束縛水流動(dòng)性增加，自由水含量也增加；鹵制后束縛水和結(jié)合水含量減少，自由水含量和流動(dòng)能力增加；隨著二次殺菌溫度的升高，總水分含量變化不顯著（P＞0.05）。