武旭芳 張養(yǎng)東 鄭 楠 王加啟

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶及奶制品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

乳及乳制品是居民膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分。乳是一種水包油的乳狀液，其中的脂類以乳脂肪球的形式存在，98%的乳脂肪球核是以1個碳骨架和3個脂肪酸分子組成的非極性脂質(zhì)甘油三酯的形式存在[1]。乳脂中脂肪酸的組成與其營養(yǎng)品質(zhì)和理化性質(zhì)密切相關(guān)[2]。據(jù)報(bào)道，乳脂約有大于400種脂肪酸組成[3]，其中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFAs)不足3%。SCFAs是一組碳原子數(shù)在2～6之間的有機(jī)酸，通常包括直鏈的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸，以及支鏈的異丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、2-甲基戊酸、3-甲基戊酸等[4-6](表1)。乳脂中SCFAs研究較多的是丁酸和己酸。本文就乳中SCFAs的來源、分布、組成、生理功能及檢測技術(shù)進(jìn)行綜述，為進(jìn)一步檢測乳中短鏈脂肪存在及應(yīng)用提供科學(xué)參考。

表1 10種短鏈脂肪酸CAS號[7]及化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 SCFAs的來源、組成

H4F：四氫葉酸 tetrahydrofolic acid；CoFeSP：鈷鐵硫蛋白 cobalt iron sulfur protein：CO：一氧化碳 carbon monoxide；CO2：二氧化碳 carbon dioxide；H2：氫氣 hydrogen；H2O：水 water。

SCFAs在乳中主要以酯化形式存在于甘油三酯Sn-1和Sn-3位，部分以游離態(tài)形式存在。SCFAs在乳脂中含量較低，動物乳中含量略高于人乳。目前文獻(xiàn)對乳中SCFAs的研究主要集中于人乳和動物乳中丁酸和己酸2種含量較高的SCFAs。其中，丁酸和己酸在人乳中含量分別為0.06%～0.60%、0.07%～0.43%[16-17]，驢乳中含量分別為0.03%～0.05%、0.20%～0.27%[18]，水牛乳中含量分別為1.62%～3.80%、2.09%～2.31%[19]，牛乳中含量分別為1.23%～3.45%、1.75%～2.15%[19-20]，牦牛乳中含量分別為2.05%～3.19%、2.20%～3.42%[20-21]，駱駝乳中含量分別為0.04%～0.06%、0.11%～0.17%[22]，山羊乳中含量分別為0.93%～2.09%、2.51%～3.64%[20,23]。由于現(xiàn)有檢測技術(shù)的局限，極少數(shù)研究對乳中乙酸、丙酸、戊酸和支鏈SCFAs含量進(jìn)行了檢測。Stinson等[9]對不同國家(美國、澳大利亞、日本、南非、挪威)母乳中SCFAs含量的研究發(fā)現(xiàn)，母乳中SCFAs含量與地域有關(guān)，不同國家母乳中乙酸、丁酸含量分別為20.4～651.7 μmol/L、32.4～232.1 μmol/L，丙酸、異丁酸、戊酸、異戊酸均未在人乳中檢測到。Jiang等[24]測定4種不同類型乳(母乳、嬰幼兒配方奶粉、純牛奶乳、發(fā)酵乳)SCFAs的組成并建立指紋圖譜，研究發(fā)現(xiàn)不同類型乳中乙酸含量較高，為總SCFAs的17.54%～53.36%，丁酸和己酸含量較乙酸低，而丙酸含量極低甚至沒有。

2 SCFAs的功能

近年來，SCFAs越來越受到人們的關(guān)注，尤其在生理功能和生理疾病方面取得了廣泛的研究，盡管乳中SCFAs功能的研究仍相對較少。

2.1 生理功能

SCFAs是動物機(jī)體重要的能量來源，乙酸、丙酸、丁酸是機(jī)體重要的供能物質(zhì)[25]，參與宿主能量代謝(脂質(zhì)、糖類、膽固醇)的調(diào)節(jié)。SCFAs在被結(jié)腸細(xì)胞吸收之后，會進(jìn)入線粒體的三羧酸循環(huán)中，為細(xì)胞產(chǎn)生ATP和能量，同時促進(jìn)動物機(jī)體水、鈉吸收，維持動物機(jī)體的電解質(zhì)平衡[26]。此外，SCFAs充當(dāng)各種組織中的底物或信號分子，乙酸、丙酸和丁酸被認(rèn)為是腸道微生物和宿主細(xì)胞之間傳遞信息的紐帶，起到調(diào)節(jié)宿主代謝和免疫功能的作用，是微生物群-腸-腦軸中重要的功能性和生命性成分[27-29]，與老年人的認(rèn)知評分、長期記憶等有關(guān)。SCFAs可以通過血腦屏障起到保護(hù)作用。丁酸能夠通過激活一磷酸腺苷(AMP)激活蛋白激酶的表達(dá)，來改變緊密連接蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到增強(qiáng)腸道屏障功能、降低腸道炎癥的效果，以此保持腸道的完整性[12]。乳中SCFAs提供了許多乳制品特有的風(fēng)味和氣味，特別是發(fā)酵乳制品和乳酪的風(fēng)味[30]。游離態(tài)SCFAs，特別是丁酸，也是牛乳和其他乳制品酸敗的原因[1]。

2.2 生理疾病

SCFAs在維持健康穩(wěn)態(tài)和各種病理?xiàng)l件的發(fā)展都具有重要意義。SCFAs在代謝性疾病、炎癥反應(yīng)、心腦血管疾病方面的作用被逐一揭示。SCFAs表現(xiàn)出廣譜的抗菌活性，包括抗炎、抑菌以及抑制結(jié)腸炎癥和癌類細(xì)胞系的生長[31-32]；丁酸在維持腸道上皮健康方面具有積極作用，包括對腸道黏膜的保護(hù)作用，提高腸道健康和免疫力[31,33]。SCFAs還與許多代謝疾病相關(guān)，如嬰幼兒肥胖、高血脂、糖尿病、心腦血管疾病[10,34]等。SCFAs參與各種體內(nèi)代謝通路，包括微生物群-腸-腦軸、腸道菌群-SCFAs-免疫軸等，被證實(shí)與抑郁癥、自閉癥、帕金森癥、精神分裂癥、阿爾茲海默癥等一系列精神疾病相關(guān)聯(lián)。乳中SCFAs在生理疾病方面也表現(xiàn)出積極的作用，研究表明嬰幼兒早期從母乳攝入的SCFAs可以降低特應(yīng)性疾病(食物過敏、哮喘、特應(yīng)性鼻炎等)或肥胖的風(fēng)險[9]，母乳與早產(chǎn)兒定殖的腸道細(xì)菌相互作用產(chǎn)生SCFAs，如乙酸、丙酸、丁酸等，在早產(chǎn)兒未成熟的腸道細(xì)胞中起到預(yù)防過度炎癥引起的壞死性小腸結(jié)腸炎等作用[35]。綜上所述，SCFAs的生理功能和疾病預(yù)防方面意義的發(fā)現(xiàn)加強(qiáng)了對有效和精確定量方法的需求。

3 乳中SCFAs檢測技術(shù)

SCFAs具有極性大、易揮發(fā)、水溶性強(qiáng)、相對分子質(zhì)量小等特性，對其準(zhǔn)確定量提出了挑戰(zhàn)。此外，乳中SCFAs存在形式包括結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種[16]，進(jìn)一步增加了其準(zhǔn)確定量的困難性。目前，乳中SCFAs的檢測方法主要包括氣相色譜(gas chromatography，GC)法、液相色譜法、核磁共振等。

3.1 GC法

GC法是一種利用氣體作流動相的色譜分離分析方法，具有分離能力強(qiáng)、檢測器選擇簡單、定量準(zhǔn)確、靈敏度高以及儀器成本相對低廉等優(yōu)點(diǎn)。由于SCFAs的揮發(fā)性，GC法廣泛地應(yīng)用于SCFAs分析。根據(jù)GC法連接的檢測器的不同，GC法主要分為氣相色譜-氫火焰離子檢測器(gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)2種。與GC-FID相比，GC-MS提供了更好的靈敏性和選擇性。

Zebari等[36]對脂質(zhì)進(jìn)行水提后使用GC-FID測定了乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸6種SCFAs含量，研究了乳中脂肪酸組成與泌乳荷斯坦奶牛發(fā)情期的關(guān)系。然而通過水提法進(jìn)行GC法分析時可能因SCFAs部分水解而導(dǎo)致回收率降低[37]，因此通常在脂質(zhì)提取后加入鹽酸、硫酸、偏磷酸等抑制其水解以達(dá)到提高提取效率和SCFAs峰形的效果。Jiang等[24]通過生乳中添加5%鹽酸乙醇溶液渦旋振蕩離心后上機(jī)，建立了檢測乳中乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、己酸5種SCFAs含量的方法，并通過檢出限、定量限、日間差異、日內(nèi)差異等指標(biāo)對該方法的靈敏度、精密度進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法優(yōu)勢在于反應(yīng)快速，前處理簡單，結(jié)果顯示出良好的精密度和靈敏度，表明在不使用有機(jī)溶劑的情況下使用酸化水法仍能取得較好的結(jié)果。然而由于SCFAs羧基基團(tuán)極性較強(qiáng)，只進(jìn)行酸化步驟在進(jìn)行GC法分析時會出現(xiàn)吸附作用而導(dǎo)致結(jié)果重復(fù)性較差，特別含量較低(<1 mmol/L)時很容易產(chǎn)生這種誤差[38]。乳中SCFAs含量較低，因此在進(jìn)行GC法分析前必須對酸進(jìn)行衍生化。衍生化目的在提高目標(biāo)分析物的熱穩(wěn)定性，降低揮發(fā)性脂肪酸的蒸發(fā)損失，提高分析分離度和靈敏度，改善色譜保留時間、峰形等，減少樣品與色譜柱涂層間的反應(yīng)。Dai等[16]以甲醇為衍生化試劑，三氟化硼為催化劑，70 ℃水浴5 min來檢測不同胎齡嬰兒攝入的人乳中SCFAs含量及其在哺乳期的變化。然而，Mannion等[39]以庚烷/乙醚提取脂質(zhì)，以丁醇作為衍生化試劑，通過三氟化硼80 ℃水浴加熱1 h來催化丁酯化反應(yīng)，測定乳中游離態(tài)的丁酸、己酸含量，通過丁酯化與甲酯化的對比，發(fā)現(xiàn)SCFAs丁酯具有高分子質(zhì)量、低揮發(fā)性等優(yōu)點(diǎn)，對易揮發(fā)的SCFAs含量測定更準(zhǔn)確。丁巖等[40]通過GC法測定發(fā)酵乳中7種SCFAs含量，發(fā)酵乳振蕩離心后調(diào)節(jié)pH至弱堿性，上清液中依次加入磷酸鹽緩沖液、衍生化試劑和丙酮后水浴加熱，加入正己烷后通過GC法測定。然而，由于乳中SCFAs存在形式的特殊性以及基質(zhì)的復(fù)雜性，關(guān)于乳中SCFAs含量的GC法分析的研究是相對有限的。

3.2 液相色譜法

液相色譜法是以液體為流動相通過高壓輸液系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)兩相分離的監(jiān)測技術(shù)，具有高效、靈敏、分離效率高、選擇性好、同時定量多組分、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。液相色譜法也被應(yīng)用于各種生物樣品中SCFAs含量的檢測。

Contarini等[41]通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用/質(zhì)譜聯(lián)用定量驢乳中性脂質(zhì)和磷脂部分存在的丁酸、己酸，其中丁酸、己酸在中性脂質(zhì)部分被準(zhǔn)確定量，磷脂部分未檢出。Liu等[42]通過乳樣中加入丁醇、甲醇、氯仿脂肪混提物(3∶5∶4)，渦旋振蕩離心后直接進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析熱應(yīng)激對乳中以甘油三酯形式存在的脂肪酸組成的影響，結(jié)果表明，熱應(yīng)激改變牛乳的甘油三酯譜，其中SCFAs-甘油三酯含量下降。通過液相色譜分析乳中SCFAs含量主要集中于甘油三酯含量的分析，是相對有限的，液相色譜也被廣泛應(yīng)用于其他生物基質(zhì)中SCFAs含量的分析[43-44]。

3.3 核磁共振

核磁共振是根據(jù)核磁共振效應(yīng)來確定分子結(jié)構(gòu)的高新技術(shù)，具有無損、快速、重現(xiàn)性高、覆蓋范圍廣、制備工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)分析。核磁共振已用于糞便和腸道內(nèi)容物SCFAs含量的分析，乳中SCFAs含量的分析也有涉及。

Wiking等[45]通過1H核磁共振測定了乳中與風(fēng)味和氣味相關(guān)的SCFAs含量，結(jié)果表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。Jensen等[3]和Picariello等[46]通過13C核磁共振分別鑒別不同品種動物乳中和建立高分辨的乳脂摻假合成的中短鏈甘油三酯含量。Prentice等[10]通過乳樣與氘代氯仿混合后振蕩離心，利用1H核磁共振測定母乳中結(jié)合和游離態(tài)SCFAs含量，通過母乳中SCFAs含量來研究其與嬰幼兒生長發(fā)育的關(guān)系。Stinson等[9]通過1H核磁共振對109位母親產(chǎn)后1個月母乳樣品中SCFAs含量進(jìn)行分析來研究SCFAs含量與地域、特應(yīng)性狀態(tài)的聯(lián)系。

3.4 其他方法

除此以外，SCFAs的定量方法也包括毛細(xì)管電泳[34,47]、微生物檢測器[48]、紅外或近紅外檢測[49]等。曹玉梅[48]通過微生物檢測器測定牛乳樣品中的SCFAs含量。Ferrand-Calmels等[49]通過中紅外光譜中測算得出牛乳和羊乳中SCFAs組成。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，SCFAs在機(jī)體生理功能和生理疾病方面具有重要意義。然而，由于乳中SCFAs存在形式的復(fù)雜性和不確定性，以及現(xiàn)有檢測方法的局限性，乳中SCFAs的準(zhǔn)確定量仍然是最復(fù)雜和極具挑戰(zhàn)性的工作之一。建立簡便、快捷、定性和定量準(zhǔn)確的SCFAs含量檢測方法亟待完成，以此提高我們對乳中SCFAs組成、存在形式、生理功能等方面的認(rèn)知。