徐啟龍 汪 洋 李先根 肖 勘 肖世平 魏偉群 劉玉蘭*

(1.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023；2.江西天佳生物工程股份有限公司，南昌 330200)

腸道不僅是消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，也是機(jī)體重要的屏障器官，能夠抵御內(nèi)源性和外源性有害物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體內(nèi)環(huán)境[1]。許多因素如應(yīng)激、感染和炎癥等能導(dǎo)致腸黏膜損傷和功能障礙[2]，但是腸道損傷的機(jī)制尚未闡明。

腸道損傷與細(xì)胞死亡密切相關(guān)。目前公認(rèn)的主要細(xì)胞死亡類型有3種，即壞死、凋亡和自噬。凋亡又稱“程序性死亡”，在生物體發(fā)育過程中普遍存在，是一種由基因控制的、主動(dòng)的、有序性的細(xì)胞死亡方式。壞死則是由一種由物理、化學(xué)或生物等因素導(dǎo)致的細(xì)胞死亡方式，傳統(tǒng)上，壞死被認(rèn)為是無序的、被動(dòng)的、不可逆和不可調(diào)控的[2-3]。近年來，一種新鑒定的細(xì)胞死亡方式——程序性壞死，因有別于傳統(tǒng)的細(xì)胞死亡方式——壞死、凋亡及自噬，而成為生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。研究表明，程序性壞死是一種由基因決定的細(xì)胞主動(dòng)有序的死亡方式，不依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)途徑，一般在凋亡被抑制的情況下發(fā)生，可最終引發(fā)鄰近細(xì)胞的免疫應(yīng)答[4]；死亡細(xì)胞具有典型的壞死細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞和細(xì)胞器體積腫大，線粒體擴(kuò)大崩解，溶酶體膜破壞，酶類釋放到周圍組織，核膜破裂，核溶解，碎核涌出細(xì)胞，會(huì)引起周圍組織的炎癥反應(yīng)[5]。

程序性壞死信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子有受體相互作用蛋白激酶1(RIP1)、受體相互作用蛋白激酶3(RIP3)、混合系列蛋白激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(MLKL)[6]。研究表明，程序性壞死在缺血再灌注和炎癥反應(yīng)等多種因素導(dǎo)致的組織損傷中發(fā)揮重要作用。抑制程序性壞死對(duì)這些因素誘導(dǎo)的組織損傷具有重要的預(yù)防和治療作用[7]。然而，程序性壞死在脂多糖(LPS)注射誘導(dǎo)的仔豬腸道損傷中的作用尚未被闡明。因此，本試驗(yàn)采用腹膜注射LPS構(gòu)建仔豬腸道損傷模型，來探究LPS刺激對(duì)斷奶仔豬腸道形態(tài)及程序性壞死信號(hào)通路的影響，為揭示程序性壞死在腸道損傷中的作用奠定初步基礎(chǔ)，最終為尋求緩解腸道損傷的措施提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

LPS：大腸桿菌血清型055∶B5，購于Sigma公司；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR所用試劑盒信息參見黃菲菲等[8]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取12頭平均體重為(7.07±0.57)kg的28日齡杜×長(zhǎng)×大三元斷奶仔豬，隨機(jī)分為2組，分別為對(duì)照組和LPS刺激組，每組6頭。所有仔豬自由飲水、采食，預(yù)飼9 d，仔豬狀態(tài)良好，體重達(dá)到(8.96±0.54)kg。LPS刺激組腹腔注射100 μg/kg BW的LPS，對(duì)照組注射等量的生理鹽水。注射LPS 4 h后將仔豬麻醉屠宰，取空腸中部置于冰上，用生理鹽水清洗后，剪取3 cm固定于4%多聚甲醛溶液中用于制作組織切片；另取相近腸段10 cm沿縱向剪開刮取腸黏膜后存放在液氮中，最后再轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 空腸組織形態(tài)學(xué)分析

首先將空腸組織樣品進(jìn)行包埋，制成5 μm的切片，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色、樹脂膠封片等處理，之后在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察空腸組織形態(tài)，測(cè)量絨毛高度、隱窩深度，并計(jì)算兩者比值。具體方法參照陳逢[9]。

1.3.2 空腸黏膜DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量測(cè)定

取空腸黏膜制備成勻漿液，然后稀釋為1%勻漿液后測(cè)定DNA、RNA、蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定，DNA和RNA含量采用參照J(rèn)ohnson等[10]使用分光光度計(jì)法測(cè)定。根據(jù)蛋白質(zhì)、DNA和RNA含量計(jì)算RNA/DNA、蛋白質(zhì)/DNA值。

1.3.3 空腸炎性細(xì)胞因子和程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

提取空腸黏膜總RNA，然后按照Prime Script RT Reagent Kit試劑盒步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)采用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)real-time PCR試劑盒。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為參比基因，采用Livak等[11]的2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因——炎性細(xì)胞因子[環(huán)氧合酶2(COX2)、熱休克蛋白70(HSP70)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]和程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因[RIP1、自殺相關(guān)因子死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)、Caspase8、RIP3、MLKL、磷酸甘油酸變位酶5(PAGM5)、動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Drp1)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)]的mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。以P≤0.01為差異極顯著，P≤0.05為差異顯著，0.05

2 結(jié) 果

2.1 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，對(duì)照組空腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，絨毛較長(zhǎng)；LPS刺激后空腸絨毛嚴(yán)重萎縮，并大量脫落。由表2可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激導(dǎo)致空腸絨毛高度和隱窩深度顯著降低(P<0.05)。

表2 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

圖1 空腸組織切片

2.2 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜蛋白質(zhì)含量以及RNA/DNA和蛋白質(zhì)/DNA的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激顯著降低了空腸黏膜RNA/DNA(P<0.05)，同時(shí)蛋白質(zhì)含量和蛋白質(zhì)/DNA有顯著下降趨勢(shì)(P=0.054、P=0.095)。

表3 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸黏膜蛋白質(zhì)含量以及RNA/DNA和蛋白質(zhì)/DNA的影響

2.3 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸炎性細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激后導(dǎo)致空腸HSP70和IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，COX2的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

表4 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸炎性細(xì)胞因子mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.4 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

由表5可知，與對(duì)照組相比，LPS刺激后導(dǎo)致空腸程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因RIP1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，RIP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)。

表5 LPS刺激對(duì)斷奶仔豬空腸程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

3 討 論

LPS存在于所有革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜中，對(duì)宿主有毒性。LPS能誘導(dǎo)腸道形態(tài)學(xué)損傷，如黏膜下水腫、出血、黏膜壞死，并導(dǎo)致黏膜通透性增加和細(xì)菌移位[12]。因此，通過在豬腹膜或靜脈注射一定劑量的LPS是構(gòu)建仔豬腸道損傷模型的經(jīng)典方式[13]。本試驗(yàn)采用LPS刺激仔豬，探究其對(duì)仔豬空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、炎癥反應(yīng)和程序性壞死信號(hào)通路的影響。

腸道絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度/隱窩深度常被用來評(píng)估腸道形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性[14]。蛋白質(zhì)、RNA和DNA含量是反映腸道生長(zhǎng)發(fā)育及損傷修復(fù)的指標(biāo)，蛋白質(zhì)/DNA、RNA/DNA可表明蛋白質(zhì)合成能力[15]。本試驗(yàn)中，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬腸道絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，表現(xiàn)為絨毛萎縮、脫落；同時(shí)，LPS刺激導(dǎo)致空腸絨毛高度和隱窩深度顯著降低，并顯著降低了空腸黏膜RNA/DNA，同時(shí)蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)/DNA有顯著下降趨勢(shì)，表明LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬空腸結(jié)構(gòu)和功能受損。Liu等[16]的研究結(jié)果也表明LPS刺激會(huì)導(dǎo)致斷奶仔豬空腸和回腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，與本研究結(jié)果一致。

研究表明，炎性細(xì)胞因子COX2、HSP70和IL-6等在炎癥性腸病中起著重要作用[17]。COX2在炎癥的發(fā)生和消退過程中都起到了重要作用：在炎癥發(fā)生期通過合成前列腺素E2(PGE2)誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞釋放趨化因子發(fā)揮促炎作用，在炎癥消退期以合成前列腺素D2(PGD2)、15-脫氧前列腺素J2(15ΔPGJ2)發(fā)揮拮抗炎癥和抑制氧化應(yīng)激的作用[18]。HSP70在機(jī)體抵御各種有害刺激中發(fā)揮重要作用，可抗細(xì)胞凋亡、抗氧化，參與機(jī)體的先天免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫[19]。IL-6則能通過加強(qiáng)炎性細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使炎性細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，最終引起局部炎癥反應(yīng)[20]。Lang等[21]的研究結(jié)果表明，在大鼠腸道中LPS刺激會(huì)提高炎性細(xì)胞因子COX2和HSP70的mRNA相對(duì)表達(dá)量，并促使其在短時(shí)間內(nèi)(1～2 h)達(dá)到峰值。本試驗(yàn)中，LPS刺激導(dǎo)致斷奶仔豬空腸COX2、HSP70和IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，表明LPS刺激導(dǎo)致空腸炎癥反應(yīng)激活并使空腸受損加重。

在病理?xiàng)l件下，細(xì)胞程序性壞死和炎癥互相影響[22]。目前，研究較為廣泛的是腫瘤壞死因子(TNF)與死亡受體腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)結(jié)合所介導(dǎo)的程序性壞死信號(hào)通路。TNF與TNFR1結(jié)合可引起后者構(gòu)象變化，隨后募集胞內(nèi)的TNF受體相關(guān)信號(hào)分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白(TRADD)、RIP1等形成復(fù)合體Ⅰ。隨后，復(fù)合體Ⅰ上的TRADD和RIP1會(huì)解離并發(fā)生磷酸化且提供新的結(jié)合位點(diǎn)，這些結(jié)合位點(diǎn)又會(huì)募集FADD、Caspase8、RIP1形成新的復(fù)合體Ⅱ[23-25]。當(dāng)Caspase8活性被抑制時(shí)，復(fù)合體Ⅱ上的RIP1、RIP3、MLKL發(fā)生磷酸化，執(zhí)行程序性壞死功能。本試驗(yàn)檢測(cè)了程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化，結(jié)果表明，LPS刺激顯著提高了斷奶仔豬空腸程序性壞死信號(hào)通路相關(guān)基因RIP1、RIP3的mRNA相對(duì)表達(dá)量，說明LPS刺激導(dǎo)致程序性壞死信號(hào)通路激活。因此，我們推測(cè)，仔豬空腸的損傷和炎癥反應(yīng)與程序性壞死信號(hào)通路激活密切相關(guān)。

4 結(jié) 論

LPS刺激損傷了斷奶仔豬的空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)，激活了炎癥反應(yīng)和程序性壞死信號(hào)通路。