郝禮森 楊小師 張朋壘 陳盼盼 展宗媛 何宇 苗笑佳

含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶2 (SH2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)是一個廣泛表達(dá)于人體各個組織和細(xì)胞，并具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶，其過表達(dá)可通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡參與多種惡性腫瘤的形成及發(fā)展[1- 4]。過去對SHP2的研究多集中在腫瘤領(lǐng)域，近年來其在非腫瘤領(lǐng)域的作用也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[5]，HBV感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌患者的肝組織中，伴有纖維化的癌旁肝組織SHP2表達(dá)增高；另有研究發(fā)現(xiàn)，體外活化肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)的SHP2表達(dá)下調(diào)，其增殖受到抑制[6]。而HSC是肝臟的主要纖維生成細(xì)胞，在肝纖維化病理過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。這提示肝纖維化病理過程中肝組織的SHP2表達(dá)可能異常，并可能通過影響HSC的生物學(xué)行為參與肝纖維化的發(fā)病機制，但迄今有關(guān)肝纖維化病理過程中肝組織SHP2表達(dá)與在體HSC凋亡的關(guān)系仍不清楚。本研究采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型，探討肝纖維化病理過程中纖維化肝組織的SHP2表達(dá)與在體肝星狀細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

材料與方法

一、實驗動物及試劑

清潔級健康雄性 SD大鼠50只(350～400 g/只)由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，大鼠均在華北理工大學(xué)動物實驗中心按清潔級要求飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水； TUNEL試劑盒購于北京中山生物試劑公司；兔抗 SHP2多克隆抗體購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白 (alpha-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體購于臺灣arigo公司； Masson染色試劑盒購于北京雷根生物有限公司；SP試劑購于北京中山金橋生物有限公司。

二、方法

(一)實驗分組及大鼠肝纖維化模型的建立 上述SD大鼠50只被隨機分成對照組(10只)、模型組(40只)，大鼠肝纖維化模型采用腹腔注射四氯化碳法構(gòu)建[9-10]。模型組大鼠腹腔注射50%四氯化碳橄欖油混合液，劑量為1 mL/kg，每周2 次，共8周；對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，劑量同模型組，每周2 次。在造模 2、4、6、8周分別取模型組大鼠10只，麻醉后切開大鼠腹腔，取適量大鼠肝組織，用4%多聚甲醛固定后用于免疫組織化學(xué)及HE、Masson三色染色。對照組大鼠肝組織標(biāo)本與8周模型組大鼠一同留取。本研究所涉及的動物實驗操作經(jīng)華北理工大學(xué)實驗動物倫理委員會審批。

(二)肝組織病理學(xué)及SHP2免疫組織化學(xué)染色 大鼠肝組織以4%多聚甲醛溶液固定，石蠟常規(guī)包埋并做成5 μm的連續(xù)切片，進(jìn)行HE及Masson三色染色，觀察肝組織病理學(xué)變化。應(yīng)用SP法按試劑操作說明進(jìn)行SHP2免疫組織化學(xué)染色。陰性對照用PBS代替一抗染色，染色結(jié)果為棕褐色代表陽性表達(dá)。SHP2免疫組化染色圖像應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件分析，積分光密度值 (IOD) 被用于表示SHP2陽性表達(dá)水平。

(三) α-SMA免疫組織化學(xué)及TUNEL雙重染色檢測在體HSC凋亡 肝組織石蠟切片脫蠟及水化后滴加蛋白酶K，然后放于37 ℃烤箱中30 min；滴加3%過氧化氫于室溫下孵育20 min；滴加TUNEL檢測液于37 ℃孵育60 min后用PBS洗5 min，再滴加適量的標(biāo)記反應(yīng)終止液于室溫下孵育10 min；滴加Streptavidin-HRP工作液于室溫下孵育30 min；滴加DAB顯色液；滴加封閉液10%山羊血清于37 ℃孵育30 min，然后去除封閉液，滴加一抗小鼠抗α-SMA 單克隆抗體(1∶100稀釋)于4 ℃孵育過夜，取出肝組織切片于室溫下30 min后棄去一抗；滴加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶200稀釋)二抗于 37 ℃ 30 min。上述每一處理步驟結(jié)束后均用PBS沖洗3次，每次5 min。再次于上述處理的肝組織切片上滴加DAB顯色液，并在出現(xiàn)黃色后立即停止，用自來水沖洗2次(5 min/次)后在蘇木素液中染色及放入10%鹽酸酒精液中并水洗反藍(lán)，再用酒精梯度脫水，最后用中性樹膠封片，陰性對照不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶，其余操作不變。將各組染色的肝組織切片放在光鏡下觀察，凋亡活化肝星狀細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)呈棕黃色而胞核呈藍(lán)褐色或藍(lán)黑色(α-SMA免疫組織化學(xué)染色將活化HSC胞漿染成棕黃色，TUNEL染色將凋亡的活化HSC胞核染成藍(lán)褐色或藍(lán)黑色)。隨機選取5個高倍視野，計數(shù)凋亡的活化肝星狀細(xì)胞及總的活化肝星狀細(xì)胞，并計算凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=凋亡的活化肝星狀細(xì)胞數(shù)/總的活化肝星狀細(xì)胞數(shù)×100%)。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、大鼠肝組織病理組織學(xué)變化

Masson三色及HE染色顯示，大鼠肝纖維化模型成功構(gòu)建，隨著造模時間延長，大鼠肝纖維化逐漸加重(圖1)。

二、大鼠肝組織的SHP2表達(dá)變化

免疫組織化學(xué)染色顯示，與對照組大鼠肝組織SHP2陽性表達(dá)IOD(0.19±0.01)比較，不同造模時間(2、4、6、8周)的大鼠肝組織SHP2陽性表達(dá)IOD(0.23±0.01, 0.27±0.01, 0.30±0.01, 0.33±0.01)明顯增加，并隨著造模時間的延長逐漸升高(P<0.05，圖2)。

三、大鼠肝組織中HSC凋亡變化

α-SMA免疫組化與TUNEL雙染顯示，模型組大鼠肝組織中活化肝星狀細(xì)胞與凋亡肝星狀細(xì)胞同時存在，而對照組大鼠肝組織中幾乎見不到凋亡的肝星狀細(xì)胞；在大鼠肝纖維化過程中，隨著肝纖維化程度加重，不同造模時間(2、4、6、8周)大鼠肝組織中肝星狀細(xì)胞凋亡指數(shù)(47%±1%、41%±2%、35%±1%、29%±1%)逐漸下降(P<0.05，圖3)。

四、SHP2表達(dá)與在體HSC凋亡的相關(guān)性

Pearson’s相關(guān)性分析顯示，不同造模時間的大鼠肝組織SHP2免疫組化結(jié)果與不同造模時間的大鼠肝組織中活化肝星狀細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(r值為-0.958,P<0.05)。上述分析表明，在四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化病理過程中，纖維化大鼠肝組織SHP2表達(dá)與在體HSC的凋亡呈顯著負(fù)相關(guān)。

A:對照組HE染色；B:造模6周HE染色；C: 對照組Masson三色染色；D:造模6周Masson三色染色

A:對照組；B:造模2周；C:造模4周；D:造模6周；E:造模8周

A:對照組；B:造模2周；C:造模4周；D:造模6周； E:造模8周

討 論

肝纖維化是各種慢性肝病演變?yōu)楦斡不牟±磉^程，在參與此過程的眾多細(xì)胞中肝星狀細(xì)胞是最重要的細(xì)胞，其活化及增殖在肝纖維化的形成及發(fā)展中扮演重要角色[11-14]；但在肝纖維化恢復(fù)期活化肝星狀細(xì)胞的清除主要通過細(xì)胞凋亡機制實現(xiàn)[7, 15]。因此誘導(dǎo)活化HSC凋亡則成為逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。SHP2是具有促癌作用的蛋白酪氨酸磷酸酶，其在多種腫瘤中過表達(dá)，并可通過抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-4]。近年來對SHP2的研究已從腫瘤領(lǐng)域延伸至非腫瘤領(lǐng)域。有研究發(fā)現(xiàn)，在HBV感染相關(guān)的肝細(xì)胞癌患者的肝組織中，伴有纖維化的癌旁肝組織SHP2表達(dá)增高[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝組織的SHP2表達(dá)明顯高于正常大鼠肝組織，這與上述研究結(jié)果及SHP2在多種腫瘤組織中過表達(dá)相一致，證實在肝纖維化病理過程中肝組織的SHP2表達(dá)異常。同時，本研究也發(fā)現(xiàn)，在大鼠肝纖維化病理過程中，隨著肝纖維化程度的加重，大鼠肝組織中在體肝星狀細(xì)胞的凋亡指數(shù)(凋亡活化肝星狀細(xì)胞占總的活化肝星狀細(xì)胞百分比)逐漸下降，并與逐漸升高的肝組織SHP2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。如上所述，HSC 凋亡對肝纖維化的修復(fù)具有重要意義， 在肝纖維化恢復(fù)過程中 ，活化 HSC 數(shù)量的減少主要是通過細(xì)胞凋亡機制實現(xiàn)。盡管肝纖維化病理過程中影響在體HSC凋亡的因素較多，但SHP2在腫瘤方面的研究已證實,其過表達(dá)可通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡促進(jìn)腫瘤的形成及發(fā)展，并且已有體外研究顯示，體外活化HSC的SHP2表達(dá)下調(diào)，其增殖受到明顯抑制[6]。故本研究提示，肝纖維化病理過程中肝組織的SHP2表達(dá)上調(diào)可能通過抑制在體活化HSC的凋亡參與了肝纖維化的病理過程，這一結(jié)論尚需進(jìn)一步研究證實。