姚元謙，呂建林，柳琳琳，毛德文，黃 嫻，黃小英

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023)

肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤，主要為肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinona，HCC)，其病情發(fā)展迅速，病死率高，5年生存率低于15%。我國(guó)屬于肝癌高風(fēng)險(xiǎn)地區(qū)，主要與慢性乙型肝炎病毒感染及黃曲霉毒素暴露有關(guān)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)2020年我國(guó)肝癌新發(fā)病例41萬，死亡病例39萬，占全球肝癌死亡病例的51%，是我國(guó)惡性腫瘤死亡的第二大誘因[1-2]。目前治療肝癌的手段包括局部的手術(shù)、放療、消融、介入治療，及全身性的化療、細(xì)胞免疫、靶向藥物治療等[3-5]，手術(shù)治療是肝癌早期的有效治療手段，可惜大部分患者確診時(shí)已是中晚期，故藥物干預(yù)是治療肝癌的重要手段。目前西醫(yī)治療不良反應(yīng)較多，長(zhǎng)期服用西藥還可能產(chǎn)生耐藥性，患者預(yù)后不佳[6-7]。中醫(yī)藥治療腫瘤有著悠久的歷史，療效確切，具有抑制腫瘤生長(zhǎng)、提高患者生活質(zhì)量、減輕臨床癥狀等作用，中西醫(yī)聯(lián)合治療能夠減少西藥毒副作用，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，延緩病情進(jìn)展，中醫(yī)藥防治腫瘤有著不可忽視的重要作用[8-9]。解毒化瘀顆粒是毛德文教授在“毒邪病因”原理指導(dǎo)下總結(jié)得出的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有解毒祛邪、化瘀消癥之效，全方由茵陳、大黃、白花蛇舌草、赤芍、郁金、石菖蒲組成[10]。此方本是毛德文教授為治療肝衰竭而立，但其治病機(jī)制同樣也符合肝癌“毒、瘀、積”的病機(jī)治療[11]。此前研究已表明解毒化瘀顆粒治療肝疾病時(shí)，可通過NO-cGMP、NF-κB、c-Met等信號(hào)通路起到調(diào)控作用，涉及caspase、TNFR I、Gadd45a、SOCS、TGF-β等作用靶點(diǎn)[12]。本次研究整合GEO基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，進(jìn)一步系統(tǒng)地分析解毒化瘀顆粒治療肝癌的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及調(diào)控途徑，并進(jìn)行分子模擬驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1挖掘GEO芯片獲取肝癌靶點(diǎn) 以“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞，檢索GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)篩選相關(guān)的基因芯片，獲取GSE84402芯片數(shù)據(jù)集，點(diǎn)擊“Series Matrix File”下載芯片數(shù)據(jù)并下載GPL570基因芯片注釋文件。利用R軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分組，應(yīng)用“l(fā)ima”、“pheatmap”程序包，以|logFC|≥1、adj.P.Val<0.05為篩選條件，獲取與肝癌相關(guān)的顯著性差異基因，分別選取上調(diào)基因與下調(diào)基因中的前20個(gè)基因繪制熱圖及火山圖。

1.2獲取解毒化瘀顆粒的活性成分及靶點(diǎn) 通過檢索TCMSP(https://tcmsp-e.com/)、SymMap(www.symmap.org)數(shù)據(jù)庫獲取解毒化瘀顆粒中每味藥物的活性成分，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件進(jìn)行收集。通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載各活性成分的3D Conformer數(shù)據(jù)文件，若PubChem數(shù)據(jù)庫中未收錄的活性成分則剔除，將3D Conformer數(shù)據(jù)上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進(jìn)行藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.3篩選共同靶點(diǎn)并構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò) 將“1.1、1.2”項(xiàng)下的疾病、藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入R軟件，應(yīng)用“venn”程序包繪制藥物-疾病靶點(diǎn)Venn圖，并映射篩選出藥物-疾病交集靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)提交至STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)獲取PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，下載該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的TSV格式文件并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行拓?fù)浞治?，通過Degree值(連接度)的中位數(shù)篩選出解毒化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點(diǎn)。

1.4生物信息富集分析 將“1.3”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)上傳至DAVID平臺(tái)(https://david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析和基因本體論(GO)功能富集分析，包括生物學(xué)過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)及分子功能(MF)。根據(jù)PValue值選取相關(guān)度最高的分析結(jié)果，應(yīng)用R軟件進(jìn)行可視化處理。

1.5構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 為了更清晰地展示解毒化瘀顆粒治療肝癌的作用機(jī)制，運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件繪制活性成分-基因靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖，并通過Degree值預(yù)測(cè)解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 選取“1.5”項(xiàng)中主要活性成分的前5個(gè)作為小分子配體，選取與這5個(gè)活性成分連接度最高且是“1.3”項(xiàng)下的核心靶點(diǎn)作為蛋白受體。從TCMSP數(shù)據(jù)下載主要活性成分的MOL2文件，從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org)下載蛋白受體的pdb文件，使用PyMOL軟件刪除蛋白受體的水分子及配體，運(yùn)用AutoDockTools1.5.6軟件將MOL2文件及pdb文件轉(zhuǎn)換為pdbqt文件，并確定蛋白受體的活性口袋，最后通過AutoDock Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接。

2 結(jié) 果

2.1肝癌GEO芯片差異基因分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫下載GSE84402芯片數(shù)據(jù)集及基因芯片注釋文件，共收集28個(gè)樣本，其中cancertissue組(肝癌組織樣本)14例，non-canceroustissue組(癌旁組織樣本)14例。應(yīng)用R軟件對(duì)芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及分組，并篩選顯著性差異基因。共獲得差異基因1 423個(gè)，其中在肝癌中表達(dá)上調(diào)的基因480個(gè)(如CCNB1、CDKN3、RACGAP1等)，在肝癌中表達(dá)下調(diào)的基因943個(gè)(如FCN2、ABCA8、OIT3等)。分別選取上調(diào)基因與下調(diào)基因的前20個(gè)繪制熱圖及火山圖，見圖1及圖2，圖中綠色為低表達(dá)，黑色為中表達(dá)，紅色為高表達(dá)。

2.2解毒化瘀顆粒的活性成分及靶點(diǎn)獲取 通過TCMSP、SymMap數(shù)據(jù)庫收集解毒化瘀顆粒中每味中藥的活性成分，共獲得84個(gè)活性成分。將活性成分上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，選取每個(gè)活性成分中概率前100個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分析，共獲取2 116個(gè)藥物靶點(diǎn)，經(jīng)剔除重復(fù)靶點(diǎn)后剩余682個(gè)。

2.3交集靶點(diǎn)并構(gòu)建PPI核心網(wǎng)絡(luò) 將藥物-疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入R軟件，繪制Venn圖(見圖3)，并映射篩選出交集靶點(diǎn)122個(gè)。將122個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING平臺(tái)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，下載該網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)的TSV格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2進(jìn)行拓?fù)浞治觯鶕?jù)Degree值(連接度)的中位數(shù)篩選出核心靶點(diǎn)，包括雌激素受體1(ESR1)(31)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)(24)、細(xì)胞色素P450 3A4酶(CYP3A4)(23)、MMP9(21)、雄激素受體(AR)(20)、CYP1A1(20)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體C(PTPRC)(19)、胸苷酸合成酶(TYMS)(19)、周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)(19)、Polo樣激酶1(PLK1)(18)等，提示這些靶點(diǎn)在解毒化瘀顆粒治療肝癌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，篩選流程見圖4。

2.4生物信息富集分析 將122個(gè)交集靶點(diǎn)提交至DAVID平臺(tái)進(jìn)行富集分析，結(jié)果得到生物學(xué)進(jìn)程條目204條，主要包括藥物反應(yīng)、類固醇代謝過程、外源性代謝過程、環(huán)氧酶P450途徑等生物進(jìn)程；得到細(xì)胞組分條目33條，主要在胞質(zhì)、細(xì)胞外泌體、核漿等處發(fā)揮作用；得到分子功能條目73條，主要包括ATP結(jié)合、蛋白同源二聚體化活性、氧化還原酶活性、蛋白激酶結(jié)合等；得到信號(hào)通路29條，主要富集在化學(xué)致癌作用通路、類固醇激素生物合成通路、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性藥物的代謝作用通路、花生四烯酸代謝等通路上。應(yīng)用R軟件對(duì)主要條目進(jìn)行繪圖，見圖5及圖6。

2.5構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò) 為了更加明確解毒化瘀顆粒治療肝癌的活性成分、基因靶點(diǎn)與作用通路之間的關(guān)系，故構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。其中橙色圓形節(jié)點(diǎn)為靶點(diǎn)，深紅色倒三角形節(jié)點(diǎn)為通路，淡紅色正方形節(jié)點(diǎn)為活性成分，節(jié)點(diǎn)越大說明連接度值越大。通過網(wǎng)絡(luò)圖可直觀看出，解毒化瘀顆粒對(duì)肝癌具有多途徑、多成分的作用機(jī)制。根據(jù)Degree值，預(yù)測(cè)其治療肝癌的主要活性成分，見表1。

表1 解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分

2.6活性成分與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接 選取“2.5”項(xiàng)下的主要活性成分與“2.3”項(xiàng)下的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，運(yùn)用AutoDock Vina軟件進(jìn)行對(duì)接并預(yù)測(cè)結(jié)合能力，結(jié)合能越低則構(gòu)象越穩(wěn)定。當(dāng)結(jié)合能<0 kcal/mol時(shí)表明配體與受體間有結(jié)合活性，當(dāng)結(jié)合能<-5.0 kcal/mol時(shí)表明結(jié)合良好[13]。結(jié)果顯示，異鼠李素-MMP9(-7.9 kcal/mol)、β-谷甾醇-ESR1(-8.2 kcal/mol)、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌-CYP1A2(-11.3 kcal/mol)、油酸乙酯- PTPRC(-5.7 kcal/mol)、茵陳黃酮- PTGS2(-8.8 kcal/mol)，提示各分子間具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，見圖8。

3 討 論

解毒化瘀顆粒是毛德文教授多年臨證經(jīng)驗(yàn)?zāi)Y(jié)而出，全方由茵陳30 g、大黃(后下)15 g、白花蛇舌草30 g、赤芍50 g、郁金15 g、石菖蒲15 g組成，諸藥相合，使熱去毒解，瘀散痰化，中焦氣機(jī)升降有序，肝膽疏泄氣暢血行，三焦通利，共奏解毒化瘀、生新見長(zhǎng)之效[12]。前期研究已表明本方對(duì)肝臟疾病有防治作用，本次研究整合GEO基因芯片數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)，進(jìn)一步系統(tǒng)地分析解毒化瘀顆粒治療肝癌的作用機(jī)制。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆粒治療肝癌的核心靶點(diǎn)有ESR1、PTGS2、CYP3A4、MMP9、AR、CYP1A1、PTPRC、TYMS、CDK1、PLK1等[13]。ESR1作為一種癌基因，是多種惡性腫瘤潛在的腫瘤抑制基因，在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及宮頸癌中，ESR1的表達(dá)水平明顯下調(diào)[14-15]。研究表明ESR1也是肝癌的腫瘤抑制基因，低ESR1表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]，相反，ESR1的過度表達(dá)可以抑制肝癌細(xì)胞發(fā)展，同時(shí)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[17]。PTGS2與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)是促進(jìn)肝癌發(fā)展的因素，通過抑制PTGS2/COX-2可以防止黃曲霉毒素驅(qū)動(dòng)肝癌的發(fā)生及進(jìn)展[18]。CYP3A4是細(xì)胞色素P450氧化酶家族成員之一，參與肝臟物質(zhì)代謝過程，60%的臨床藥物都要經(jīng)其代謝轉(zhuǎn)化，它能抑制或增加藥物活性[19]，研究發(fā)現(xiàn)在肝癌患者的肝癌組織中，CYP3A4的表達(dá)顯著降低[20]。MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)成員，參與正常生理過程中細(xì)胞外基質(zhì)的分解，MMP9與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展有關(guān)。當(dāng)MMP9表達(dá)上調(diào)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，腫瘤細(xì)胞由此進(jìn)入體循環(huán)形成新的腫瘤灶，同時(shí)MMP9促進(jìn)新血管的生成以維持腫瘤生長(zhǎng)[21]。有研究認(rèn)為MMP9在肝癌生長(zhǎng)浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過程中關(guān)系密切，可作為腫瘤分子標(biāo)志物[22]。AR屬于核受體超家族中的類固醇受體，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝癌中的巨噬細(xì)胞可能通過改變外泌體中的microRNA(miR-92a-2-5p)來降低肝癌細(xì)胞AR的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲[23]。TYMS是臨床中腫瘤化療藥物的作用靶點(diǎn)，被認(rèn)為是氟尿嘧啶類藥物的主要作用部位[24]，研究發(fā)現(xiàn)TYMS基因在肝癌中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)肝癌細(xì)胞DNA的合成，使腫瘤生長(zhǎng)、擴(kuò)散[25]。CDK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞周期調(diào)控中的重要因子。CDK1在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，且與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)的CDK1肝癌患者其預(yù)后較差[26]。

交集靶基因GO功能富集分析顯示，解毒化瘀顆粒治療肝癌主要涉及氧化還原過程、外源性代謝過程、環(huán)氧酶P450途徑、胞質(zhì)、細(xì)胞外泌體、ATP結(jié)合等方面。通過環(huán)氧酶P450生物途徑能夠?qū)⒒ㄉ南┧岽x為具有生物活性的類花生酸，類花生酸是包括炎癥在內(nèi)的許多生物過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，研究認(rèn)為其能抑制肝臟炎癥[27]。細(xì)胞外泌體是包含了復(fù)雜 RNA 和蛋白質(zhì)的小膜泡，其在肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲等方面起著重要的調(diào)控作用[28]，正常細(xì)胞源性外泌體對(duì)肝癌的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移有抑制作用[29]，而腫瘤細(xì)胞源性外泌體對(duì)肝癌的進(jìn)展、擴(kuò)散及耐藥性有促進(jìn)作用[30]。KEGG通路富集分析得到29條信號(hào)通路，主要富集在化學(xué)致癌作用通路、類固醇激素生物合成通路、細(xì)胞色素P450對(duì)外源性藥物的代謝作用通路、花生四烯酸代謝通路、P53信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等途徑上，涉及較多的基因依次為CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4、PIK3R1、ADH1B等，其中CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4也是PPI拓?fù)浞治鲋械暮诵陌悬c(diǎn)，都為細(xì)胞色素P450氧化酶家族成員之一。目前認(rèn)為黃曲霉毒素是肝癌的重要誘因之一，黃曲霉毒素是具有劇毒性、致畸性、免疫抑制性的化學(xué)致癌物，它可能通過化學(xué)致癌途徑誘導(dǎo)肝癌發(fā)生[31]。P53信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，其重要節(jié)點(diǎn)P53基因通常在癌癥患者中發(fā)生突變或失活，從而導(dǎo)致異常腫瘤細(xì)胞增殖[32]。有研究證實(shí)，通過miR-29b調(diào)控P53信號(hào)通路能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[33]。PI3K-Akt信號(hào)通路是已被確定的對(duì)癌癥有重要作用的主要信號(hào)通路之一，該通路在肝癌細(xì)胞中呈過度激活狀態(tài)，其通路中的節(jié)點(diǎn)是靶向藥物治療的重要靶點(diǎn)[34]。

進(jìn)一步構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，解毒化瘀顆粒治療肝癌的主要活性成分可能為異鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌、油酸乙酯、茵陳黃酮。異鼠李素與β-谷甾醇均有一定的抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。異鼠李素通過調(diào)控癌基因(P53、Survivin、Caspase-3)、腫瘤信號(hào)通路(MEK-ERK通路、MAPK/ERK通路)對(duì)腫瘤細(xì)胞起到治療作用[35]。研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素對(duì)人肝癌細(xì)胞有抑制作用，通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平將肝癌細(xì)胞阻滯在G2/M期并誘導(dǎo)其凋亡[36]。試驗(yàn)證明，β-谷甾醇能夠增加IL-2、IFN-γ水平，抑制IL-6、IL-10水平，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移[37-38]。

最后利用分子對(duì)接技術(shù)進(jìn)行虛擬驗(yàn)證，對(duì)主要的活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接分析，結(jié)果顯示所有對(duì)接結(jié)合能均<-5.0 kcal/mol，表示各主要活性成分與核心靶點(diǎn)間具有良好的結(jié)合力。

綜上所述，解毒化瘀顆粒中的異鼠李素、β-谷甾醇、2-甲氧基-3-甲基-9、10-蒽醌、油酸乙酯、茵陳黃酮等活性成分，通過上調(diào)ESR1、CYP3A4、CYP1A1、PTPRC及下調(diào)PTGS2、MMP9、AR、TYMS、CDK1、PLK1等核心靶點(diǎn)，調(diào)控化學(xué)致癌作用通路、細(xì)胞色素P450代謝通路、花生四烯酸代謝通路、P53信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等途徑，涉及氧化還原過程、環(huán)氧酶P450途徑、細(xì)胞外泌體、ATP結(jié)合等生物功能，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、擴(kuò)散及對(duì)藥物的耐藥性。本次分析結(jié)果表明解毒化瘀顆粒治療肝癌具有多途徑、多成分、多功能的作用機(jī)制，可對(duì)未來中醫(yī)藥防治肝癌的研究提供新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。