章云衡，狄春紅，羅 燕，譚曉華，楊 磊

(1.杭州師范大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，浙江 杭州310036；2.杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院，浙江 杭州 310015)

ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette transporter，ABC)家族介導(dǎo)的多藥耐藥與生物學(xué)體的抗砷功能相關(guān)。ABCB1基因，即多藥耐藥基因(multidrug resistance，MDR1)，ABCC1即多藥耐藥相關(guān)蛋白1(multidrug resistance-associated protein, MRP1)可以將砷轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，降低胞內(nèi)的砷的濃度，增加細(xì)胞對砷的耐受性。人類ABCA1基因定位于 9q31.1，含50個(gè)外顯子，ABCA1蛋白質(zhì)全長2 261個(gè)氨基酸，我們之前的研究證實(shí)ABCA1是又一重要的細(xì)胞抗砷基因，與ABCB1、ABCC1協(xié)同發(fā)揮作用。ABCA1蛋白共12次跨膜，形成6個(gè)胞外環(huán)和5個(gè)胞內(nèi)環(huán)，其中胞外第一、四、六環(huán)和胞內(nèi)第三環(huán)較大，而其他各環(huán)包含較少的氨基酸。課題組前期的研究構(gòu)建了多個(gè)ABCA1的突變體，并檢測其對ABCA1抗砷性的影響。本研究將構(gòu)建的ABCA1細(xì)胞外第843—1 348位氨基酸密碼子缺失的突變體表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至低表達(dá)ABCA1的HeLa細(xì)胞中，檢測HeLa細(xì)胞對砷耐受性及細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒 HeLa細(xì)胞、pcDNA3.1/V5-His空載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α為分子克隆的受體菌，保存于本實(shí)驗(yàn)室中。野生型ABCA1表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His/ABCA1由德國Schimitz Gerd教授惠贈。ABCA1第843—1 348位氨基酸殘基缺失突變體(ABCA1△843-1 348)表達(dá)載體pcDNA3.1/V5-His/ABCA1△843-1 348由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試劑 亞砷酸鈉(NaAsO)購自Sigma公司。胎牛血清購自Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司。Lipofectamine 2000試劑盒購自Invitrogen公司。ABCA1(AC10)抗體購自Santa cruz biotechnology, inc.。DYLight488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 激光共聚焦檢測蛋白定位 先用75%的酒精浸泡蓋玻片過夜，第2天用雙蒸水清洗、晾干，置于6孔板內(nèi)。以5×10細(xì)胞/孔接種Hela細(xì)胞到6孔板內(nèi)培養(yǎng)，12 h后采用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染全長ABCA1、ABCA1△843-1 348突變體和pcDNA3.1/V5-His 空載體至HeLa細(xì)胞中。具體過程參考試劑盒說明書操作。培養(yǎng)24 h 后去上清，取出6孔板內(nèi)細(xì)胞爬片，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，置于載玻片上，加入ABCA1一抗孵育過夜。次日，PBST清洗蓋玻片3次，加入DYLight488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG熒光二抗室溫避光孵育1 h，封片劑封片。共聚焦顯微鏡下觀察全長ABCA1蛋白和突變體ABCA1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位。

1.4 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制 pcDNA3.1/V5-His 空載體、ABCA1△843-1 348突變體及全長ABCA1分別轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞，12 h后收集細(xì)胞。收集到的細(xì)胞以6×10/孔密度接種Hela細(xì)胞到96孔板，培養(yǎng)12 h，然后加入含有不同NaAsO濃度(0、4、8、16、32、64 μM)的培養(yǎng)液，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。加入CCK-8試劑10 μL/孔，37℃避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測OD450值。根據(jù)OD450值計(jì)算各濃度對應(yīng)的細(xì)胞生存率。生存率計(jì)算公式：生存率=(加砷孔OD值-空白培養(yǎng)基OD值)/(對照孔OD值-空白培養(yǎng)基OD值)×100%。根據(jù)生存率值計(jì)算IC50值。

1.5 細(xì)胞內(nèi)含砷量檢測 采用原子熒光吸收光譜法(atomic fluorescence spectrophotometry, AFS)檢測細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量的變化。HeLa細(xì)胞經(jīng)PBS清洗一遍，收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，然后取離心10細(xì)胞。加入濃硝酸消化細(xì)胞，用微波消解儀(CEM公司)將所有砷轉(zhuǎn)化為無機(jī)砷，加入5%硫脲將砷還原為三價(jià)砷，原子熒光分光光度法測定細(xì)胞總砷含量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做5復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 ABCA1△843-1 348突變體蛋白定位 激光共聚焦顯微鏡下，轉(zhuǎn)染ABCA1△843-1 348突變體與全長ABCA1的HeLa 細(xì)胞的細(xì)胞膜上均可見目的蛋白(圖1)。

2.2 細(xì)胞生存率 轉(zhuǎn)染全長ABCA1、ABCA1△843-1 348和空載體的HeLa細(xì)胞，在各砷濃度條件下的生存率見表1。根據(jù)各砷濃度細(xì)胞生存率計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50值，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞IC50值(19.17 μM)低于轉(zhuǎn)染全長ABCA1的細(xì)胞(31.64 μM)和轉(zhuǎn)染ABCA1△843-1 348的細(xì)胞(29.73 μM)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)。全長ABCA1和突變體ABCA1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞間的細(xì)胞生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(>0.05)。

圖 1 激光共聚焦顯微鏡觀察 ABCA1△843-1 348突變體在HeLa細(xì)胞中的定位Figure 1 Cellular location of the ABCA1△843-1 348 mutant and full-length ABCA1 detected by confocal microscopy

表1 轉(zhuǎn)染全長ABCA1、ABCA1△843-1 348和空載體的HeLa細(xì)胞在各砷濃度條件下的生存率(n = 3，%)Table 1 Comparison of survival rates between HeLa cells transfect full-length ABCA1, ABCA1△843-1 348mutant and vector control(n = 3，%)

2.3 各時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞內(nèi)的砷含量 10 μM亞砷酸鈉處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)染全長和突變體ABCA1細(xì)胞內(nèi)砷含量在4 h后趨于穩(wěn)定，而轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞內(nèi)砷含量仍持續(xù)升高。見表2。轉(zhuǎn)染全長ABCA1和ABCA1△843-1 348突變體細(xì)胞內(nèi)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的砷含量沒有差異(>0.05)，在砷暴露6、8、10 h的砷含量，均顯著低于對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)染空載體組(<0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染ABCA1和空載體的HeLa細(xì)胞內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的砷含量 (ng/106個(gè)細(xì)胞)Table 2 The intracellular arsenic contents in HeLa cells transfected with full-length ABCA1, ABCA1△843-1 348 mutant or vector at each time point (ng/106 cells)

3 討論

我們前期的研究報(bào)道證實(shí)ABCA1具有抗砷功能，ABCA1促進(jìn)砷的排出，增加細(xì)胞對砷的耐受?？缒そY(jié)構(gòu)域是ABCA1執(zhí)行轉(zhuǎn)運(yùn)功能時(shí)關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域有6個(gè)α螺旋，共12個(gè)α螺旋形成了一個(gè)允許多種底物通過的孔樣跨膜結(jié)構(gòu)。人ABCA1基因定位于 9q31，含有 50個(gè)外顯子，分子量約為 254 kDa，是一個(gè)完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，共形成 12個(gè)跨膜α螺旋。ABCA1通過α螺旋形成的孔樣跨膜結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)運(yùn)脂質(zhì)、甾醇、代謝產(chǎn)物以及某些藥物等多種底物。相鄰α螺旋之間形成 11個(gè)大小不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。其中胞外第一、四、六環(huán)分別含有596、315和61個(gè)氨基酸殘基，胞內(nèi)第三環(huán)為505氨基酸殘基，而其他各個(gè)環(huán)的長度均較小。為了篩選ABCA1抗砷功能結(jié)構(gòu)域，我們構(gòu)建了多個(gè)ABCA1缺失突變體，其中胞外第一、六環(huán)的缺失突變體失去了抗砷功能，而位于胞外第四、五和胞內(nèi)第四、五環(huán)的缺失突變不影響其抗砷功能。本研究構(gòu)建了ABCA1蛋白第843—1 348缺失突變體，該缺失位于胞內(nèi)第三環(huán)；并檢測了該突變體的細(xì)胞定位、抗砷功能及細(xì)胞內(nèi)砷含量。

ABCA1是一個(gè)跨膜蛋白，正確定位于細(xì)胞膜上使其發(fā)揮選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)底物的基礎(chǔ)。本研究在構(gòu)建缺失突變體時(shí)，考慮到缺失可能影響其細(xì)胞膜定位，在選擇缺失區(qū)域時(shí)避開了可能影響其細(xì)胞膜定位的序列。缺失突變體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，采用激光共聚焦顯微鏡觀察，HeLa細(xì)胞本底ABCA1表達(dá)水平較低，轉(zhuǎn)染全長和突變的ABCA1均高表達(dá)在細(xì)胞膜上。另外，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染第843—1 348缺失突變的ABCA1與全長ABCA1組的細(xì)胞存活率在各個(gè)砷濃度暴露條件下沒有差異，均顯著高于全空載體轉(zhuǎn)染組。提示第843—1 348位缺失的ABCA1蛋白仍然具有與全長ABCA1相似的抗砷功能，說明該區(qū)域不是ABCA1抗砷功能的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。

課題組早期的研究證實(shí)ABCA1通過控制砷的排出提高對砷的耐受性。促進(jìn)砷的排出也是ABC家族的其他基因(如ABCB1和ABCC1)發(fā)揮抗砷功能的重要機(jī)制。為研究ABCA1Δ843-1 348突變體對細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量的影響，檢測了轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒各組細(xì)胞10 μM亞砷酸鈉暴露后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量，結(jié)果顯示，各組細(xì)胞內(nèi)的砷含量均隨著砷暴露時(shí)間的延長而增加。與轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染全長和突變體ABCA1的細(xì)胞內(nèi)砷蓄積量在4 h后增加緩慢，在6、8、10 h各時(shí)間點(diǎn)的砷含量顯著低于空載體組。轉(zhuǎn)染全長與突變體ABCA1兩組細(xì)胞內(nèi)砷含量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均沒有差異，表明第843—1 348位氨基酸對ABCA1的排砷的功能影響不大。

綜上，ABCA1第843—1 348位氨基酸殘基缺失突變對細(xì)胞的砷耐受性及細(xì)胞內(nèi)砷含量沒有顯著影響，提示此段氨基酸殘基所在的胞內(nèi)第三環(huán)在ABCA1抗砷功能中的作用有限。