侯若鑫 龍 靜 彭 燦 何流琴* 李鐵軍* 湯文杰 鄺聲耀 印遇龍

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，北京 100049；3.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，動物腸道功能調(diào)控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；5.四川省畜牧科學(xué)研究院，動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽生物制品四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川省畜科飼料有限公司，成都 610066)

腸道是動物機(jī)體內(nèi)消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，也是最大的免疫器官，是阻止病原微生物感染的第1道屏障，具有重要的防御功能。進(jìn)入腸道中的營養(yǎng)物質(zhì)首先與腸道黏膜直接接觸，腸道黏膜屏障主要由健康完整的腸道上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成，故腸道上皮細(xì)胞是維持腸道屏障功能和免疫調(diào)節(jié)功能的主要執(zhí)行者[1]。研究表明，腸道屏障功能紊亂會造成腸道上皮細(xì)胞通透性的增加，導(dǎo)致有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞后促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)和分泌，加速動物機(jī)體的炎癥反應(yīng)[2-3]。因此，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白表達(dá)和細(xì)胞因子含量對維持腸道屏障功能具有十分重要的意義[3]。

鋅是哺乳動物必需的微量元素之一，是機(jī)體多種酶的重要組成成分和激活因子，參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和代謝增殖，在細(xì)胞生長、免疫功能和營養(yǎng)代謝等生理或病理過程中起著關(guān)鍵作用。鋅還是豬飼糧中使用的一種促生長添加劑，能調(diào)節(jié)腸道菌群和減少組胺釋放，有效緩解仔豬斷奶應(yīng)激[4-7]。研究表明，飼糧中添加鋅可以降低斷奶后仔豬腹瀉的發(fā)生率，改善腸道屏障的結(jié)構(gòu)和功能[8]。動物缺鋅則會損害消化、免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌和皮膚系統(tǒng)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、氧化應(yīng)激、腸道功能障礙和炎癥細(xì)胞浸潤等[9-10]。此外，飼糧中添加有機(jī)鋅對動物生長性能的作用效果要優(yōu)于無機(jī)鋅。俞成浩等[11]研究發(fā)現(xiàn)，同等劑量的乳酸鋅對肉兔生長性能的提高效果要好于硫酸鋅。王榮蛟等[12]研究表明，飼糧中添加乳酸鋅可極顯著提高仔豬小腸絨毛高度，降低隱窩深度，改善養(yǎng)分消化利用率，提高仔豬的生長性能。王彬等[13]研究表明，飼糧中添加納米氧化鋅和普通氧化鋅能顯著提高生長育肥豬血清中免疫球蛋白A(IgA)含量，顯著提高血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，提高生長性能，降低腹瀉率。目前關(guān)于乳酸鋅和硫酸鋅對動物腸道健康的作用更多是體現(xiàn)在一些表觀指標(biāo)上，作用機(jī)制與效果的對比研究甚少。因此，本研究以仔豬空腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2細(xì)胞為模型，探討乳酸鋅和硫酸鋅對豬小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白、炎癥細(xì)胞因子及鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體的影響，旨在了解兩者在調(diào)節(jié)仔豬小腸細(xì)胞屏障和炎癥反應(yīng)方面可能發(fā)揮的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

IPEC-J2細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料工業(yè)中心惠贈。

1.2 試驗(yàn)材料

乳酸鋅(鋅含量21.5%)、硫酸鋅(鋅含量21.5%)由四川省某飼料有限公司提供；硫酸鋅配制時用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM溶解，0.22 μm除菌過濾器過濾除菌，現(xiàn)用現(xiàn)配。細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F-12(1∶1)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(2.5 g/L)以及青(鏈)霉素均購自Gibco公司，總RNA提取反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量試劑盒均購于北京TaKaRa公司，細(xì)胞活力試劑盒與炎癥因子酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3 IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)

將復(fù)蘇的IPEC-J2細(xì)胞接種于含有1%雙抗和10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基，放入37 ℃、5%的二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時消化傳代，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞活力檢測

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(8肽膽囊收縮素，CCK-8)檢測細(xì)胞活力(Dojindo，日本)。IPEC-J2細(xì)胞以8×103個/孔的密度接種于96孔板中，生長至融合度為80%；然后分別用含0(對照)、1.0、5.0、7.5、10.0和20.0 mg/mL乳酸鋅或硫酸鋅(以鋅計(jì))的DMEM處理細(xì)胞，處理時間選擇36 h[14]，每個濃度水平設(shè)置8孔重復(fù)。處理完成后，將10 mol/L CCK-8溶液加入96孔板培養(yǎng)的細(xì)胞中，37 ℃孵育30 min，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD)值，并計(jì)算細(xì)胞活力。計(jì)算公式如下：

細(xì)胞活力=100×[A(加藥)-A(空白)]/

[A(0加藥)-A(空白)]。

式中：A(加藥)表示具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值；A(空白)表示具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的OD值；A(0加藥)表示具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值。

1.5 IPEC-J2細(xì)胞處理

試驗(yàn)共分為3組：對照組、乳酸鋅組和硫酸鋅組，每組3個重復(fù)。將消化后的IPEC-J2細(xì)胞以均等的濃度接種至6孔板中，共接種6板，待細(xì)胞生長至約80%時，棄培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，更換為篩選出的7.5 mg/mL乳酸鋅和硫酸鋅培養(yǎng)基處理36 h。每孔加入2 mL處理液，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液及細(xì)胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞因子含量測定

收集培養(yǎng)基于離心管，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清待測。根據(jù)IL-6、TNF-α、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、富含半胱氨酸腸蛋白1(CRIP1)、富含半胱氨酸腸蛋白2(CRIP2)試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)操作步驟，將標(biāo)準(zhǔn)品工作液和待測樣品加入酶標(biāo)板中，每孔100 μL，于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min。棄去液體，每孔加入100 μL的生物素化抗體工作液，覆膜，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育60 min。洗板3次。每孔中加入酶結(jié)合工作液100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，重復(fù)洗板3次。每孔加入底物溶液90 μL，覆膜置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育15 min。最后向每孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)后30 min之內(nèi)用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測量各孔的OD值。計(jì)算炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α含量。

1.7 mRNA相對表達(dá)量測定

采用實(shí)時熒光定量PCR法測定IPEC-J2細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-1β、鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-1(ZNT-1)、CRIP1、CRIP2、封閉蛋白-1(claudin-1)和閉合蛋白(occludin)的mRNA相對表達(dá)量。根據(jù)GenBank提供的豬基因序列，用Primer Express 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列見表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 引物序列

按照Trizol試劑盒(TaKaRa公司，日本)使用說明提取總RNA。RNA質(zhì)量和濃度使用超微量核酸分析儀(Biodrop公司，英國)進(jìn)行檢測，其純度以O(shè)D260 nm/OD280 nm值介于1.8～2.0為使用標(biāo)準(zhǔn)。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，日本)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板使用熒光定量PCR(CFX96，Bio-Rad公司，英國)進(jìn)行基因擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s變性；58 ℃ 30 s延伸；40個循環(huán)。各基因的mRNA相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測

當(dāng)IPEC-J2細(xì)胞融合處理完成后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，冰上裂解10 min，收集細(xì)胞于1.5 mL的EP管中，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清置于新的EP管中備用；根據(jù)樣品數(shù)量，按50體積二喹啉甲酸(BCA)試劑A加1體積BCA試劑B(50∶1)配制適量BCA工作液，充分混勻；完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為2 mg/mL，將標(biāo)準(zhǔn)品分別按0(對照)、1、2、4、8、12、16和20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20 μL。加25 μL樣品到96孔板的樣品孔中；各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置30 min；測定550 nm波長的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。采用BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)測定550 nm波長的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的蛋白濃度。取60 μL蛋白上清，加入15 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。制膠電泳后轉(zhuǎn)膜封閉，一抗二抗依次孵育(表2)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色曝光，掃描膠片，用凝膠成像處理系統(tǒng)分析claudin-1和E-鈣黏蛋白(E-cadherin)條帶灰度值。

表2 抗體孵育比例

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 2019軟件進(jìn)行整理和分析，然后使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA，LSD)，單因素方差分析顯著時，采用Duncan氏法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果數(shù)據(jù)以平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error，SE)表示，以P>0.05為差異不顯著，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞活力的影響

由圖1可知，與對照組相比，5.0和7.5 mg/mL乳酸鋅組細(xì)胞活力均顯著升高(P<0.05)，且7.5 mg/mL乳酸鋅組細(xì)胞活力較對照組提高近50%；1.0、7.5和10.0 mg/mL硫酸鋅組細(xì)胞活力均顯著升高(P<0.05)；當(dāng)濃度為7.5 mg/mL時，乳酸鋅組和硫酸鋅組細(xì)胞活力均顯著高于對照組(P<0.05)。綜合考慮，選擇7.5 mg/mL乳酸鋅或硫酸鋅處理36 h進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

同一折線數(shù)據(jù)點(diǎn)標(biāo)注相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)；*表示同一濃度不同鋅源差異顯著(P<0.05)。

2.2 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞炎性因子分泌和表達(dá)的影響

由表3可知，與對照組相比，乳酸鋅組細(xì)胞內(nèi)促炎癥因子IL-1β和IL-6含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了21.72%和50.37%，而細(xì)胞內(nèi)TNF-α含量無顯著影響(P>0.05)；硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，分別下降了40.62%、38.23%和31.30%。

表3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞炎性因子含量的影響

由表4可知，與對照組相比，乳酸鋅組和硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量均有所降低，其中，乳酸鋅組細(xì)胞內(nèi)TNF-α的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)IL-6和TNF-α的mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

表4 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞炎性因子mRNA相對表達(dá)量的影響

2.3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體的影響

由表5可知，與對照組相比，乳酸鋅組和硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體CRIP1和CRIP2的含量均有所提高，其中硫酸鋅組顯著提高(P<0.05)。

表5 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體含量的影響

由表6可知，與對照組相比，乳酸鋅組細(xì)胞內(nèi)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體ZNT-1、CRIP1和CRIP2的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)僅ZNT-1和CRIP2的mRNA相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，且效果都略低于乳酸鋅組。

表6 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體mRNA相對表達(dá)量的影響

2.4 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞緊密連接蛋白的影響

由圖2-A可知，與對照組相比，乳酸鋅組細(xì)胞內(nèi)claudin-1 mRNA相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，乳酸鋅組和硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)occludin mRNA相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。由圖2-B和圖2-C可知，與對照組相比，乳酸鋅組細(xì)胞內(nèi)緊密連接蛋白claudin-1的蛋白相對表達(dá)量顯著提高(P<0.05)，硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)claudin-1的蛋白相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)；乳酸鋅組和硫酸鋅組細(xì)胞內(nèi)E-cadherin的蛋白相對表達(dá)量均無顯著差異(P>0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

3.1 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞活力和物理屏障功能的影響

本研究結(jié)果表明，IPEC-J2細(xì)胞中添加1.0～10.0 mg/mL的乳酸鋅或硫酸鋅，均能不同程度地提高細(xì)胞活力，但當(dāng)濃度超過10 mg/mL時則會嚴(yán)重影響IPEC-J2細(xì)胞活力，這可能是因?yàn)檫^量鋅與其他元素如硒、鐵、鈣和銅產(chǎn)生拮抗性，抑制細(xì)胞的增殖并過度影響細(xì)胞的通透性，從而破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)[15]。而當(dāng)濃度為7.5 mg/mL時，細(xì)胞活力的提升均達(dá)到最高，這可能是因?yàn)榇藭r的鋅吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和利用的效率最高，并協(xié)同其他元素共同促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化。

緊密連接位于上皮和內(nèi)皮側(cè)膜的最頂端，能夠調(diào)節(jié)水和溶質(zhì)的平衡。claudin-l被鑒定為定位于腸道上皮細(xì)胞上緊密連接的完整膜蛋白，可通過減少細(xì)胞旁流量來影響細(xì)胞屏障功能[16]。E-cadherin是一種在上皮細(xì)胞中表達(dá)的黏附蛋白，不僅會對組織內(nèi)部細(xì)胞黏附狀態(tài)造成影響，還能維持上皮細(xì)胞正常的組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)[16]。當(dāng)緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能被破壞的時候，腸道通透性會有所增加，腸道屏障功能受損[17]。鋅對腸道屏障功能目前已經(jīng)有許多發(fā)現(xiàn)，萬妍等[18]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加2 000～3 000 mg/kg氧化鋅可以上調(diào)細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-1和occludin的表達(dá)來維持腸道通透性和完整性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加乳酸鋅可顯著上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-1的表達(dá)，維護(hù)腸道黏膜結(jié)構(gòu)，從而改善小腸上皮細(xì)胞的屏障功能；而乳酸鋅下調(diào)claudin-1 mRNA的表達(dá)可能是因?yàn)閙RNA降解和蛋白量增加負(fù)反饋調(diào)節(jié)mRNA表達(dá)。同時，本研究中添加硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞claudin-1的表達(dá)無顯著影響，這可能是由于無機(jī)鋅在消化過程中釋放出的金屬離子易與其他物質(zhì)(如植酸、草酸和磷酸根離子)結(jié)合成不溶性鹽排除體外，從而降低了硫酸鋅的生物利用率。有研究表明，鋅缺乏會導(dǎo)致人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2的occludin和E-cadherin含量大幅度降低[19]；而Davin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，硫酸鋅能上調(diào)Caco-2細(xì)胞的蛋白激酶C信號分子，提高occludin和E-cadherin的表達(dá)。本研究結(jié)果與上述結(jié)果都不一致，表明添加乳酸鋅和硫酸鋅對occludin mRNA和E-cadherin的表達(dá)均無顯著影響，這可能是因?yàn)樵贗PEC-J2細(xì)胞中鋅對物理屏障功能的影響不涉及此蛋白的變化，而是在其他細(xì)胞中發(fā)揮作用。

3.2 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞免疫屏障的影響

體內(nèi)鋅缺乏會導(dǎo)致腸黏膜免疫屏障受損并伴隨炎癥細(xì)胞的浸潤，過度表達(dá)的促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α?xí)p害腸道的完整性和上皮細(xì)胞的功能[9-10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加乳酸鋅和硫酸鋅均可顯著降低IPEC-J2細(xì)胞中IL-1β和IL-6含量，這一結(jié)果與刁慧等[8]研究發(fā)現(xiàn)飼糧中補(bǔ)充鋅可以降低促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和白細(xì)胞介素-8(IL-8)含量的結(jié)果相一致。馬茂濤[21]研究表明，牡蠣多糖鋅配合物能顯著提高斷奶仔豬空腸黏膜抗炎性因子白細(xì)胞介素-2含量，顯著降低空腸黏膜TNF-α含量。Zhao等[22]研究表明，金針菇鋅多糖對脂多糖誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞促炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)有強(qiáng)烈的抑制作用，提示有機(jī)鋅可抑制促炎癥因子的表達(dá)。本試驗(yàn)中，添加乳酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)抑制作用較硫酸鋅更加明顯，這不僅說明鋅可能會介導(dǎo)炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，緩解腸道炎癥反應(yīng)和提高腸道免疫屏障功能，還說明乳酸鋅和硫酸鋅可能在促炎癥因子轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上發(fā)揮的作用并不一致，且乳酸鋅的作用效果可能更佳。

3.3 乳酸鋅和硫酸鋅對IPEC-J2細(xì)胞鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響

鋅離子是親水性帶電離子，在機(jī)體內(nèi)不能以簡單的被動擴(kuò)散方式進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，因此，細(xì)胞內(nèi)外鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)態(tài)維持主要依靠鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來實(shí)現(xiàn)。ZNT-1是一種雙功能蛋白，介導(dǎo)鋅從細(xì)胞質(zhì)出口到細(xì)胞器或細(xì)胞外，在促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)鋅外流的同時還可以抑制鋅通過L型鈣通道[23]。Shusterman等[24]研究發(fā)現(xiàn)，將胚胎小鼠的純合ZNT-1基因敲除，胚胎移植不久后就將死亡，表明ZNT-1是胎兒從母體攝取鋅的一種重要蛋白分子。本試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸鋅和硫酸鋅處理顯著上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞ZNT-1的mRNA表達(dá)，表明兩者可能對鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)有促進(jìn)作用，且乳酸鋅的效果更加顯著，這或是由于有機(jī)鋅在轉(zhuǎn)錄水平上生物利用率更高的原因。富含半胱氨酸腸蛋白(CRIP)主要存在于小腸中，是一種飽和的鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)吸收、維持管腔結(jié)構(gòu)營養(yǎng)吸收等方面可發(fā)揮重要的作用[25-26]；并且CRIP可參與細(xì)胞因子平衡及免疫細(xì)胞的分化或成熟，在宿主的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[27-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同鋅源處理均能提高IPEC-J2細(xì)胞CRIP1、CRIP2鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，但硫酸鋅的提高作用更加顯著；然而，乳酸鋅對CRIP1、CRIP2 mRNA相對表達(dá)量的上調(diào)作用則更為顯著。mRNA和蛋白水平是一個相偶聯(lián)的過程，但是兩者沒有必然的一致的趨勢，這可能是因?yàn)槎喾N影響因素影響這一過程，比如mRNA的降解、蛋白的降解、自身表達(dá)產(chǎn)生阻遏、修飾折疊等。綜上所述，乳酸鋅和硫酸鋅均可不同程度提高鋅轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)和分泌，可能對鋅從腸細(xì)胞頂膜到基底膜的轉(zhuǎn)運(yùn)有促進(jìn)作用，因而參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)和細(xì)胞增殖，維持上皮細(xì)胞的生長分化，提高機(jī)體腸道免疫功能，且硫酸鋅的作用效果更優(yōu)。

4 結(jié) 論

當(dāng)乳酸鋅和硫酸鋅添加濃度為7.5 mg/mL時，可最大限度提升IPEC-J2細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)，一定程度上促進(jìn)鋅的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而改善腸上皮細(xì)胞免疫功能；但僅有添加乳酸鋅可上調(diào)IPEC-J2細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸道屏障功能，故乳酸鋅效果優(yōu)于硫酸鋅。