毛甜甜 白 衡 賈 寧

(甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，蘭州 730070)

免疫抑制是指動物機體免疫系統(tǒng)受到損傷而導致的暫時性或持久性的免疫機能障礙，使機體對各種病原易感性顯著增加的一種狀態(tài)。近年來，有關(guān)畜禽免疫抑制性疾病的報道不斷增多，其發(fā)病率與感染率也不斷增高和日趨嚴重，已成為制約我國畜牧業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的重大問題。因此，隨著中醫(yī)藥免疫學的發(fā)展，利用中藥材來調(diào)節(jié)動物機體免疫功能已成為研究的熱門話題。芒柄花素(formonetin, FMN)為異黃酮類化合物，又稱刺芒柄花素，廣泛存在于植物中。研究表明，F(xiàn)MN也是沙冬青種子中總黃酮的主要組成成分[1]，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗氧化、降血脂等作用[2-3]。由于FMN具有較低的副作用和毒性[4]，因此近年來成為研究熱點，但主要研究方向還在于其抗腫瘤作用。Wu等[5]研究證明FMN通過調(diào)控miR-21和抑癌基因PTEN抑制人膀胱癌細胞的增殖和侵襲性。張彥平等[6]研究證明FMN對動物機體免疫功能具有調(diào)節(jié)作用并對免疫器官及功能具有修復作用。但腸道黏膜免疫系統(tǒng)作為機體整個免疫網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，有關(guān)FMN對其影響等報道鮮見。因此，本研究旨在深入探索FMN對小鼠小腸黏膜免疫功能的影響，為進一步研發(fā)沙冬青種子總黃酮新型免疫增強劑奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

FMN(上海某生化科技有限公司)；環(huán)磷酰胺(美國Sigam公司)；白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；分泌型免疫球蛋白A(sIgA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗動物分組與試驗設(shè)計

50只清潔級昆明種小鼠，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2020—0002，20日齡、體重18～20 g，常規(guī)飼養(yǎng)管理，適應(yīng)1周后分組。隨機分為5組：空白對照組、免疫抑制模型組以及FMN低、中、高劑量組，每組10只(雌雄各占1/2)。

全部動物試驗共28 d。前7 d，空白對照組小鼠灌胃0.6 mL/d 生理鹽水，免疫抑制模型組與FMN低、中、高劑量組小鼠均灌胃40 mg/(kg·d)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)0.6 mL；后21 d，空白對照組與免疫抑制模型組小鼠每天灌胃0.6 mL生理鹽水，F(xiàn)MN低、中、高劑量組小鼠分別灌胃 50、150、250 mg/(kg·d)FMN 0.6 mL。常規(guī)飼養(yǎng)管理，每日稱取小鼠體重。末次給藥24 h后，脫臼處死，分別進行臟器指數(shù)、腸黏膜細胞因子及sIgA含量測定。同時，采集小鼠各段腸道黏膜，分別進行顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察。

1.3 胸腺和脾臟指數(shù)測定

取小鼠胸腺和脾臟，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，用濾紙吸去多余水分稱重，并計算胸腺和脾臟指數(shù)。

小鼠胸腺(脾臟)指數(shù)=小鼠胸腺(脾臟)

質(zhì)量/小鼠空腹體質(zhì)量。

1.4 小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量測定

取靠近十二指腸段空腸約2 cm，PBS沖洗后刮取腸黏膜，稱重，加入9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液，-20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量。

1.5 小腸黏膜顯微與超微結(jié)構(gòu)觀察

取十二指腸、空腸、回腸各3段(每段1.5 cm)，PBS沖洗后，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定。常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(厚度4 μm)，每隔5張切片取1張，進行蘇木精-伊紅(HE)染色和過碘酸雪夫(PAS)染色，鏡下觀察小腸黏膜結(jié)構(gòu)特點以及上皮細胞與杯狀細胞形態(tài)并拍照，Image-Pro Plus軟件測量腸絨毛高度和隱窩深度，計算絨腺比(絨腺比=絨毛高度/隱窩深度，V/C)，統(tǒng)計每100個上皮細胞間的上皮內(nèi)淋巴細胞(IELs)和杯狀細胞數(shù)量。取1 mm3回腸2.5%戊二醛固定，樹脂包埋，超薄切片(70 nm)，雙重染色(醋酸鈾、硝酸鉛)，透射電子顯微鏡分析、拍照。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 FMN對免疫抑制小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響

由表1可知，免疫抑制模型組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于空白對照組，尤其脾臟指數(shù)差異顯著(P<0.05)。證明CTX對小鼠胸腺和脾臟的發(fā)育產(chǎn)生了明顯抑制作用，表明小鼠免疫抑制模型復制成功。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均有不同程度的升高，尤其FMN中劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)升高，其中胸腺指數(shù)差異顯著(P<0.05)，脾臟指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。結(jié)果表明，F(xiàn)MN對免疫抑制小鼠胸腺、脾臟的生長發(fā)育具有顯著的促進作用。

表1 FMN對免疫抑制小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響

2.2 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量的影響

由表2可知，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜IL-2和IL-6含量均顯著低于空白對照組(P<0.05)，sIgA含量極顯著低于空白對照組(P<0.01)，這也證明CTX對小鼠小腸黏膜免疫功能產(chǎn)生了明顯抑制，導致小腸黏膜IL-2、IL-6含量大大降低。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量均有不同程度的升高，其中FMN中劑量組IL-2含量與sIgA含量差異極顯著(P<0.01)，IL-6含量差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫功能具有明顯的促進作用。

表2 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜IL-2、IL-6及sIgA含量的影響

2.3 FMN對免疫抑制小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)的影響

空白對照組小腸絨毛排列緊密、整齊，絨毛上皮細胞連續(xù)、完整(圖1-A)。免疫抑制模型組小鼠小腸絨毛排列明顯稀疏、雜亂，且黏膜上皮有明顯脫落(圖1-B)，表明CTX對小鼠小腸黏膜屏障產(chǎn)生了明顯的損傷。與免疫抑制模型組比較，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸絨毛不同程度的增多，絨毛間隙逐漸變窄、整齊，上皮細胞連續(xù)性程度不等恢復。其中，以FMN中劑量組表現(xiàn)最明顯(圖1-C、圖1-D、圖1-E)。

A：空白對照組；B：免疫抑制模型組；C：FMN低劑量組；D：FMN中劑量組；E：FMN高劑量組。圖3同。

由表3可知，空白對照組十二指腸、空腸及回腸絨毛高度均高于免疫抑制模型組，其中十二指腸和空腸絨毛高度與免疫抑制模型組比較，差異極顯著(P<0.01)，這也進一步表明，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)受損。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸絨毛高度均不同程度的增高，尤其FMN中劑量組最突出，其中十二指腸和空腸絨毛高度極顯著增加(P<0.01)。而各組腸道隱窩深度雖有一定變化，但不具有統(tǒng)計學意義。此外，與免疫抑制模型組比較，F(xiàn)MN各劑量組小鼠小腸各段V/C也均不同程度的增高，其中，F(xiàn)MN中劑量組小腸各段V/C增高最明顯，尤其十二指腸V/C顯著增高(P<0.05)。這一結(jié)果表明，F(xiàn)MN對免疫抑制小鼠小腸黏膜屏障和結(jié)構(gòu)的損傷有明顯的修復作用。

表3 FMN對免疫抑制小鼠小腸絨毛高度、隱窩深度及絨腺比的影響

2.4 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜上皮IELs和杯狀細胞的影響

小鼠小腸IELs彌散分布于腸黏膜上皮細胞之間，以小淋巴細胞為主，胞核大而圓、染色深，胞漿少(圖2-A、圖2-B)。小鼠小腸杯狀細胞主要分布于腸黏膜上皮細胞和腸腺細胞之間，呈高腳杯狀，PAS染色呈陽性反應(yīng)，胞核呈藍紫色，糖原及其他PAS反應(yīng)陽性物質(zhì)呈紅色(圖2-C、圖2-D)。

上面2個圖為十二指腸IELs，A：免疫抑制模型組，B：FMN中劑量組(HE，400×)；下面2個圖為十二指腸杯狀細胞，C：免疫抑制模型組；D：FMN中劑量組(HE，200×)。

由表4可知，免疫抑制模型組小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細胞的數(shù)量均低于空白對照組，IELs數(shù)量在回腸差異顯著(P<0.05)，在其他腸段差異極顯著(P<0.01)；杯狀細胞數(shù)量在十二指腸差異顯著(P<0.05)，在回腸差異極顯著(P<0.01)，這也進一步證明CTX對小鼠小腸黏膜免疫活性細胞的分化與成熟產(chǎn)生明顯的抑制作用。FMN各劑量組與免疫抑制模型組比較，小腸黏膜IELs和杯狀細胞的數(shù)量均有不同程度的增多，尤其FMN中劑量組小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細胞的數(shù)量增多最突出，其中十二指腸、空腸和回腸IELs的數(shù)量差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)；杯狀細胞數(shù)量差異極顯著(P<0.01)。這表明FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫活性細胞的分化和成熟也具有明顯的促進作用。

表4 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜IELs和杯狀細胞數(shù)量的影響

2.5 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察表明，空白對照組小鼠小腸黏膜上皮細胞呈柱狀，上皮柱狀細胞排列整齊，細胞間連接緊密，細胞界限清晰，細胞游離面有許多微絨毛排列整齊的伸向腸腔(圖3-A)；同時，上皮柱狀細胞內(nèi)線粒體等細胞器結(jié)構(gòu)完整，胞核完整核膜清晰(圖3-A)。免疫抑制模型組與空白對照組相比較，上皮柱狀細胞微絨毛明顯縮短，甚至斷裂，排列雜亂、稀疏，有的上皮柱狀細胞壞死崩解，細胞器程度不等擴張呈空泡狀，線粒體腫脹、嵴斷裂崩解，有的細胞核溶解，細胞間連接疏散(圖3-B)。與免疫抑制模型組相比，F(xiàn)MN各劑量組小腸黏膜上皮柱狀細胞微絨毛明顯增長，且逐漸排列緊密整齊，同時，變性上皮柱狀細胞明顯減少，上皮柱狀細胞內(nèi)細胞器空泡化也明顯減少，細胞間連接明顯清晰，尤其中劑量組表現(xiàn)明顯(圖3-D)。

圖3 FMN對免疫抑制小鼠小腸黏膜超微結(jié)構(gòu)的影響

3 討 論

大量研究證明，CTX不僅可以造成動物機體外周淋巴細胞數(shù)量迅速下降，引發(fā)機體免疫抑制，同時也可以導致機體腸道黏膜屏障損傷，從而導致腸道黏膜免疫抑制[7-9]。本試驗研究也證明，CTX不僅引起小鼠免疫抑制，胸腺、脾臟顯著萎縮，而且對腸道黏膜免疫屏障也造成明顯損傷和抑制；當CTX灌胃后，小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均顯著低于空白對照組，小腸絨毛高度顯著下降，微絨毛斷裂，柱狀上皮細胞變性壞死，腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量以及IELs和杯狀細胞數(shù)量也顯著低于空白對照組，再次證明CTX不僅對機體產(chǎn)生免疫抑制，而且對腸道黏膜免疫系統(tǒng)也產(chǎn)生抑制。上述結(jié)果也表明，本試驗CTX誘導的小鼠黏膜免疫抑制模型復制成功。

IL-2和IL-6屬于血細胞生成素(Ⅰ類)家族的細胞因子，IL-2可促進活化T細胞和B細胞生長、增殖和分化，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子[10]。IL-6是促使B細胞分化成漿細胞并分泌抗體的重要啟動信號[11-12]。因此，黏膜組織中IL-2和IL-6的含量可以反映其中T細胞和B細胞的表達水平。sIgA為機體黏膜免疫的主要效應(yīng)分子，具有抵抗病原入侵等多種功能[13]。崔藝燕等[14]研究表明，柑橘黃酮可以有效提高斷奶仔豬空腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量；黃其春等[15]也發(fā)現(xiàn)銀杏葉總黃酮可以顯著提高仔豬腸黏膜IL-2和sIgA含量。本試驗也表明，免疫抑制小鼠在灌胃FMN后，小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA含量不同程度的升高，其中FMN中劑量組升高最明顯，首次證明FMN可促進小腸黏膜T、B淋巴細胞的分化與成熟，促使小腸黏膜IL-2、IL-6和sIgA的分泌，顯著增強和改善免疫抑制機體小腸黏膜免疫功能。

腸絨毛高度、隱窩深度和V/C等是衡量小腸消化、吸收功能強弱的重要指標。大量研究指出，動物機體小腸絨毛高度反映出小腸黏膜與接觸營養(yǎng)物質(zhì)的面積大??；隱窩深度反映了細胞的生成率和分泌功能；而V/C則反映小腸功能的狀態(tài)[16-17]。同時，小腸黏膜的完整性、連續(xù)性以及各種免疫活性細胞的數(shù)量、分布等還反映出其黏膜屏障的功能和特性。王瑩等[18]研究證明，葡萄原花青素可改善營養(yǎng)性肥胖大鼠回腸絨毛高度、隱窩深度和V/C，從而加強小腸消化吸收功能。本研究也證明，CTX誘導的免疫抑制小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，V/C顯著降低，上皮柱狀細胞及微絨毛也嚴重損傷。而FMN具有明顯促進免疫抑制小鼠小腸黏膜屏障和結(jié)構(gòu)的修復作用。

小腸黏膜的相關(guān)免疫活性細胞是其黏膜免疫活性的重要組成，特別是IELs和杯狀細胞等[19]。IELs是機體消化道黏膜免疫系統(tǒng)中與外來抗原及微生物最先發(fā)生接觸并發(fā)生免疫反應(yīng)的細胞。已有研究表明，IELs可以對小腸道黏膜屏障損傷或感染做出快速反應(yīng)，誘導黏膜免疫應(yīng)答，保護小腸黏膜上皮，維持其腸道穩(wěn)態(tài)。杯狀細胞可分泌黏蛋白等形成腸道黏液屏障從而對腸黏膜形成保護和潤滑作用[20-21]。此外，有研究表明，杯狀細胞還具有分泌抗菌肽、趨化因子和細胞因子等免疫活性因子和抗原呈遞功能[22]。因此，小腸IELs和杯狀細胞的數(shù)量的變化可以反映出小腸膜免疫屏障的完整性以及免疫防御完善性。黃其春等[15]和李焰等[23]研究均證明銀杏葉總黃酮可以通過改善機體腸黏膜結(jié)構(gòu)，促進機體腸黏膜IELs和杯狀細胞的增殖，從而保護腸道黏膜屏障的完整性。本試驗研究也首次證明，F(xiàn)MN不僅能夠明顯改善和修復免疫抑制小鼠小腸黏膜結(jié)構(gòu)和損傷，而且明顯促進小腸黏膜IELs和杯狀細胞增殖和分化，從而大大增強和改善機體小腸消化和黏膜免疫功能。

已有研究表明，異黃酮化合物可對動物機體腸道黏膜免疫功能產(chǎn)生明顯影響。Wei等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，膳食異黃酮能夠抑制小鼠黏膜免疫應(yīng)答，而染料木黃酮和橙皮苷則能通過促進腸上皮內(nèi)淋巴細胞的增殖來增強黏膜免疫[25]。胡勝蘭等[26]研究從細胞水平證明了低濃度大豆異黃酮對氧化應(yīng)激仔豬腸上皮細胞具有保護作用，但濃度過高時則對細胞呈抑制作用。楊金玉等[27]研究也證明，作為黃酮類化合物的葡萄原花青素在一定作用劑量下，可有效調(diào)節(jié)感染球蟲的肉仔雞腸道IELs數(shù)量和sIgA含量，然而隨著其劑量的增加，調(diào)節(jié)作用反而降低。這與本試驗研究結(jié)果均一致，較低作用劑量的FMN可促進小鼠小腸黏膜免疫功能的增強；相反，較高的作用劑量則使小鼠小腸黏膜免疫功能降低或抑制，但關(guān)于FMN適宜劑量范圍還需要進一步研究證明。因此，本研究認為黃酮類化合物可能對機體腸黏膜免疫功能具有雙向調(diào)節(jié)作用，但具體作用機理有待進一步研究。

4 結(jié) 論

綜上所述，一定劑量的FMN可顯著改善和促進免疫抑制小鼠小腸黏膜免疫功能的恢復和增強；同時，還可減少小腸黏膜的損傷，恢復和促進小腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定，尤其以FMN中劑量組(150 mg/kg)最為明顯。