王俐慧,蘇東風(fēng),隋汝波

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,遼寧 沈陽(yáng)110042;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121012)

急性腦梗死是缺血性的病變，其發(fā)生與動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)，多見于老年人。本病具有致殘性疾病，同時(shí)也是影響老年人死亡的重要原因之一[1]。在急性腦梗死的早期，影像學(xué)常不能提示腦梗死灶，且患者病變較重時(shí)亦存在搬運(yùn)的風(fēng)險(xiǎn)，因此疾病的早期診斷常不能完全依托于影像學(xué)[2]。近年學(xué)者關(guān)注到血清中一些指標(biāo)在病變?cè)缙谟懈淖?，這也為臨床尋找特異性強(qiáng)、敏感性好的血清學(xué)指標(biāo)提供了支持[3-4]。微小RNA(micrRNA,miR)是近年發(fā)現(xiàn)的一種非編碼短鏈RNA，其在多種疾病中異常表達(dá)，主要作用特征為調(diào)控下游的靶基因[5]。學(xué)者近年在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和病理過程中發(fā)現(xiàn)了不同miR的差異表達(dá)，亦在急性腦梗死患者血清和腦脊液中發(fā)現(xiàn)了部分miR的異常表達(dá)，認(rèn)為miR的異常表達(dá)在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用[6]。微小RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)是近年關(guān)注度較高的因子，在腫瘤細(xì)胞形成及神經(jīng)細(xì)胞的缺血再灌注損傷的保護(hù)中可能具有一定作用[7]。生信分析顯示miR-34b 與CXC趨化因子配體12(CXC chemokine ligand-12,CXCL12)具有結(jié)合的位點(diǎn)，且CXCL12在急性腦梗死中常伴有較高的表達(dá)，是病變形成的促進(jìn)因子?；诖吮緦?shí)驗(yàn)檢測(cè)急性腦梗死患者血清中miR-34b和CXCL12 的表達(dá)特征，探討其相關(guān)性及臨床意義，以期為臨床診斷及治療提供幫助。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者均為2021年1月至2021年12月在我院確診并治療的急性腦梗死住院患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次發(fā)?。虎诖_診后存活時(shí)間超過72 h；③均經(jīng)CT或核磁確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神疾病史或頭顱部手術(shù)史；②血液系統(tǒng)疾??；③出血性腦卒中；④短暫性腦缺血發(fā)作；⑤近期有其他血栓性疾病，如心肌梗死、深靜脈血栓等。共納入87例作為觀察組。收集同期在我院進(jìn)行體檢證實(shí)為無(wú)明顯器官質(zhì)性疾病(主要是無(wú)心、腦血管疾病及特殊類型疾病)的成人血清(健康成人)87例作為對(duì)照組。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，患者或家屬簽訂知情同意書。

1.2 血清中miR-34b和CXCL12的表達(dá)檢測(cè) 兩組均留取確診后的空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心15 min后將血清分離。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)血清中miR-34b的表達(dá)。試劑盒購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司和美國(guó)ABI公司，引物由上海生工生物合成。應(yīng)用Trizol提取總RNA，并進(jìn)行濃度和純度的測(cè)定(OD260/280比值在1.8～2.1之間)。cDNA第一鏈合成(TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒)。miR-34b上游引物：5’-TGACAACCGTTTTT-TTGACTG-3’,下游：5’-TACTGTTTTGAAAATC-GTT-3’。以U6作為內(nèi)參，上游引物：5’-GGAACAGAGAAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAATTCACGAATTCCG-3’。程序設(shè)定：95 ℃ 10 min，循環(huán)1次；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。60 ℃采集熒光信號(hào)，記錄Ct值。應(yīng)用羅氏Light Cycler480 Ⅱ PCR儀完成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以2-ΔΔCT表示。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中CXCL12的表達(dá)，試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司。操作均由同一技術(shù)人員完成，減少誤差，做好質(zhì)控工作。

1.3 格拉斯哥預(yù)后(GOS)評(píng)分 于確診后30 d對(duì)患者進(jìn)行的GOS的評(píng)分評(píng)定。GOS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：死亡為1分；植物生存，僅有最小反應(yīng)為2分；重度殘疾，日常生活需要照料為3分；輕度殘疾，但可獨(dú)立生活為4分；有輕度缺陷，但能正常生活為5分[8]。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。兩組年齡、性別、吸煙史和飲酒史等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。87例腦梗死患者，年齡50～88歲，平均年齡(67.34±7.36)歲，其中男47例，女40例，吸煙36例，不吸煙51例，梗死最大徑0.6～8.2 cm，平均(3.25±0.85)cm。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-34b和CXCL12表達(dá)水平比較 見表2。觀察組中 miR-34b的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組[(1.06±0.25)與(1.32±0.34)，P<0.01]，CXCL12的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組[(19.47±3.26與(7.37±1.06),P<0.01]。

表2 兩組miR-34b和CXCL12表達(dá)水平比較

2.3 急性腦梗死患者血清中miR-34b、CXCL12表達(dá)對(duì)急性腦梗死的診斷價(jià)值 見圖1。miR-34b曲線下面積AUC為0.7187，95%置信區(qū)間(CI)：0.6427～0.7946。血清中miR-34b表達(dá)下調(diào)對(duì)急性腦梗死診斷具有預(yù)測(cè)價(jià)值。CXCL12曲線下面積AUC為0.9880，95%CI：0.9772～0.9988。血清中CXCL12表達(dá)上調(diào)對(duì)急性腦梗死診斷具有預(yù)測(cè)價(jià)值，且CXCL12的預(yù)測(cè)價(jià)值要優(yōu)于miR-34b。

圖1 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達(dá)對(duì)急性腦梗死診斷的ROC曲線

2.4 miR-34b和CXCL12在不同臨床特征中的表達(dá)差異 見表3。miR-34b在不同梗死灶最大徑和有無(wú)高血壓、高血脂患者的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，而在不同性別、年齡、有無(wú)吸煙和飲酒史的比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表3 不同臨床特征中miR-34b和CXCL12表達(dá)的差異

2.5 miR-34b、CXCL12表達(dá)與GOS評(píng)分相關(guān)性 見圖2。為進(jìn)一步研究miR-34b和CXCL12的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性，利用GOS評(píng)分作為急性腦梗死患者發(fā)病后30 d的短期預(yù)后判斷指標(biāo)。其中1分8例，2分23例，3分32例，4分15例，5分8例。相關(guān)回歸分析顯示miR-34b與GOS評(píng)分具有正相關(guān)性(Y=2.059X+0.7179，P<0.01)，CXCL12與GOS評(píng)分具有負(fù)相關(guān)性(Y=-0.05924X+4.062，P<0.01)。

圖2 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達(dá)與GOS評(píng)分的相關(guān)性

2.6 miR-34b與CXCL12表達(dá)的相關(guān)性 見圖3。應(yīng)用相關(guān)回歸分析，顯示miR-34b和CXCL12具有負(fù)相關(guān)性(Y=-16.24X+36.74，P<0.01)。

圖3 miR-34b與CXCL12表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

腦梗死的形成與血管損傷和阻塞密切相關(guān)，表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞缺血缺氧性的壞死、脂類物質(zhì)聚集能力的增強(qiáng)，內(nèi)皮下血管壁結(jié)構(gòu)的改變等[9-10]。miRNA是近年關(guān)注到的與損傷及缺血相關(guān)的因子，在病變形成和進(jìn)展中具有調(diào)控作用，miRNA主要作用是調(diào)控下游靶基因發(fā)揮作用，并具有轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用[11]。miRNA種類多，作用機(jī)制復(fù)雜，在細(xì)胞周期、分化、細(xì)胞增殖和凋亡、炎性進(jìn)展的調(diào)控等方面均有重要作用[12]。miR-34b是在神經(jīng)細(xì)胞損傷中關(guān)注度較高的因子，劉曉蓓等[7]發(fā)現(xiàn)miR-34b可以調(diào)控Keap1減弱神經(jīng)細(xì)胞損傷后的氧化應(yīng)激反應(yīng)。CXCL12是應(yīng)用生信分析發(fā)現(xiàn)的與miR-34b有結(jié)合位點(diǎn)的因子之一，其可能作為miR-34b的下游因子之一，與腦梗死形成相關(guān)。CXCL12為炎性損傷形成過程中調(diào)節(jié)相關(guān)的重要因子[13-14]，其基因均定位于4q21上，是結(jié)構(gòu)上具有與家族中其他成員具有同源性的小分子的分泌蛋白，不僅能被干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生并活化，還能定向趨化并活化T細(xì)胞，促進(jìn)炎性進(jìn)展時(shí)的免疫性損傷[15]。研究認(rèn)為CXCL12與受體結(jié)合后，能有效激活CD4陽(yáng)性的T細(xì)胞、組織細(xì)胞及NK細(xì)胞，加速腦梗死形成后神經(jīng)細(xì)胞的損傷，并形成局灶區(qū)的炎性反應(yīng)[16]。

本研究結(jié)果顯示急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達(dá)明顯下調(diào)，CXCL12的表達(dá)明顯上調(diào)，兩者在不同梗死灶最大徑和有無(wú)高血壓、高血脂患者的比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-34b下調(diào)和CXCL12上調(diào)均參與急性腦梗死病變的形成和進(jìn)展。miR-34b表達(dá)下調(diào)時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的微環(huán)境有明顯影響，尤其是缺氧后神經(jīng)細(xì)胞的應(yīng)激性損傷[17]，此途徑可能與對(duì)CXCL12的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。粥樣硬化是血管損傷及阻塞的重要原因，其機(jī)制與巨噬細(xì)胞形成及聚集、炎性反應(yīng)等有關(guān)，miR-34b和CXCL12可能均參與機(jī)體損傷神經(jīng)細(xì)胞周圍巨噬細(xì)胞聚集效應(yīng)，促進(jìn)機(jī)體局部炎性反應(yīng)[18]。miR-34b下調(diào)可能是巨噬細(xì)胞的活化及平滑肌細(xì)胞反應(yīng)性增生的誘導(dǎo)因子，參與到脂質(zhì)代謝過程[19]。但是相關(guān)研究均顯示CXCR2、CXCR4和CXCL12等的作用過程相似，這種調(diào)控可能還涉及ERK、MAPK、AMPK和NF-κB等更多的橋聯(lián)因子，共同調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的損傷、修復(fù)及微環(huán)境的改變等[20]。也有研究顯示miRNA可通過調(diào)控腫瘤壞死因子的釋放，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，使平滑肌細(xì)胞的修復(fù)功能增加，當(dāng)其表達(dá)下調(diào)后修復(fù)功能下降，加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷[21]。CXCL12與受體CXCR3結(jié)合的敏感性和程度較高，能高效誘導(dǎo)炎性相關(guān)細(xì)胞聚集并釋放相關(guān)遞質(zhì)，如腫瘤壞死因子-α、白介素-6(IL-6)等，促進(jìn)炎性損傷后細(xì)胞增殖的功能。本研究結(jié)果顯示miR-34b的下調(diào)、CXCL12上調(diào)均對(duì)急性腦梗死診斷具有預(yù)測(cè)價(jià)值，提示兩指標(biāo)的改變?cè)诓∽冊(cè)缙谠\斷中有重要價(jià)值，本研究結(jié)果更傾向于CXCL12的預(yù)測(cè)效果更理想。miR-34b和CXCL12均與發(fā)病后30 d時(shí)的GOS評(píng)分具有相關(guān)性，即miR-34b下調(diào)、CXCL12上調(diào)的患者預(yù)后較差，提示早期檢測(cè)miR-34b和CXCL12的表達(dá)對(duì)患者早期進(jìn)行預(yù)后評(píng)估有一定意義。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了miR-34b和CXCL12具有診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值，但是后續(xù)實(shí)驗(yàn)應(yīng)擴(kuò)大樣本進(jìn)行多中心的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，并確定其臨界值。

總之，急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達(dá)下調(diào)、CXCL12的表達(dá)上調(diào)，兩者具有負(fù)相關(guān)性，對(duì)病變形成和進(jìn)展有一定促進(jìn)作用，早期檢測(cè)miR-34b和CXCL12對(duì)判斷預(yù)后有一定價(jià)值。