史恒瑞，董 平

(1.杭州市丁橋醫(yī)院 口腔科，浙江 杭州 310022；2.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

頜面部位于身體表面，遭遇車禍、外力擊打后易受到損傷，影響咀嚼等生理功能，如有面部外形改變亦會導致心理創(chuàng)傷。隨著研究的進展，組織工程為修復頜面部組織缺損提供了新的選擇。人羊膜間充質(zhì)干細胞(hAMCs)存在于孕婦產(chǎn)后分娩出的胎盤中，可以分化成來自三個胚層的所有細胞，這些細胞可用來修復頜面部的各類組織缺損。同時，hAMCs具有較強的增殖能力，且較易獲取，并具有低免疫原性，異體移植不易引起免疫排斥反應。通過以上特點可預見，該細胞在組織工程修復與重建及細胞替代治療等再生醫(yī)學研究領(lǐng)域中具有廣闊的應用前景。但hAMCs也存在著一些缺陷，尤其在體外培養(yǎng)時，生長速度緩慢、傳代代數(shù)有限。所以，如何能高效地擴增人羊膜間充質(zhì)干細胞就顯得尤為重要。

現(xiàn)代藥理學證實丹參有強心、擴血管、抗血栓形成、改善微循環(huán)、促進組織再生與修復等良好的作用，其有效成分如丹酚酸、丹參酮都具有抗氧化、降低生物體內(nèi)氧自由基水平的藥理作用。已有多篇文獻證實，在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞時給予其類似于體內(nèi)的低氧環(huán)境后，間充質(zhì)干細胞會保持較原始的狀態(tài)，增殖能力則會大大增強?；谏鲜龅难芯砍晒坝^點，本研究觀察丹參是否具有促進hAMCs增殖的能力，為將來更好地將hAMCs應用于組織工程及再生醫(yī)學中提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 人羊膜來源于遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)倫理審核、產(chǎn)婦知情同意后，在無菌的條件下從健康足月剖宮產(chǎn)的產(chǎn)婦分娩的胎盤中采集羊膜，將采集到的羊膜置于裝有潔凈的PBS溶液的玻瓶中，并在2 h內(nèi)進入實驗的流程。

1.2 主要實驗試劑 胰蛋白酶、胎牛血清、L-DMEM，均來自Gibco(USA)；膠原酶Ⅱ、L-谷氨酰胺、鼠抗人波形蛋白抗體，購自Sigma(USA)；CD45-FITC、CD29-FITC、CD34-FITC、CD166-PE、CD73-PE、CD44-PE，購自BD(USA)；細胞周期檢測試劑盒購自南京凱基(中國)；丹參凍干粉購自哈藥二廠(中國)；SDS-PAGE電泳液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Western轉(zhuǎn)膜液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞裂解液，均購自碧云天(中國)。

1.3 人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下取孕期為38～40周剖宮產(chǎn)或自然順產(chǎn)后的人胎盤，機械剝離胎盤羊膜組織，參照相關(guān)研究分離獲得人羊膜間充質(zhì)干細胞。在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，當原代細胞生長所占的面積占到培養(yǎng)瓶底壁的80% 時傳代，第3代時進行人羊膜間充質(zhì)干細胞的鑒定。

1.4 人羊膜間充質(zhì)干細胞的鑒定

1.4.1 免疫表型鑒定 取第3代細胞，進行細胞計數(shù)，至少選取1×10個細胞，在暗室中分別加入5 μL 熒光標記單抗至不同的上機管中，同型對照為相應熒光標記的小鼠IgG-FITC、IgG-PE，每管加入已制備好的細胞懸液100 μL至上述上機管，室溫下避光孵育30 min，PBS洗滌后重懸細胞，加入4%多聚甲醛固定細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.4.2 免疫細胞化學染色檢測 取第3代細胞爬片兩張，按照試劑盒說明操作，將細胞爬片分為實驗組及對照組，實驗組滴加波形蛋白抗體室溫孵1 h，對照組滴加PBS液代替一抗，兩組的孔內(nèi)均滴加鼠兔通用型二抗，經(jīng)室溫下孵育、DAB顯色、蘇木素復染等操作后待玻片自然干燥置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.3 Western Blot檢測波形蛋白表達 以上皮細胞及間質(zhì)細胞作為對比，取第3代人羊膜間充質(zhì)干細胞加入蛋白裂解液抽取細胞總蛋白，將定量好的總蛋白按體積比4∶1加入上樣緩沖液，煮沸5 min，置于-20 ℃冰箱內(nèi)。取蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%分離膠)，加入5 μL蛋白分子量標準參照物以確定所檢測蛋白帶的位置。電泳的起始電壓為80 V，待樣品至分離膠時提高電壓至100 V，指示劑至凝膠底部時停止電泳；再于電轉(zhuǎn)儀上在330 mA、90 min下將蛋白樣品濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%脫脂牛奶PBST封閉1 h，分別加入稀釋后的一抗，4 ℃置于搖床過夜，室溫下孵育1∶2 000的二抗1.5 h，洗膜3次，用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，拍照后進行灰度值分析。

1.5 MTT法檢測細胞增殖情況 取第4代細胞沉淀，計數(shù)后平分為A、B、C三組，分別加入含0.05%丹參的全培養(yǎng)基、含0.005%丹參的全培養(yǎng)基、全培養(yǎng)基，將細胞種于96孔板中并設(shè)置空白對照D組，每48 h換液1次，測試時加入預先配制好的MTT，之后在CO培養(yǎng)箱中孵育4 h，無菌條件吸除孔內(nèi)的液體，加入100 μL的DMSO，置于酶標儀中再測定每組的OD值。所得數(shù)據(jù)為藥物干預細胞生長后第1天的OD值，之后每24 h測定一次并繪制7天內(nèi)的生長曲線。

1.6 細胞周期測定 取第4代細胞沉淀，按MTT法檢測細胞增殖情況時的方法進行細胞分組并種瓶，每48 h換液，待各組細胞在培養(yǎng)瓶內(nèi)長滿后，制取細胞懸液并保證懸液中所含有的細胞大于1×10，加入同體積的阻止培養(yǎng)基，在4 ℃、1 000 r/min下離心5 min，倒掉上清，PBS洗滌細胞，冰乙醇固定細胞，PBS洗去固定液后，每組加入100 μL的牛胰核糖核酸酶，37 ℃水浴30 min，400 μL的碘化丙啶染色混勻，4 ℃避光孵育后，流式細胞儀采集各組細胞檢測，Cellqust軟件分析各組細胞周期計算增殖指數(shù)(proliferation index, PI)，PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.7 實驗組細胞免疫表型鑒定 獲取第5代人羊膜間充質(zhì)干細胞，加入含0.05%丹參的全培養(yǎng)基，待細胞長滿后，按1.4.1方法檢測該組細胞CD29、CD34、CD44、CD45、CD73、CD166的表達情況，并與鑒定細胞時的結(jié)果做對比。

2 結(jié)果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細胞形態(tài)及鑒定 原代鏡下可見細胞貼壁生長，呈長條形、梭形或角形。隨著傳代及生長，細胞形態(tài)呈長梭形更為明顯并呈漩渦狀生長(封三圖1)。第3代hAMCs高表達：CD44、CD73、CD29、CD166；低表達：CD34、CD45(表1)。所制取的細胞波形蛋白陽性表達，細胞胞漿呈棕褐色(封三圖2A)，空白對照組則未見明顯表達(封三圖2B)。Western Blot法顯示，羊膜中所提取的細胞高表達波形蛋白(Vimentin)、低表達E鈣黏連蛋白(封三圖3)，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(<0.05)。綜合以上結(jié)果可以說明所獲取的細胞為人羊膜間充質(zhì)干細胞。

2.2 不同濃度丹參促增殖的影響 各組細胞生長曲線顯示(圖1)，在第4～6天時，各組細胞處于對數(shù)生長期，A、B兩組OD值高于C組，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)。計算細胞倍增時間(doubling time，Td)：Td=t×lg2/(lgNt-lgN)。A、B、C組細胞倍增時間分別為72.24 h、84 h、99.12 h，A、B兩組低于C組，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)。細胞周期檢測結(jié)果顯示，A、B兩組細胞的G2/M、S期比例高于C組，G0/G1期比例低于C組，A、B、C組PI分別為(60.75±0.68)%、(15.7±0.95)%、(6.64±0.96)%，A、B組高于常規(guī)對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(<0.05)，見圖2。實驗組第5代細胞流式術(shù)結(jié)果表明細胞高表達：CD44、CD73、CD29、CD166，低表達：CD34、CD45。將該結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)基組的細胞流式結(jié)果做對比，結(jié)果顯示：除CD166外，其余CD分子間的表達率差異均無統(tǒng)計學意義(>0.05)，見表1。

圖1 各組細胞生長曲線Figure 1 The cell growth curve

圖2 各組細胞的細胞周期變化對比Figure 2 The contrast of each cycle changes

表1 流式細胞術(shù)分析及對比

3 討論

人羊膜間充質(zhì)干細胞自發(fā)現(xiàn)以來，因取材方便、來源廣泛且產(chǎn)量豐富、增殖能力較骨髓間充質(zhì)干細胞強、免疫原性低、多向分化潛能、幾乎不存在倫理學爭議等特點，已經(jīng)展現(xiàn)出較其他干細胞巨大的優(yōu)勢，這些優(yōu)勢均提示其有可能成為組織工程學及細胞替代治療中理想的種子細胞。但是，間充質(zhì)干細胞在體外擴增時，易發(fā)生增殖數(shù)量少、細胞衰亡的現(xiàn)象。為了延緩間充質(zhì)干細胞的衰老并保持其較強的增殖能力，人們做了大量的研究。有文獻報道：將β-catenin-綠色熒光蛋白重組腺病毒擴增后，轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細胞可提高其增殖能力，但此法費用較高，且步驟較繁瑣，不利于大規(guī)模應用。除此之外，有學者將堿性成纖維細胞生長因子加入到培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)該法可促進人羊膜間充質(zhì)干細胞的增殖。也有文獻表明該法雖可促進間充質(zhì)干細胞增殖，但會導致細胞向成纖維細胞分化。因此，尋找一種費用低且效果好的方法來促進人羊膜間充質(zhì)干細胞增殖有研究意義。

氧化應激是指生物、細胞體內(nèi)出現(xiàn)大量的活性氧(ROS)、氧自由基團，過量的氧自由基團可引起組織、細胞和機體不同程度的受損，這種損害主要是通過NADPH氧化酶途徑和線粒體電子傳遞鏈途徑造成的。基于上述理論，只要干細胞培養(yǎng)環(huán)境中有足夠的抗氧化劑，清除不利于細胞生長的氧自由基團，從而維持氧化還原平衡就可以維持其較原始的特性，增加其存活概率。針對該設(shè)想，目前有研究證實，在體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞時將其置于低氧的環(huán)境中能減少細胞內(nèi)活性氧自由基的生成，維持其較強的活性及較為原始的狀態(tài)。另有文獻表明：給予細胞抗氧化劑后，骨髓間充質(zhì)干細胞可以維持較高的增殖能力及多向分化潛能。

有文獻表明丹參所含的丹參酮及丹酚酸類成分具有抗氧化、降低生物體內(nèi)氧自由基水平、抗氧化應激反應等藥理作用，丹參作為傳統(tǒng)中藥材，其產(chǎn)量大且價格低。所以，本研究試驗性地在常規(guī)培養(yǎng)基中加入適量的丹參，觀察細胞生長狀況，結(jié)果顯示，所獲取的第三代細胞高表達波形蛋白及CD44、CD73、CD29、CD166，低表達CD34、CD45，這個結(jié)果符合國際細胞治理協(xié)會設(shè)立的人羊膜間充質(zhì)干細胞表型特征的標準。本研究結(jié)果說明培養(yǎng)基中加入適量的丹參對人羊膜間充質(zhì)干細胞的增殖具有促進作用，可以干預人羊膜間充質(zhì)干細胞的細胞周期變化，這個變化至少在短期內(nèi)是存在的。然而由于各種因素限制，本實驗只是選擇加入0.05%和0.005%的丹參于培養(yǎng)基中，未能嘗試更多的加藥濃度，所以本實驗只能說明0.005%～0.05%這個濃度范圍對增殖有促進作用，未能完全探明該藥物的有效濃度范圍，這需要后續(xù)大量的實驗去探明。除此之外，經(jīng)過藥物促增殖后的細胞多向分化能力、關(guān)鍵基因的表達及免疫源性有無改變等問題，需要進一步的實驗研究。