朱樹良，趙昆昆，高古腔，屈成鑫，馬瑩瑩，任銳，鞏方平，李忠峰，馬興立，張幸果，殷冬梅

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州， 450002）

花生（Arachis hypogaeaL.）是我國重要的油料作物，為人民提供豐富的植物油和蛋白質(zhì)。近年來隨著人民生活水平的不斷提高以及消費(fèi)的多元化發(fā)展，人民對(duì)健康的需求日益提升，花生的保健功能也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。花生衣，即花生種皮，所含的單寧酸、白藜蘆醇、原花色素等成分在抗癌癥[1]、軟化血管、抗氧化減緩衰老[2]、防止血小板減少[3]等方面有廣泛的應(yīng)用，同時(shí)也應(yīng)用在護(hù)膚品領(lǐng)域。

花生衣有黑色、紫紅色、粉色、白色等多種顏色，通常情況下深顏色的種衣比淺色種衣具有更高的藥理和營養(yǎng)價(jià)值。研究表明花青素是影響花生種皮顏色深淺的主要因素[4]，花青素含量越高，種皮顏色越深，反之則越淺。花青素作為一種具有較高營養(yǎng)價(jià)值的物質(zhì)廣泛存在于各種植物中，與花生籽仁的營養(yǎng)價(jià)值直接相關(guān)。水稻花青素含量與其營養(yǎng)效應(yīng)呈正相關(guān)，顏色較深的紫色米營養(yǎng)價(jià)值最高[5～7]。洪美艷等[8]研究表明，黑籽油菜與黃籽油菜相比普遍具有較高含油量和較高蛋白含量等優(yōu)勢。

花生的種皮顏色是花生重要的外觀和品質(zhì)性狀。Zhao 等[9]確認(rèn)MYB 和EBG 通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控黃酮類合成途徑，使粉紅色色素沉著在花生籽粒表皮層中；Wang 等[10]使用QTL-seq 方法將控制種皮顏色的基因定位在A10 染色體的4.7 Mb 區(qū)域內(nèi)，并最終定位到一個(gè)與種皮顏色相關(guān)的基因AhTCI；Wan[11]等研究表明，激素合成和信號(hào)傳導(dǎo)以及MBW 復(fù)合物（MYB、bHLH 和WDR）調(diào)節(jié)的黃酮合酶和二氫黃酮醇4-還原酶之間的競爭是調(diào)節(jié)白色種皮表型的關(guān)鍵分子控制節(jié)點(diǎn)。

隨著圖像掃描技術(shù)水平的不斷提高和智能云計(jì)算技術(shù)的迅速普及，顏色識(shí)別被廣泛用于各行各業(yè)之中，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也已經(jīng)有大量的運(yùn)用。如對(duì)作物病斑分割[12]和識(shí)別，草莓、花椒和番茄等作物的采摘作業(yè)[13,14]、無人機(jī)水稻識(shí)別[15]。農(nóng)業(yè)顏色識(shí)別系統(tǒng)中主要采用RGB 顏色空間（Red，Green，Blue color mode）和HSV 顏色空間，其中HSV 的參數(shù)分別為色相（Hue）、飽和度（Saturation）、明度（Value）[16]；RGB的參數(shù)分別為紅色（Red）、綠色（Green）、藍(lán)色（Blue）。不同于RGB 的顏色空間，HSV 顏色空間中各個(gè)參數(shù)間有較強(qiáng)的獨(dú)立性，因此對(duì)復(fù)雜性高和相似性高的顏色識(shí)別更為準(zhǔn)確。

目前對(duì)花生種皮顏色的鑒定通常是肉眼觀察主觀判定，尤其是對(duì)不同種皮顏色群體后代的中間色很難界定。因此需要建立一種簡便、快捷的種皮顏色鑒定和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)利用阿里云智能云計(jì)算中的顏色識(shí)別平臺(tái)，結(jié)合HSV 顏色空間對(duì)花生種皮顏色進(jìn)行量化，從而快速、準(zhǔn)確地對(duì)花生群體后代種皮顏色進(jìn)行分級(jí)鑒定，為花生種皮顏色分子遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 花生材料 選取不同種皮顏色的花生品種（圖1）：農(nóng)大黑7572（黑色種皮）、Hua8106（紫色種皮）、ZP06（紫色種皮）、H7500（粉色種皮）、農(nóng)大花103（粉色種皮）、白沙1016（粉色種皮）、農(nóng)大白7626（白色種皮）、開白2號(hào)（白色種皮）。

圖1 不同花生種皮顏色總覽Fig.1 Overview of different peanut coat colors

RIL 群體：以紫色種皮花生品種ZP06 作為父本和粉色種皮花生品種H7500 進(jìn)行雜交，采用單粒傳法經(jīng)過六代自交后獲得的159個(gè)RIL家系群體。

1.1.2 花青素提取液 99%甲醇+1%濃鹽酸，甲醇與濃鹽酸體積比為99:1，即配制1 L的提取液需要向990 mL甲醇加入10 mL的濃鹽酸。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 紫外分光光度計(jì)（UV-3200PC）、尼康3100D相機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 花生種皮拍照和處理 分別隨機(jī)挑選5 ?；ㄉN子，在相同的光照條件下用尼康3100D 拍攝3 張圖片，利用Adobe Photoshop 2020 處理圖片，最終保存為PNG 格式。

1.2.2 花生種皮花青素提取 依據(jù)其它植物材料花青素的提取方法[17～21]并結(jié)合花生種皮特性進(jìn)行改良如下：隨機(jī)選取待測花生，將花生種皮取下并稱量100 mg 備用，用液氮將花生種皮研磨成粉末，將10 mL提取液與100 mg種皮粉末混合充分后30℃靜置90 min，12 000 r/min 離心2 min，吸取上清，用紫外分光光度計(jì)分別測定溶液在530 nm 和657 nm 下的吸光度值。利用吸光度值計(jì)算花青素相對(duì)含量（i），計(jì)算公式：

公式中FW為種皮稱取的重量（g）；A530為花青素的特異吸收峰值；V為提取液總體積（mL）；n為待測液稀釋倍數(shù)；ε為花青素的摩爾消光系數(shù)（26.9 mL/（mol·cm））；M為花青素的 相 對(duì)分子質(zhì)量，449.2；b為比色皿厚度（cm）。

1.2.3 AI 智能種皮顏色識(shí)別系統(tǒng)構(gòu)建 將拍攝處理后的圖片上傳至阿里視覺智能開放平臺(tái)中的顏色識(shí)別目錄下（aliyun. com），色板輸出數(shù)量選取8個(gè)，發(fā)起調(diào)用后記錄識(shí)別結(jié)果（包括Percentage、Color等參數(shù)），計(jì)算花生種皮顏色指數(shù)（p），計(jì)算公式：

公式中H、S、V均為HSV 顏色模型中的參數(shù)；p為不同顏色所占百分?jǐn)?shù)；MAX（H-15,0）為Excel中的函數(shù)，表示H經(jīng)過修正后最小值大于0。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用Microsoft Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，利用R_4.0.2繪制部分圖表，文中所有數(shù)據(jù)均有三次重復(fù)，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析以及顯著性檢驗(yàn)，Adobe illustrator 和Graph-Pad Prism 8繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種皮顏色花生花青素含量分析

由表1 可得不同顏色的種皮花青素含量為：黑色種皮＞紫色種皮＞粉色種皮＞白色種皮。農(nóng)大黑7572 花青素含量最高，為5.4545 mg/g，且與其他的花生均存在顯著性差異。白色種皮的花生（開白2號(hào)和農(nóng)大白7626）花青素含量最低，分別為0.0145和0.0148 mg/g。紫色種皮花生（Hua8106 和ZP06）的花青素含量比粉色種皮花生高，并且達(dá)到顯著性差異。

表1 不同種皮顏色花生花青素含量Table 1 Anthocyanin content of peanut with different seed coat colors/（mg/g）

根據(jù)種皮花青素提取液的顏色（圖2A），可以將花生分為四個(gè)組別，即黑（農(nóng)大黑7572）、紫（Hua8106、ZP06）、粉（白 沙1016、農(nóng) 大 花103、H7500）、白（開白2 號(hào)和農(nóng)大白7626）。另外，對(duì)相鄰界限的材料進(jìn)行比較（圖2B），發(fā)現(xiàn)農(nóng)大黑7527和Hua8106、ZP06與H7500、白沙1016與開白2號(hào)的花青素含量都存在顯著性差異；較為有趣的是粉色的H7500 的花青素含量顯著高于白沙1016 和農(nóng)大花103，白沙1016與農(nóng)大花103沒有顯著性差異。

圖2 不同種皮顏色花生花青素含量分析Fig.2 Analysis of anthocyanin content in peanut with different seed coat

2.2 不同品種花生種皮顏色智能識(shí)別結(jié)果分析

根據(jù)阿里視覺智能開放平臺(tái)的識(shí)別結(jié)果繪制的色彩結(jié)構(gòu)圖與肉眼觀察到的對(duì)應(yīng)樣品拍照的種皮顏色相同。由圖3 可知，農(nóng)大黑7572 種皮顏色指數(shù)最高為0.703，其顏色主要為十六進(jìn)制顏色中的“#462F29（black）”、“#3C2A26（deep brown）”、“#4F362F（maroon）”。農(nóng)大白7626 種皮顏色指數(shù)最低為0.147，顏色主要為“#CEC8B5（lovry）”、“#D8D3C1（pale godenrod）”、“#C6BEA9（tan）”。根據(jù)種皮顏色結(jié)構(gòu)和直方圖（圖3），將8個(gè)花生品種分為四個(gè)組別，即黑（農(nóng)大黑7572）、紫（Hua 8106、ZP06）、粉（白沙1016、農(nóng)大花103、H7500）、白（農(nóng)大白7626、開白2號(hào)）。根據(jù)四個(gè)階梯分布情況，將種皮顏色指數(shù)分為四個(gè)組別范圍，即黑色（≧0.6000±0.0238）、紫色（0.6000±0.0238～0.4000±0.0238）、粉 色（0.4000±0.0238～0.2000±0.0238） 、白 色（ ≦ 0.2000±0.0238）。

圖3 花生種皮顏色指數(shù)分析Fig.3 Analysis of peanut seed coat color index

2.3 花青素相對(duì)含量與種皮顏色指數(shù)的相關(guān)性分析

為明確花生種皮顏色指數(shù)（p）和花青素相對(duì)含量（i）的關(guān)系，對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比。將花生種皮顏色指數(shù)設(shè)為橫坐標(biāo)，花生種皮花青素相對(duì)含量設(shè)為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖并計(jì)算擬合曲線。結(jié)果顯示，p 與i 呈現(xiàn)出正相關(guān)趨勢，同時(shí)觀察到開白2 號(hào)與農(nóng)大白7626 的散點(diǎn)位置幾乎重合，白沙1016 與農(nóng)大花103 的散點(diǎn)位置幾乎重合，表明花青素含量和種皮顏色指數(shù)兩組種皮顏色高度重合。H7500散點(diǎn)位置位于ZP06 與農(nóng)大花103 之間，再次印證了H7500的種皮顏色是粉色種皮中顏色較深的（圖4A）。

利用R 語言中的ComplexHeatmap 包對(duì)不同花生種皮顏色進(jìn)行聚類分析。無論是花青素相對(duì)含量還是種皮顏色指數(shù)的聚類分析結(jié)果均分為四個(gè)組別（圖4B）。在花生種皮顏色指數(shù)聚類分析中農(nóng)大黑7572 為深灰（＞grey 75%），Hua8106 和ZP06 為中灰（grey 75%～grey 50%），H7500、農(nóng)大花103 和白沙1016 為灰（grey 50%～grey 25%），開白2 號(hào)和農(nóng)大白為淺灰（＜grey 25%），這與花青素含量聚類分析結(jié)果相同。

圖4 花生種皮花青素相對(duì)含量與種皮顏色指數(shù)的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between anthocyanin content and seed coat color index of peanut

2.4 AI智能種皮顏色識(shí)別系統(tǒng)鑒定RIL群體

利用AI 智能種皮顏色識(shí)別系統(tǒng)對(duì)RIL 群體的種皮顏色進(jìn)行鑒定（圖5）。為模擬種皮鑒定應(yīng)用場景，將159個(gè)家系（編號(hào)：RIL600-759）圖片分為四個(gè)組別，即深紫（組1）、紫（組2）、深粉（組3）、粉（組4）。RIL 群體的父本為紫色種皮花生ZP06，母本為粉色種皮花生H7500，因此159 個(gè)家系種皮顏色范圍均在紫色和粉色區(qū)間內(nèi)，即0.6±0.0238～0.2±0.0238。從四個(gè)組別中選取了14 個(gè)家系，即組1：638、698、712，組2：624、635、749、752，組3：611、631、722、646，組4：629、670、623。對(duì)這14個(gè)家系的種皮顏色指數(shù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果分為五組，第1組638、698、712，第2 組635、749、752，第3 組631、646、722，第4 組611、624、629，第5 組623、670。根據(jù)分組結(jié)果可知，種皮顏色指數(shù)鑒定結(jié)果中極端的種皮顏色與肉眼分類結(jié)果重合，而位于種皮顏色過渡區(qū)域的樣品鑒定差別很大，種皮顏色指數(shù)在種皮顏色過渡區(qū)域的鑒定更加準(zhǔn)確客觀。

圖5 AI智能種皮顏色識(shí)別模型鑒定花生RIL群體Fig.5 AI intelligent seed coat color recognition system identifies peanut RIL population

3 討論與結(jié)論

3.1 種皮顏色指數(shù)科學(xué)性驗(yàn)證

將p與i數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比和相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩組數(shù)據(jù)呈線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.9325，同時(shí)折線圖走勢以及聚類分析結(jié)果高度相似，這說明根據(jù)花生種皮顏色指數(shù)可以準(zhǔn)確地反映花生種皮中花青素含量。改良minmax-trim 方法[22]對(duì)種皮顏色指數(shù)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化，結(jié)果相較于花青素含量的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)來說，種皮顏色指數(shù)有準(zhǔn)確的上界和下屆（0～1），范圍界限間的差值均勻且顯著。對(duì)花生種皮HSV顏色空間進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)算，經(jīng)過大量計(jì)算最終確定了S值和V 值比例為1：200，發(fā)現(xiàn)V 值是影響花生種皮顏色深淺的主要因素。同時(shí)參照前人對(duì)HSV顏色空間中的誤差處理[23]，認(rèn)定S 值為次要因素，因此需要考慮S 值對(duì)種皮顏色指數(shù)產(chǎn)生的誤差影響，通過計(jì)算得出修正值為0.0238。

傳統(tǒng)分類時(shí)的顏色邊界十分模糊，中間顏色鑒別困難。為建立顏色識(shí)別系統(tǒng)下的種皮顏色分類機(jī)制，種皮顏色分類時(shí)，選取具有代表性的黑色、紫色、粉色和白色的花生作為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合花青素含量數(shù)據(jù)和種皮顏色指數(shù)直方圖，將樣品分為黑色（≧0.6000±0.0238）、紫色（0.6000±0.0238～0.4000±0.0238）、粉色（0.4000±0.0238～0.2000±0.0238）和白色（≦0.2000±0.0238）四類。這一分組結(jié)論與p和i 的相關(guān)性分析中散點(diǎn)坐標(biāo)位置的分布重合。在實(shí)踐過程中種皮顏色指數(shù)的上界很難達(dá)到1，因此將上界調(diào)整為0.8。

3.2 AI智能種皮顏色識(shí)別系統(tǒng)特點(diǎn)及應(yīng)用

花生種皮顏色的鑒定標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，運(yùn)用不同鑒定標(biāo)準(zhǔn)得出的結(jié)論也不盡相同，開發(fā)一種兼容性強(qiáng)、數(shù)值準(zhǔn)確的鑒定模型十分重要[24]。目前主流的種皮顏色鑒定方法有兩種，一種是對(duì)種皮花青素含量標(biāo)準(zhǔn)化，如HPLC 法檢測花青素、直提花青素法等，這類方法得到的數(shù)據(jù)精密度高[25]，但操作復(fù)雜、價(jià)格昂貴，且測量時(shí)間過長。Wan 等[26]研究發(fā)現(xiàn)黑色素含量上升能夠造成花生種皮色素沉著，因此除花青素外的其他色素物質(zhì)也能夠影響種皮顏色深淺，該方法對(duì)種皮顏色的鑒定可能存在誤判。另一種方法是對(duì)花生掃描或拍攝圖片進(jìn)行色彩分析，這類方法快速、操作簡單、經(jīng)濟(jì)[27]。差異主要存在于對(duì)顏色空間的運(yùn)用，如RGB 三原色模型、HSV 顏色空間、CMYK顏色空間等，其中不同的顏色空間的適用范圍不同。根據(jù)不同需求選取不同特點(diǎn)的顏色空間，如在種皮顏色鑒定過程中，對(duì)深淺這一縱深的準(zhǔn)確描述十分重要，HSV 顏色空間中各個(gè)參數(shù)間相對(duì)獨(dú)立，V 對(duì)花生種皮顏色深淺描述準(zhǔn)確，但RGB顏色空間中對(duì)深淺的范圍邊界模糊，無法對(duì)像素點(diǎn)直接量化[28]。因此HSV 顏色空間更適合作為種皮顏色鑒定的量化指標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)中，采用不同種皮顏色的花生制定種皮顏色判斷標(biāo)準(zhǔn)，其中包含了典型黑色種皮花生農(nóng)大黑7527，白色種皮花生農(nóng)大白7626 等，對(duì)比了經(jīng)典花青素含量測定和AI智能種皮顏色識(shí)別兩種方法，驗(yàn)證了AI智能識(shí)別花生種皮顏色方法的可行性，以及劃分了四個(gè)種皮顏色范圍，并利用該方法鑒定了RIL 群體種皮顏色，建立了花生種皮顏色指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)模型，為今后花生種皮顏色的遺傳研究提供參考。