陶志云 徐文娟 施祖灝 朱春紅 宋衛(wèi)濤 劉宏祥 章雙杰 李慧芳

摘要：為了解感染鴨疫里默氏菌后鴨腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，采用石蠟切片、HE染色方法測(cè)定鴨感染鴨疫里默氏菌1、2、3、5、9、14 d十二指腸、空腸和回腸3個(gè)小腸段腸黏膜厚度、腸絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度和隱窩深度比值。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，在感染鴨疫里默氏菌1～9 d后，鴨的十二指腸、空腸和回腸腸黏膜厚度和腸絨毛高度變化一致，均表現(xiàn)為明顯下降;隱窩深度在3個(gè)小腸段的變化不同;腸絨毛高度/隱窩深度的值在感染鴨疫里默氏菌的3個(gè)小腸段中總體均呈下降趨勢(shì)。說明感染鴨疫里默氏菌顯著影響了鴨小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，該研究為鴨疫里默氏菌的致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：鴨;鴨疫里默氏菌;腸道;形態(tài)結(jié)構(gòu);黏膜厚度;絨毛高度;隱窩深度

中圖分類號(hào)：S858.32 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0166-04

規(guī)?；B(yǎng)殖過程中，病原菌的入侵和感染是影響生產(chǎn)的重要因素[1-2]。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（riemerella anatipestifer）感染引起的一種急性敗血性傳染病[3]，主要危害2～7周齡雛鴨，發(fā)病率高達(dá)90%以上，死亡率高達(dá)75%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨生產(chǎn)的主要疾病[4-5]。

小腸是機(jī)體最為重要的消化器官，腸道黏膜屏障是機(jī)體抵抗腸道病原菌和外界病原感染的第1道防線，在維持腸道功能正常發(fā)揮和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要作用[6-7]。而腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性是構(gòu)成腸道機(jī)械屏障的基礎(chǔ)[8-9]，對(duì)鴨疫里默氏菌感染后小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)完整性的評(píng)價(jià)有助于了解鴨疫里默氏菌病的致病特征，因此，本研究以鴨腸道為研究對(duì)象，觀察鴨疫里默氏菌感染不同時(shí)間小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，以探討鴨疫里默氏菌對(duì)腸道的致病性及鴨腸道結(jié)構(gòu)在抗鴨疫里默氏菌感染過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株培養(yǎng)

試驗(yàn)所用鴨疫里默氏菌菌株為ATCC11845標(biāo)準(zhǔn)菌株，購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。按1 ∶100的比例將鴨疫里默氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株加入到添加有5%血清的TSB（胰蛋白胨大豆肉湯）培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。1 000 r/min 離心10 min，去上清，采用生理鹽水將沉淀稀釋為 109 CFU/mL。

1.1.2 試驗(yàn)鴨

試驗(yàn)鴨來源于江蘇高郵鴨集團(tuán)，為健康高郵雛鴨，相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)至30日齡時(shí)進(jìn)行分組。

1.1.3 人工感染試驗(yàn)及樣品采集

人工感染試驗(yàn)于2019年9月在試驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行，采用109 CFU/mL鴨疫里默氏菌人工感染健康30日齡育成期高郵鴨80 羽，按照該品種鴨國家標(biāo)準(zhǔn)的要求飼養(yǎng)，隨機(jī)分為對(duì)照組和感染組等2組，其中對(duì)照組的鴨注射 0.5 mL/羽的生理鹽水，感染組的鴨注射0.5 mL/羽用生理鹽水稀釋的鴨疫里默氏菌菌液（2×109～5×109 CFU/mL）。在感染1、2、3、5、9、14 d，隨機(jī)取5羽/組鴨屠宰。屠宰后分別采集十二指腸、空腸、回腸組織各約1.0 cm的腸段，用生理鹽水小心沖洗腸內(nèi)容物，置于10%福爾馬林溶液中固定、密封，室溫放置24 h。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（HB4114，青島海博生物技術(shù)有限公司），血平皿（9 cm，YB3400071，上海鈺博生物科技有限公司），國產(chǎn)血清（四季青，11011-8611，北京索萊寶科技有限公司）。

智能型恒溫?fù)u床（MSK，中國）;生物安全柜（BHC1300A2，中國）;石蠟切片機(jī)（Leica，RM2235），購自北京盛科信德科技有限公司，光學(xué)顯微鏡（ZEISS Axio Scope.A1正置顯微鏡），購自北京派迪威儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

按常規(guī)方法制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色法染色，采用光學(xué)顯微鏡、數(shù)字?jǐn)z像機(jī)及圖像處理系統(tǒng)測(cè)定腸黏膜厚度、腸道絨毛高度和隱窩深度，并計(jì)算絨毛高度和隱窩深度的比值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用 Excel 對(duì)相對(duì)定量數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 20. 0 生物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腸段腸黏膜厚度變化

由表1可知，與對(duì)照組相比，感染鴨疫里默氏菌后1～9 d十二指腸、空腸和回腸的黏膜厚度均有顯著下降，在感染后2、5 d時(shí)，十二指腸差異達(dá)顯著水平（P<0.05）;在9 d空腸和1、3、5 d回腸中，黏膜厚度的差異達(dá)顯著水平（P<0.05）;14 d時(shí)，在每段腸段的黏膜厚度均無顯著差異（P<0.05）。

2.2 不同腸段腸絨毛高度變化

由表2可知，與對(duì)照組相比，感染鴨疫里默氏菌后1～9 d的十二指腸腸絨毛高度明顯下降，在感染后2 d差異達(dá)顯著水平（P<0.05）;空腸腸絨毛高度明顯下降，在感染后2、9 d差異達(dá)顯著水平（P<0.05）;在回腸中腸絨毛高度總體呈下降趨勢(shì)，但差異不顯著。在感染后14 d所有腸段腸絨毛高度在感染組和對(duì)照組間均無顯著差異。

2.3 不同腸段腸隱窩深度變化

由表3可知，與對(duì)照組相比，十二指腸的隱窩深度在感染鴨疫里默氏菌后幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異均不顯著;空腸的隱窩深度在感染后1 d顯著下降（P<0.05），在9 d時(shí)顯著上調(diào)（P<0.05），在其他時(shí)間點(diǎn)差異不顯著;回腸的隱窩深度在感染后3、5、9 d顯著增加（P<0.05）。

2.4 不同腸段腸絨毛高度/隱窩深度變化

由表4可知，與對(duì)照組相比，不同小腸段腸道中腸絨毛高度與隱窩深度的比值在感染鴨疫里默氏菌后總體均呈下降趨勢(shì)。在十二指腸中，感染后2、5、9 d感染組的比值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）;在空腸中，感染后2、9 d感染組的比值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）;在回腸中， 感染后3、5、9 d感染組的比值顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

腸道完整性是發(fā)揮腸道功能的基礎(chǔ)，病原菌的感染會(huì)破壞腸道的完整性，引起疾病[10-11]。小腸是動(dòng)物體內(nèi)重要的消化器官，是營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)進(jìn)行消化吸收最多的場(chǎng)所，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有著重要作用[12-13]。腸壁厚度的增加有助于腸道蠕動(dòng)，提高腸對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收;腸絨毛越長(zhǎng)，與營養(yǎng)物質(zhì)接觸面積就越大，吸收越好;隱窩越淺，腸上皮細(xì)胞成熟率越高，消化吸收能力就越強(qiáng);絨毛高度/隱窩深度的值綜合反映腸道功能狀況，比值越小，說明消化吸收能力越弱[14-16]。

研究表明，一些不利因素可引起腸道損傷，如阿司匹林大量灌胃引起大鼠腸道損傷，表現(xiàn)為腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比值下降[17]。番鴨感染呼腸弧病毒后，其十二指腸、空腸和回腸的絨毛高度、腸壁厚度、絨毛高度/隱窩深度的值均顯著低于對(duì)照組[18]。脂多糖（LPS）應(yīng)激能顯著增加大鼠十二指腸隱窩深度，顯著降低十二指腸絨毛高度與隱窩深度比值、空腸黏膜厚度[19]。本研究表明，感染鴨疫里默氏菌后1～9 d，十二指腸、空腸和回腸腸段的黏膜厚度及絨毛高度均有不同程度的下降，說明感染鴨疫里默氏菌后鴨小腸的腸吸收能力減弱。感染鴨疫里默氏菌后，鴨空腸和回腸中隱窩深度增加，說明其腸道吸收功能下降。鴨疫里默氏菌感染后絨毛高度/隱窩深度的值下降，說明感染鴨疫里默氏菌1～9 d后顯著影響腸吸收功能，但14 d時(shí)鴨小腸的黏膜厚度、絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度的值在3個(gè)鴨小腸腸段均無顯著差異，說明鴨疫里默氏菌對(duì)感染14 d的鴨小腸腸吸收功能無顯著影響，這是因?yàn)楦腥绝喴呃锬暇?4 d，腸吸收功能基本恢復(fù)。

本研究結(jié)果表明，不利因素感染鴨疫里默氏菌也可引起腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，引起吸收功能下降，這可能是其致病方式之一;感染后期，腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)基本修復(fù)，說明感染鴨疫里默氏菌的個(gè)體在康復(fù)后其腸道的吸收功能仍然可恢復(fù)。該研究為鴨疫里默氏菌的致病機(jī)制及機(jī)體的修復(fù)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，但具體的致病機(jī)制及修復(fù)機(jī)制尚需深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐韶頤. 畜禽養(yǎng)殖疫病發(fā)生原因及預(yù)防[J]. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2019（16）：14-15.

[2]高杰雄. 規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖中的疾病預(yù)防與消毒淺析[J]. 獸醫(yī)導(dǎo)刊，2020（4）：7.

[3]寧玲忠，雷紅宇，胡仕鳳，等. 鴨疫里默氏菌病研究進(jìn)展[J]. 湖南畜牧獸醫(yī)，2013（3）：4-5.

[4]Gong Y S，Yang Y S，Chen Y，et al. Characterization of the hemolytic activity of Riemerella anatipestifer[J]. Microbiology，2020，166（5）：436-439.

[5]Chikuba T，Uehara H，F(xiàn)umikura S，et al. Riemerella anatipestifer infection in domestic ducks in Japan，2014[J]. The Journal of Veterinary Medical Science，2016，78（10）：1635-1638.

[6]Tsujikawa T，F(xiàn)ujiyama Y. Small intestinal：development，structure，function[J]. Nihon Rinsho，2008，66 （7）：1240-1242.

[7]Wu Y P，Tang L，Wang B K，et al. The role of autophagy in maintaining intestinal mucosal barrier[J]. Journal of Cellular Physiology，2019，234（11）：19406-19419.

[8]Morozov I A. Structure and function of the small intestinal mucosal[J]. Eksp Klin Gastroenterol，2002，6：88-92，114.

[9]Jankowski J A，Goodlad R A，Wright N A.Maintenance of normal intestinal mucosa：function，structure，and adaptation[J]. Gut，1994，35（Suppl）：S1-S4.

[10]Camilleri M，Madsen K，Spiller R，et al. Intestinal barrier function in health and gastrointestinal disease[J]. Neurogastroenterology & Motility，2012，24（6）：503-512.

[11]Farhadi A，Banan A，F(xiàn)ields J，et al. Intestinal barrier：an interface between health and disease[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology，2003，18（5）：479-497.

[12]Xu R J，Wang F，Zhang S H.Postnatal adaptation of the gastrointestinal tract in neonatal pigs：a possible role of milk-borne growth factors[J]. Livestock Production Science，2000，66（2）：95-107.

[13]王前光，李 闖，黃 璇，等. 葡萄糖氧化酶對(duì)1～6周齡臨武鴨生長(zhǎng)性能、血清生化和抗氧化指標(biāo)、腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)和微生物多樣性的影響[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2020，32（8）：3605-3614.

[14]沈霞芬.家畜組織學(xué)與胚胎學(xué)[M]. 4版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2010.

[15]Mekbungwan A，Yamauchi K.Growth performance and histological intestinal alterations in piglets fed dietary raw and heated pigeon pea seed meal[J]. Histology and Histopathology，2004，19（2）：381-389.

[16]Caspary W F.Physiology and pathophysiology of intestinal absorption[J]. The American Journal of Clinical Nutrition，1992，55（1）：299S-308S.

[17]陳勇江，王金榮，蘇蘭利，等. 阿司匹林誘導(dǎo)大鼠腸道損傷模型的構(gòu)建[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2020，32（2）：898-904.

[18]姜慧慧，黃麗娜，吳寶成，等. 猴頭菇多糖對(duì)MDRV感染番鴨病死率及腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國家禽，2015，37（5）：22-26.

[19]吳 杰，鄧 波，李孝輝，等. 丁酸梭菌抑制脂多糖致急性應(yīng)激大鼠腸道損傷的效果研究[J]. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2018，30（4）：1530-1537.