謝娜娜 閆書(shū)平 張崇昊 曹西月 張?jiān)词?/p>

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生理生化重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，南京 210095)

植物雌激素是植物中發(fā)現(xiàn)的類(lèi)似雌激素的非類(lèi)固醇物質(zhì)，可以有效預(yù)防癌癥、動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松癥、更年期癥狀和肥胖等多種疾病[1]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)包括木脂類(lèi)、異黃酮類(lèi)[染料木素、大豆黃酮(daidzein,DZ)]和丙烯基黃酮類(lèi)化合物等20多種植物雌激素類(lèi)，其作用涉及了許多方面，是目前開(kāi)發(fā)研究較多的一大類(lèi)物質(zhì)[2]。DZ是具有酚類(lèi)結(jié)構(gòu)的異黃酮類(lèi)植物雌激素。DZ與雌二醇(estradiol,E2)結(jié)構(gòu)類(lèi)似，具有雌激素樣活性，所不同的是，與E2相比，其生物學(xué)效應(yīng)較弱，僅為E2的10-5～10-3[3]；另外，DZ的作用具有雙向效應(yīng)，既能發(fā)揮雌激素樣作用，也可發(fā)揮抗雌激素的作用，而這主要取決于DZ的生理劑量和化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]。李艷等[5]添加不同濃度的DZ作用于山羊乳腺細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10～100 ng/mL的DZ可顯著促進(jìn)山羊乳腺上皮增殖，但1 000 ng/mL DZ會(huì)使細(xì)胞增殖能力有所下降；Yu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，DZ對(duì)牛乳腺細(xì)胞具有同樣的效應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)高濃度DZ(20～80 μmol/L)還可抑制乳脂和乳蛋白的合成。由此可見(jiàn)，DZ可促進(jìn)乳腺細(xì)胞增殖，但有劑量依賴(lài)性。

乳腺是由乳腺上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞構(gòu)成的動(dòng)態(tài)器官，是哺乳動(dòng)物區(qū)別其他動(dòng)物的標(biāo)志。哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育受到雌激素的調(diào)節(jié)作用[7]。雌激素是多種靶組織生長(zhǎng)和分化的重要調(diào)節(jié)因子，主要包括E2、雌酮和雌三醇等，其中E2是哺乳動(dòng)物自身合成的雌激素中活性最高的。有研究發(fā)現(xiàn)，E2可通過(guò)其雌激素受體(estrogen receptor,ER)調(diào)控乳腺發(fā)育、泌乳及促進(jìn)生殖器官發(fā)育等[8]。人醫(yī)方面的研究發(fā)現(xiàn)，隨著青春期卵巢E2的分泌，可出現(xiàn)乳腺導(dǎo)管的快速延伸和分支，認(rèn)為是因?yàn)镋2增加了青春期乳腺組織的ER含量，從而促進(jìn)了乳腺的發(fā)育[9]。另有研究發(fā)現(xiàn)，E2也可通過(guò)ER促進(jìn)小鼠乳腺導(dǎo)管末端芽、導(dǎo)管分支和腺泡的形成，從而促進(jìn)泌乳[10]。這提示E2依賴(lài)ER影響乳腺發(fā)育。

已有研究證實(shí)，植物雌激素DZ與乳腺發(fā)育有關(guān)。1946年，Bennetts等[11]首次發(fā)現(xiàn)給奶牛飼喂三葉草可促進(jìn)乳腺發(fā)育，提高奶產(chǎn)量，提示異黃酮植物雌激素可促進(jìn)乳腺發(fā)育。隨后在動(dòng)物試驗(yàn)中證實(shí)，飼喂一定劑量的DZ可促進(jìn)泌乳，增加奶產(chǎn)量。2008年，劉春龍等[12]首次證實(shí)了DZ可通過(guò)提高細(xì)胞活力促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞增殖。最近，Tsugami等[13]研究發(fā)現(xiàn)，DZ對(duì)體外小鼠乳腺細(xì)胞誘導(dǎo)成導(dǎo)管、腺泡形成也有一定的促進(jìn)作用。以上研究提示，植物雌激素DZ可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)導(dǎo)管、分泌小泡等結(jié)構(gòu)的形成，可能與乳腺發(fā)育和泌乳有關(guān)，但其作用途徑及機(jī)制尚沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。因此，本文采用DZ處理牛乳腺上皮MAC-T細(xì)胞，并以E2處理作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)指標(biāo)、細(xì)胞周期的變化及ERβ表達(dá)量等指標(biāo)，研究DZ對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖的影響，并探討其相關(guān)機(jī)制，為DZ及其他植物雌激素類(lèi)物質(zhì)在泌乳動(dòng)物生產(chǎn)中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞

牛乳腺上皮細(xì)胞系(MAC-T)：美國(guó)伊利諾伊大學(xué)Loor教授饋贈(zèng)，由本實(shí)驗(yàn)室凍存。

1.2 主要試劑及儀器

DZ由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)韓正康教授贈(zèng)送；二甲基噻唑二苯基四唑嗅鹽(MTT，5 mg/mL)、二甲基亞砜(DMSO)和DNA含量測(cè)定試劑盒均購(gòu)自Solarbio公司；E2(純度≥99%)購(gòu)自Alfa Aesar公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清等購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)一抗(貨號(hào)：10205-2)購(gòu)自Proteintech公司；細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)一抗(貨號(hào)：BS1741)購(gòu)自Bioworld公司；細(xì)胞周期蛋白D3(CyclinD3)(貨號(hào)：DF6229)和ERβ(貨號(hào)：AF4649)一抗均購(gòu)自Affinity公司；兔源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗(貨號(hào)：AC026)、羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(貨號(hào)：AS003)和羊抗兔IgG(貨號(hào)：AS014)二抗均購(gòu)自ABclonal公司。

主要儀器：BioPhotometer-D30核酸蛋白測(cè)定儀(德國(guó))、TECAN多功能酶標(biāo)儀(瑞士)、電泳/電轉(zhuǎn)儀(美國(guó))、發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(美國(guó))、貝克曼-Cytoflex流式細(xì)胞儀和Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

參照Yu等[6]的方法，按照常規(guī)法培養(yǎng)。將MAC-T細(xì)胞解凍，置于含10%胎牛血清的DMED高糖完全培養(yǎng)液中，5%CO2、37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。所有細(xì)胞處理前均用未加胎牛血清的DMED高糖培養(yǎng)液(不完全培養(yǎng)液)饑餓4 h。

1.3.2 DZ作用條件的確定

1)DZ濃度確定：采用MTT法[14]進(jìn)行。取長(zhǎng)至90%左右的細(xì)胞正常消化，制成細(xì)胞懸液，均勻鋪至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，分別加入終濃度為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0和160.0 μmol/L的DZ處理細(xì)胞24 h。每孔加入10 μL MTT試劑并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，低速振蕩充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔490 nm的吸光度(OD)值，按如下公式計(jì)算細(xì)胞活力：

細(xì)胞活力(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100。

式中：As表示試驗(yàn)孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基、MTT和待測(cè)化合物的孔的吸光度)；Ab表示空白孔吸光度(含有培養(yǎng)基和MTT的孔的吸光度)；Ac表示對(duì)照孔吸光度(含有細(xì)胞、培養(yǎng)基和MTT的孔的吸光度)。

本試驗(yàn)篩選2.5、5.0和10.0 μmol/L DZ濃度分別作為低、中和高濃度用于后續(xù)試驗(yàn)。

2)DZ作用時(shí)間的確定：細(xì)胞同上處理，96孔板上分別加入DZ，使終濃度為2.5、5.0和10 μmol/L，分別處理12、24、36和48 h后，采用MTT法測(cè)定各孔490 nm的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力。結(jié)果顯示：DZ作用時(shí)間為12 h時(shí)，能顯著提高M(jìn)AC-T細(xì)胞活力。

根據(jù)以上結(jié)果，本試驗(yàn)確定的處理?xiàng)l件是：DZ低、中和高濃度分別為2.5、5.0和10.0 μmol/L，處理時(shí)間為12 h。

1.3.3 試驗(yàn)分組和細(xì)胞處理

根據(jù)以上試驗(yàn)所確定的濃度和最佳作用時(shí)間，試驗(yàn)共分為3組。1)對(duì)照組(CON)，等體積不完全培養(yǎng)液。2)試驗(yàn)組，分3個(gè)處理：低濃度處理(LDZ)，等體積不完全培養(yǎng)液+2.5 μmol/L DZ；中濃度處理(MDZ)，等體積不完全培養(yǎng)液+5.0 μmol/L DZ；高濃度處理(HDZ)，等體積不完全培養(yǎng)液+10.0 μmol/L DZ。3)陽(yáng)性對(duì)照組(E2)：等體積不完全培養(yǎng)液+5×10-4μmol/L E2。

細(xì)胞正常消化制成懸液，均勻接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右，按如上分組處理，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.4.1 細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)

6孔板細(xì)胞處理12 h后終止培養(yǎng)，胰酶消化，加入完全培養(yǎng)液獲得細(xì)胞懸液，并使其終體積為1 mL。取每孔細(xì)胞懸液各10 μL滴在Countess?細(xì)胞計(jì)數(shù)腔室載玻片上，立即用Countess自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞數(shù)量。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.4.2 細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Western blot檢測(cè)

參照Li等[15]的方法檢測(cè)各處理細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白CyclinD3、CyclinD1、PCNA和ERβ的表達(dá)變化，具體如下。

1)樣品制備：將6孔板中處理好的細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，用冰浴的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去多余的培養(yǎng)液。加入蛋白裂解液，并用細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞。4 ℃、2 580×g，10 min，收集細(xì)胞上清，采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，統(tǒng)一濃度為2.68 μg/μL，加入蛋白上樣緩沖液，使終濃度為1 mg/mL，100 ℃煮沸10 min，備用。

2)十二烷基硫酸-鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)：選用10%分離膠、5%濃縮膠，先使用90 V恒壓，待目的條帶到達(dá)濃縮膠與分離膠界面時(shí)，改用110 V恒壓，待溴酚藍(lán)條帶到達(dá)指示前沿停止電泳。

3)轉(zhuǎn)?。喝∧康牡鞍讌^(qū)域進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)印。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜先用甲醛激活約30 s，將凝膠、PVDF膜和轉(zhuǎn)印濾紙依次擺放至轉(zhuǎn)印夾中，配制轉(zhuǎn)膜電泳液并提前冰浴，恒壓100 V，轉(zhuǎn)印90 min。

4)抗體孵育及顯色：完成轉(zhuǎn)印后，取出PVDF膜在5%的脫脂奶粉中封閉2 h，TBST洗滌，一抗用TBST稀釋?zhuān)珻yclinD3、CyclinD1、ERβ一抗均按照1∶1 000稀釋?zhuān)琍CNA抗體為1∶2 000稀釋。4 ℃搖床過(guò)夜孵育一抗。次日用TBST漂洗，CyclinD1加入稀釋比例為1∶10 000的山羊抗鼠IgG二抗，其余3種抗體加入1∶10 000稀釋的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，TBST漂洗，用ECL化學(xué)發(fā)光液處理，并在凝膠成像系統(tǒng)中曝光拍照。采用Image J軟件檢測(cè)各蛋白條帶灰度值，以β-肌動(dòng)蛋白作內(nèi)參，目的條帶與其相比得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，然后對(duì)數(shù)值進(jìn)行歸一化處理。

1.3.4.3 細(xì)胞中DNA含量(細(xì)胞周期)的檢測(cè)

參照Guo等[16]的方法，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各處理細(xì)胞中DNA含量的變化，具體如下。

1)細(xì)胞收集：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)到90%的MAC-T細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，改為含有2.5、5.0和10.0 μmol/L DZ及5×10-4μmol/L E2的培養(yǎng)液(不含血清)繼續(xù)培養(yǎng)。12 h后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗，胰酶消化，離心，收集細(xì)胞。

2)細(xì)胞處理及上機(jī)檢測(cè)：將離心收集的細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，先用70%預(yù)冷乙醇4 ℃固定過(guò)夜；然后加入100 μL RNase A溶液重懸細(xì)胞，37 ℃水浴30 min。加入碘化丙啶(PI)工作液避光孵育30 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm下，用流式細(xì)胞儀中的PE-A熒光通道檢測(cè)細(xì)胞各周期分布情況。用Modfit 5.0軟件分析細(xì)胞中G0/G1期、S期、G2期分布情況。以G2-M期細(xì)胞所占百分比表示細(xì)胞增殖情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one way ANOVA)和LSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，采用Graphpad Prism 8.0.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DZ最佳作用條件的篩選結(jié)果

2.1.1 DZ濃度的確定

由圖1可知，與對(duì)照組相比，終濃度為2.5和5.0 μmol/L DZ處理細(xì)胞均能提高M(jìn)AC-T細(xì)胞活力，其中5.0 μmol/L DZ處理顯著提高細(xì)胞活力(P<0.05)；而在終濃度高于10.0 μmol/L后，細(xì)胞活力均有下降，在10.0～40.0 μmol/L，細(xì)胞活力均低于對(duì)照組。故本試驗(yàn)選取終濃度為2.5、5.0和10.0 μmol/L作為DZ低、中和高處理濃度。

與對(duì)照組相比，數(shù)據(jù)柱標(biāo)記**表示差異極顯著(P<0.01)，標(biāo)記*表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.1.2 DZ作用時(shí)間的確定

以確定的DZ低、中和高3個(gè)濃度分別處理細(xì)胞12、24、36和48 h確定最適作用時(shí)間。由圖2可知，與對(duì)照組相比，處理12 h后，5.0 μmol/L DZ處理使得細(xì)胞活力顯著提高(P<0.05)，其他2個(gè)濃度處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)；處理24 h后，2.5和5.0 μmol/L DZ處理使得細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；而處理36 h后，除2.5 μmol/L DZ處理對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響(P>0.05)外，其他濃度處理顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)；處理48 h后，3個(gè)濃度的DZ處理均極顯著降低細(xì)胞活力(P<0.01)。故本試驗(yàn)確定DZ的處理時(shí)間為12 h。

圖2 不同濃度DZ作用不同時(shí)間對(duì)MAC-T細(xì)胞活力的影響

2.2 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞數(shù)量的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，5.0 μmol/L DZ處理使得細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P<0.05)，約為對(duì)照組的1.20倍；2.5 μmol/L DZ處理使得細(xì)胞數(shù)量有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；陽(yáng)性對(duì)照組(E2處理)細(xì)胞數(shù)量略低于各DZ處理，但差異不顯著(P>0.05)。

CON：對(duì)照組 control group；LDZ：試驗(yàn)組低濃度處理 low concentration treatment in experimental group；MDZ：試驗(yàn)組中濃度處理 medium concentration treatment in experimental group；HDZ：試驗(yàn)組高濃度處理 high concentration treatment in experimental group；E2：陽(yáng)性對(duì)照組 positive control group。下圖同 the same as below。

2.3 DZ處理對(duì)細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3.1 DZ處理對(duì)PCNA、CyclinD1及CyclinD3蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖4-b可知，與對(duì)照組相比，3種濃度的DZ處理均可上調(diào)PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量，其中，中濃度DZ處理差異顯著(P<0.05)；E2處理下調(diào)了PCNA蛋白相對(duì)表達(dá)量，但差異不顯著(P>0.05)。

由圖4-c可知，與對(duì)照組相比，3種濃度的DZ處理均可上調(diào)CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量，其中，中濃度DZ處理差異顯著(P<0.05)；E2處理對(duì)CyclinD1蛋白相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)，結(jié)果與PCNA有同樣趨勢(shì)。

由圖4-d可知，與對(duì)照組相比，3種濃度的DZ處理均可上調(diào)CyclinD3蛋白相對(duì)表達(dá)量，但均無(wú)顯著差異(P>0.05)；E2處理與DZ處理一樣，也能上調(diào)CyclinD3蛋白相對(duì)表達(dá)量，但也無(wú)顯著差異(P>0.05)。

CyclinD3：細(xì)胞周期蛋白D3；CyclinD1：細(xì)胞周期蛋白D1；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

2.3.2 DZ處理對(duì)ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，3種濃度的DZ處理和E2處理均可上調(diào)ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量，其中，中濃度DZ處理差異顯著(P<0.05)，這提示DZ可能通過(guò)ERβ發(fā)揮作用。

圖5 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞中ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 DZ處理對(duì)細(xì)胞周期分布的影響

本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)判定細(xì)胞周期分布情況，比較流式細(xì)胞圖中細(xì)胞周期G0/G1期、S期、G2-M期細(xì)胞比例，主要通過(guò)G2-M期細(xì)胞所占比例揭示細(xì)胞的增殖與否，并結(jié)合S期細(xì)胞占比分析細(xì)胞周期變化。

由圖6可知，與對(duì)照組相比，低濃度DZ處理略提高了G2-M期細(xì)胞占比(P>0.05)；中濃度DZ處理極顯著提高了G2-M期細(xì)胞占比(P<0.01)，同時(shí)極顯著提高了S期細(xì)胞占比(P<0.01)；高濃度DZ處理降低了G2-M期細(xì)胞占比(P>0.05)，略有提高S期細(xì)胞占比的趨勢(shì)(P>0.05)；E2處理與中濃度DZ處理具有同樣趨勢(shì)，均極顯著提高了G2-M期細(xì)胞占比(P<0.01)，同時(shí)提高了S期細(xì)胞占比，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05)。

圖6 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞中G2-M期細(xì)胞占比的影響

3 討 論

3.1 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖的影響

已經(jīng)知道，E2在哺乳動(dòng)物乳腺發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。陳靜等[17]研究了添加不同濃度的E2對(duì)MAC-T細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度(0.5、1.0和5.0 nmol/L)E2能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，長(zhǎng)期處于高濃度(100 nmol/L)E2環(huán)境下，乳腺細(xì)胞增殖則被抑制并引發(fā)細(xì)胞損傷，提示E2對(duì)細(xì)胞增殖作用具有一定的濃度依賴(lài)性。曹艷紅等[18]研究發(fā)現(xiàn)，E2對(duì)于奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖具有同樣的效應(yīng)，僅在一定濃度(25 μmol/L)下可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活動(dòng)，且對(duì)細(xì)胞的損傷較小。武開(kāi)樂(lè)等[19]將不同濃度的E2(0、50、100和200 μmol/L)孵育MAC-T細(xì)胞不同時(shí)間，僅在12 h時(shí)乳腺上皮細(xì)胞的增殖效果最好。劉春龍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，DZ在100～1 000 ng/mL(3.9 μmol/L)時(shí)對(duì)牛乳腺上皮細(xì)胞具有增殖作用。本研究發(fā)現(xiàn)，5.0和10.0 μmol/L DZ處理MAC-T細(xì)胞12 h能使細(xì)胞活力提高，2.5和5.0 μmol/L DZ處理MAC-T細(xì)胞12 h能使細(xì)胞數(shù)量增加，其中，5.0 μmol/L DZ處理差異顯著；本試驗(yàn)結(jié)果與劉春龍等[12]的研究結(jié)果基本一致，即DZ也具有類(lèi)似E2的作用，能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖。

3.2 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期、細(xì)胞的增殖和分化是由細(xì)胞周期蛋白和周期蛋白所依賴(lài)的激酶所驅(qū)動(dòng)。細(xì)胞周期蛋白作為有絲分裂傳感器，能夠整合細(xì)胞外有絲分裂信號(hào)和細(xì)胞周期進(jìn)程，阻滯G1期的進(jìn)展，促進(jìn)G1到S轉(zhuǎn)變，從而啟動(dòng)DNA復(fù)制。其中，D型細(xì)胞周期蛋白可在正常細(xì)胞中表達(dá)和激活，并嚴(yán)格調(diào)控細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程[20]，主要包括CyclinD1、CyclinD3、細(xì)胞周期蛋白D4(CyclinD4)，其中CyclinD1和CyclinD3是在細(xì)胞周期進(jìn)程表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的2種蛋白[15]。研究發(fā)現(xiàn)，E2可通過(guò)影響CyclinD1的表達(dá)調(diào)控細(xì)胞周期，從而調(diào)控正常細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖；在轉(zhuǎn)基因雌激素敏感小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，E2可促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)，提示E2可能與細(xì)胞周期有關(guān)[21]。還有研究發(fā)現(xiàn)，E2在0.001、0.010、0.100、1.000和10.000 μmol/L時(shí)均可促進(jìn)人乳腺細(xì)胞系的增殖，S期細(xì)胞比例減少，G2-M期細(xì)胞比例增多[22]。Guo等[16]發(fā)現(xiàn)異黃酮類(lèi)植物雌激素可通過(guò)影響細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)蛋白信號(hào)通路影響乳腺發(fā)育。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DZ處理可以提高G2-M期細(xì)胞占比，觸發(fā)MAC-T細(xì)胞中S期細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)上調(diào)CyclinD1和CyclinD3蛋白相對(duì)表達(dá)量，這與以往研究結(jié)論相符，即DZ與E2具有同樣的作用，DZ可促進(jìn)MAC-T細(xì)胞的增殖。

3.3 DZ處理對(duì)MAC-T細(xì)胞ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

ER是E2發(fā)揮多向效應(yīng)的媒介，有ERα和Erβ 2種亞型。ERα和ERβ同為類(lèi)固醇受體超級(jí)家族的成員，分別由不同基因編碼，分布也存在差異性[23]。在乳腺組織中，ERα主要分布在導(dǎo)管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，小葉上皮細(xì)胞不表達(dá)；ERβ主要分布在導(dǎo)管上皮細(xì)胞、小葉上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，在脂肪間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)也可檢測(cè)到ERβ表達(dá)。正常的乳腺組織主要表達(dá)ERβ，但在大多數(shù)乳腺癌組織中ERβ的表達(dá)水平顯著降低，而ERα卻高表達(dá)[24]。Zhou等[25]研究表明，在子宮內(nèi)膜癌發(fā)展中，雌激素通過(guò)ERβ促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(UCEC)增殖，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)展，當(dāng)使用雌激素抑制劑后減弱了ERβ對(duì)UCEC的增殖作用；劉麗軍[22]等研究表明，E2具有促進(jìn)人乳腺細(xì)胞增殖的作用，免疫組化檢測(cè)到ERβ的表達(dá)。本研究結(jié)果表明，DZ處理可提高M(jìn)AC-T細(xì)胞ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量，這與前人研究結(jié)果一致，初步推斷DZ可能是通過(guò)ERβ介導(dǎo)促進(jìn)了MAC-T細(xì)胞增殖。

4 結(jié) 論

本研究表明，植物雌激素DZ可通過(guò)上調(diào)MAC-T細(xì)胞中ERβ蛋白表達(dá)，提高G2-M期細(xì)胞占比，并將細(xì)胞周期阻滯在S期，從而促進(jìn)乳腺細(xì)胞的增殖，發(fā)揮著類(lèi)似雌激素樣的作用。