劉燦玉 楊峰 陸信娟 趙永強(qiáng) 張碧薇 楊青青 葛杰 樊繼德

摘要：以徐蒜917常規(guī)栽培種作為對(duì)照（CK），選用脫毒F1、F2、F3、F7代作為試驗(yàn)材料，研究脫毒對(duì)大蒜生長、碳氮組分含量及其關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明，脫毒有利于提高大蒜農(nóng)藝性狀指標(biāo)，且隨繁殖世代的增加，其綜合生長勢(shì)呈先增后降的趨勢(shì)，以F2代綜合長勢(shì)較好，F(xiàn)7代除假莖粗、葉長和葉寬仍顯著高于CK外，其他與CK無顯著差異。脫毒大蒜葉片色素含量隨繁殖世代的增加呈下降趨勢(shì)，且處理間差異在抽薹期大于鱗莖膨大期。在抽薹期和鱗莖膨大期，脫毒大蒜葉片總糖、還原糖和蔗糖含量均高于CK，蔗糖磷酸合成酶（SPS）活性亦顯著增加，且均以F2代最高。隨繁殖世代的增加，脫毒大蒜葉片蔗糖合成酶（SS）活性在抽薹期呈先降后升的趨勢(shì)，而在鱗莖膨大期呈先升后降的趨勢(shì)。脫毒有利于提高大蒜葉片中抽薹期和鱗莖膨大期NO-3、可溶性蛋白和游離氨基酸含量，硝酸還原酶（NR）、谷酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合酶（GOGAT）活性顯著增加，脯氨酸含量在鱗莖膨大期亦顯著增加。綜上所述，脫毒有利于大蒜生長，增強(qiáng)其碳氮代謝關(guān)鍵酶活性，促進(jìn)碳氮吸收同化、糖的積累和蛋白質(zhì)合成，但隨著脫毒大蒜繁殖世代的增加，其生長優(yōu)勢(shì)會(huì)逐漸喪失。

關(guān)鍵詞：脫毒大蒜;抽薹期;鱗莖膨大期;生長;碳代謝;氮代謝;碳氮代謝關(guān)鍵酶

中圖分類號(hào)： S633.401? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）08-0141-04

大蒜屬無性繁殖作物，主要通過分瓣或形成氣生鱗莖的方式進(jìn)行繁殖，母本鱗莖一旦被病毒侵入，就會(huì)導(dǎo)致病毒在大蒜植株體內(nèi)世代積累[1-2]。隨著多年種植，主產(chǎn)區(qū)大蒜病毒病日趨嚴(yán)重，危害程度日益加劇，已成為限制大蒜優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的主要因素之一。病毒病可造成大蒜品種退化，產(chǎn)量顯著降低[3-4]，嚴(yán)重時(shí)可造成大蒜僵苗不發(fā)，甚至絕產(chǎn)不收[5]，同時(shí)會(huì)造成大蒜鱗莖整齊度差，進(jìn)而影響大蒜商品性，降低其市場競爭力和經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前，培育和栽培無病毒種苗是防治病毒病的根本措施[6]。吳青青等認(rèn)為，控制病毒病的傳播目前最有效的做法是種苗脫毒[7]。趙碩等研究發(fā)現(xiàn)，脫毒大蒜原原種和原種的長勢(shì)和鱗莖質(zhì)量均顯著好于常規(guī)大蒜種植[8];徐培文等研究發(fā)現(xiàn)，太倉大蒜脫毒后再次感染較慢，可在5代內(nèi)仍保持高產(chǎn)[9];劉文英等研究表明，蒼山大蒜脫毒后種至第4代，仍有顯著增產(chǎn)效果，經(jīng)濟(jì)效益明顯，脫毒原種在產(chǎn)區(qū)可利用至第5代[10]。與常規(guī)栽培種相比，大蒜脫毒后長勢(shì)旺盛，可顯著提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，但目前大多數(shù)報(bào)道僅局限于觀察、比較脫毒大蒜的增產(chǎn)效果，而對(duì)于脫毒影響大蒜生長的生理機(jī)制的研究較少。碳氮代謝作為植株最基本、最重要的生理代謝過程[11]，其在作物生育期間的動(dòng)態(tài)變化直接影響光合產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)化及蛋白質(zhì)的合成等過程，對(duì)植物正常生長發(fā)育有著非常重要的影響[12]。本試驗(yàn)研究脫毒對(duì)大蒜生長、碳氮組分含量及其關(guān)鍵酶活性的影響，以期為深入研究脫毒大蒜增產(chǎn)機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)示范基地進(jìn)行，脫毒917大蒜由莖尖脫毒組培技術(shù)獲得試管苗（已病毒檢測(cè)為無病毒株），然后馴化獲得原原種，即為脫毒F1代，由原原種做種蒜獲得原種，即為脫毒F2代，以此類推。分別選擇脫毒F1、F2、F3、F7代作為試驗(yàn)材料，以917常規(guī)栽培種作為對(duì)照（CK），于2019年10月4日播種于網(wǎng)室中，并加蓋防蟲網(wǎng)，每個(gè)試驗(yàn)材料重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列，每個(gè)小區(qū)面積為20 m2，其他栽培方式按照徐州當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)栽培水平進(jìn)行。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

根據(jù)《大蒜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[13]調(diào)查大蒜農(nóng)藝性狀。分別于抽薹期（2020年4月7日）、鱗莖膨大期（2020年5月7日）取大蒜葉片，用液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中，用于指標(biāo)測(cè)定。采用乙醇提取法測(cè)定葉片色素含量[14];硝態(tài)氮（NO-3-N）含量的測(cè)定采用趙世杰的方法[14];參考Saladin等的方法測(cè)定銨態(tài)氮（NH+4-N）、游離氨基酸和游離脯氨酸含量[15];采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量[16];總糖和蔗糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定[17];還原糖含量的測(cè)定采用3，5-二硝基比色法[18];硝酸還原酶（NR）活性的測(cè)定采用活體法[14];參照Wang等的方法測(cè)定谷酰胺合成酶（GS）活性[19];參照Groat等的方法測(cè)定谷氨酸合酶（GOGAT）活性[20];蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）活性參照高俊鳳的方法測(cè)定[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別采用Microsoft Excel 2003、DPS 7.5軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理和處理間差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans新復(fù)極差法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫毒對(duì)大蒜農(nóng)藝性狀的影響

由表1可知，脫毒有利于提高大蒜農(nóng)藝性狀指標(biāo)。隨繁殖世代的增加，脫毒大蒜株高、假莖高及葉長均呈先增后降的趨勢(shì)，大體以F2代最好，F(xiàn)1代次之，F(xiàn)7代僅葉長仍顯著高于CK，其株高和假莖高與CK無差異。脫毒大蒜處理組間株幅呈下降趨勢(shì)，且F7代與CK無差異，顯著低于其他世代。脫毒大蒜間假莖粗無差異，均顯著高于CK。脫毒大蒜間葉寬以F7代最寬，顯著高于其他世代。脫毒大蒜葉片數(shù)僅F1代顯著高于CK，其他與CK無顯著差異。

2.2 脫毒對(duì)大蒜葉片色素含量的影響

由表2可知，脫毒有利于提高大蒜葉片色素含量。在抽薹期，與CK相比，脫毒大蒜葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均顯著增加，但隨繁殖世代的增加，脫毒大蒜的葉片色素含量呈下降趨勢(shì)，葉綠素a和b均以脫毒F1代含量最高，F(xiàn)2代次之，F(xiàn)3代與F7代差異不顯著，類胡蘿卜素含量在F1代和F2代間無差異，顯著高于F3代和F7代。至鱗莖膨大期，脫毒大蒜葉片色素含量隨繁殖世代的增加亦呈下降趨勢(shì)，但僅F1代顯著高于其他世代。

2.3 脫毒對(duì)大蒜葉片糖含量及酶活性的影響

由表3可知，與CK相比，脫毒有利于提高大蒜葉片糖含量。在抽薹期，隨繁殖世代的增加，脫毒大蒜葉片總糖、蔗糖含量及SPS活性均呈先增后降的趨勢(shì)，且均以F2代最高，而SS活性呈先降后升的趨勢(shì)，以脫毒F2代活性最低，與此同時(shí)，還原糖含量呈下降趨勢(shì)，脫毒F1代和脫毒F2代差異不顯著。鱗莖膨大期的大蒜葉片總糖、蔗糖含量及SPS活性等的變化趨勢(shì)與抽薹期基本一致，但SS活性與之相反，呈先升后降的趨勢(shì)，以脫毒F3代活性最高，脫毒F2代次之。

2.4 脫毒對(duì)大蒜葉片氮代謝相關(guān)物質(zhì)含量及酶活性的影響

由表4可知，與CK相比，脫毒有利于提高大蒜葉片的NO-3、可溶性蛋白、游離氨基酸及脯氨酸含量。抽薹期，隨繁殖世代的增加，脫毒大蒜葉片NO-3、游離氨基酸含量及NR活性均呈先增后降的趨勢(shì)，以脫毒F2代含量最高;與此同時(shí)，NH+4含量呈增加趨勢(shì)，以脫毒F3含量最高;而可溶性蛋白含量及GS、GOGAT活性均呈下降趨勢(shì)，以脫毒F1代最高，脫毒F7代最低，且均顯著高于CK;各處理間脯氨酸含量差異不顯著。

至鱗莖膨大期，各處理間大蒜葉片NH+4含量無顯著差異;可溶性蛋白和游離氨基酸含量均隨繁殖世代的增加呈先增后降的趨勢(shì)，以脫毒F2代含量最高，脫毒F1代和脫毒F7代間差異不顯著;脯氨酸含量呈下降趨勢(shì)，以F1代最高;大蒜葉片NO-3含量及NR、GS、GOGAT活性變化趨勢(shì)與抽薹期基本一致。

3 討論與結(jié)論

前人研究認(rèn)為，無性繁殖作物在長期生產(chǎn)上易受到病毒侵染和積累[4，21]，可導(dǎo)致植株生長勢(shì)減弱，葉片卷曲或壞死，最終導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[22-23]。目前，種苗脫毒是減少和防止病毒造成損失的最有效方法[24-25]。蔣明權(quán)研究發(fā)現(xiàn)，甘薯脫毒后綜合生長勢(shì)優(yōu)于常規(guī)栽培種[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，大蒜脫毒有利于提高其生長勢(shì)，且以脫毒F2代綜合生長勢(shì)較好，這可能是因?yàn)槊摱綟2代無病毒侵染或再次侵染后病毒積累尚較少，且繁殖營養(yǎng)體較大利于后期營養(yǎng)生長[27]。隨著繁殖代數(shù)的增加，脫毒F7代的生長勢(shì)已逐漸趨于常規(guī)栽培種，表明脫毒大蒜的生長優(yōu)勢(shì)會(huì)因病毒的再侵染和積累而逐漸喪失。

已有研究表明，植物被病毒侵染會(huì)造成其葉綠體結(jié)構(gòu)變化，功能遭到破壞，影響碳同化和代謝[28]。蔣明權(quán)研究發(fā)現(xiàn)，種苗脫毒可提高甘薯整個(gè)生育期的葉綠素含量[26]。在本試驗(yàn)中，大蒜脫毒后葉片色素含量顯著增加，這與劉文英等的研究結(jié)果[10]一致，表明種苗脫毒可避免病毒對(duì)大蒜葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的不良影響，從而為增強(qiáng)碳代謝提供基礎(chǔ)，但隨著繁殖世代的增加，葉片色素含量開始下降，這可能是由病毒的再侵染和積累造成的。目前有關(guān)脫毒對(duì)大蒜碳代謝影響的研究尚有欠缺，本試驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脫毒大蒜總糖、還原糖和蔗糖含量在抽薹期和鱗莖膨大期2個(gè)生育期內(nèi)均較高，且以F2代最高，SPS活性亦顯著增加，表明脫毒可提高大蒜葉中糖的合成代謝。此外，脫毒大蒜葉片SS活性在抽薹期低于常規(guī)栽培種，而在鱗莖膨大期反而上升，表明在抽薹期，大蒜脫毒在促進(jìn)葉片碳同化和轉(zhuǎn)化的同時(shí)還降低了糖的分解代謝;而在鱗莖膨大期，脫毒大蒜葉片中糖的分解代謝增強(qiáng)，這可能與光合產(chǎn)物從葉中向地下鱗莖輸出有關(guān)。

前人研究發(fā)現(xiàn)，脫毒植株氮代謝活躍，葉片NR活性增強(qiáng)[26]，游離脯氨酸含量增加[24]。本試驗(yàn)中，抽薹期和鱗莖膨大期脫毒大蒜葉片中NO-3含量和NR活性均顯著增加，至F7代時(shí)與常規(guī)栽培種差異逐漸變小，說明脫毒可增強(qiáng)植株對(duì)NO-3的吸收和同化能力，但隨繁殖世代的增加，病毒的再侵染和積累會(huì)導(dǎo)致其能力下降。與此同時(shí)，脫毒大蒜葉片中可溶性蛋白和游離氨基酸含量亦顯著增加，這可能與脫毒誘導(dǎo)了GS和GOGAT活性增加有關(guān)。脫毒F1代和F2代鱗莖膨大期脯氨酸含量明顯高于常規(guī)栽培種，而較高的脯氨酸含量可提高大蒜耐高溫能力[29]，避免此生育期內(nèi)高溫引起的大蒜早衰，這或許是脫毒大蒜增產(chǎn)的原因之一。

在本試驗(yàn)中，脫毒可提高大蒜長勢(shì)，葉綠素含量亦顯著增加，碳氮代謝關(guān)鍵酶活性增強(qiáng)，利于糖分積累和NO-3吸收同化，但隨著繁殖世代的增加，病毒的再侵染和積累可導(dǎo)致生長優(yōu)勢(shì)下降，種性退化。

參考文獻(xiàn)：

[1]高山林，金雍安，蔡朝暉，等. 大蒜分生組織培養(yǎng)脫病毒和快速繁殖技術(shù)[J]. 植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2000，9（3）：15-18.

[2]陳世儒，黃菊輝.大蒜離體快繁及脫毒[J]. 園藝學(xué)報(bào)，1991，18（3）：245-250.

[3]李金娟. 大蒜病毒病原的分子鑒定與序列分析[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[4]Fan B L，He R F，Shang Y T，et al. System construction of virus-free and rapid-propagation technology of Baodi garlic （Allium sativum L.）[J]. Scientia Horticulturae，2017，225：498-504.

[5]高 暢，楊 飛，沈若剛，等. 嘉定白蒜脫毒微鱗莖誘導(dǎo)的快繁技術(shù)研究[J]. 中國蔬菜，2019（3）：66-72.

[6]王 濤. 大蒜莖尖脫毒技術(shù)研究及酶活性分析[D]. 大連：大連工業(yè)大學(xué)，2013.

[7]吳青青，王維澤，崔 嵬，等. 百合莖尖培養(yǎng)材料的篩選及其組培配方的優(yōu)化[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（9）：69-73.

[8]趙 碩，黃丹楓，高 暢，等. 組培脫毒嘉定白蒜原原種生產(chǎn)的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)試驗(yàn)研究[J]. 中國蔬菜，2019（10）：65-71.

[9]徐培文，孫慧生，孫瑞杰，等. 大蒜莖尖培養(yǎng)脫毒及增產(chǎn)效果的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1991，23（6）：6-10.

[10]劉文英，李 輝，張鳳倫，等. 脫毒蒼山大蒜增產(chǎn)效果及生物學(xué)基礎(chǔ)[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1998，13（4）：74-79.

[11]李 祎，楊順瑛，郝東利，等. 利用gs1.1和gs1.2突變體研究外源蔗糖對(duì)高銨脅迫擬南芥碳氮代謝的影響[J]. 土壤，2020，53（1）：21-29.

[12]張建新，葛淑芳，吳玉環(huán)，等. 干旱脅迫對(duì)紫金牛葉片碳氮代謝的影響[J]. 水土保持學(xué)報(bào)，2015，29（2）：278-282.

[13]李錫香，朱德蔚. 大蒜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[14]趙世杰. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[15]Saladin G，Magné C，Clément C.Stress reactions in Vitis vinifera L. following soil application of the herbicide flumioxazin[J]. Chemosphere，2003，53（3）：199-206.

[16]王月福，于振文，李尚霞，等. 氮素營養(yǎng)水平對(duì)冬小麥氮代謝關(guān)鍵酶活性變化和籽粒蛋白質(zhì)含量的影響[J]. 作物學(xué)報(bào)，2002，28（6）：743-748.

[17]高 松，劉 穎，劉學(xué)娜，等. 光質(zhì)對(duì)大蔥葉片碳氮代謝的影響[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2020，56（3）：565-572.

[18]高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京：高等教育出版社，2006.

[19]Wang L，Zhou Q X，Ding L L，et al. Effect of cadmium toxicity on nitrogen metabolism in leaves of Solanum nigrum L. as a newly found cadmium hyperaccumulator[J]. Journal of Hazardous Materials，2008，154（1/2/3）：818-825.

[20]Groat R G，Vance C P.Root nodule enzymes of ammonia assimilation in alfalfa （Medicago sativa L.） developmental patterns and response to applied nitrogen[J]. Plant Physiology，1981，67（6）：1198-1203.

[21]Dijk P. Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses[J]. Netherlands Journal of Plant Pathology，1993，99（5/6）：233-257.

[22]Pradhan S，Regmi T，Ranjit M，et al. Production of virus-free orchid Cymbidium aloifolium （L.） Sw.by various tissue culture techniques[J]. Heliyon，2016，2（10）：176.

[23]Ling K S，Jackson D M，Harrison H，et al. Field evaluation of yield effects on the USA heirloom sweetpotato cultivars infected by sweet potato leaf curl virus[J]. Crop Protection，2010，29（7）：757-765.

[24]陳選陽，陳鳳翔，袁照年，等. 甘薯脫毒對(duì)一些生理指標(biāo)的影響[J]. 福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（4）：449-453.

[25]沈升法，吳列洪，項(xiàng) 超. 甘薯脫毒微型薯育苗技術(shù)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（5）：97-100.

[26]蔣明權(quán). 甘薯莖尖脫毒、快繁技術(shù)及其脫毒苗增產(chǎn)機(jī)理的研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

[27]嚴(yán)根元，顧丁元. 種瓣大小對(duì)大蒜生長發(fā)育及產(chǎn)量的影響[J]. 上海蔬菜，1990（3）：29.

[28]Lehrer A T，Moore P H，Komor E.Impact of sugarcane yellow leaf virus （ScYLV） on the carbohydrate status of sugarcane：comparison of virus-free plants with symptomatic and asymptomatic virus-infected plants[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2007，70（4/5/6）：180-188.

[29]邱念偉，楊翠翠，付文誠，等. 高鹽和高溫脅迫下外源脯氨酸對(duì)PSⅡ顆粒的保護(hù)作用[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2013，49（6）：586-590.