劉 帥 熊云霞 孫鋁輝 王 麗*

(1.華中農業(yè)大學動物科技學院動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.廣東省農業(yè)科學院動物科學研究所，農業(yè)農村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室，廣州 510640)

近年來，世界各國都把畜禽飼料減抗、替抗提上日程，我國也禁止向商品飼料中添加除中草藥外的其他促生長類藥物飼料添加劑。益生菌因其安全、高效、無抗藥性、無殘留等特性成為重要的新型綠色抗生素替代品之一，乳桿菌、酵母菌、芽孢菌等已成為豬生產養(yǎng)殖過程中常用的益生菌種。益生菌在儲存、運輸、加工等過程中失活是其在生產應用中遇到的卡脖子問題。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，BS)耐高溫、耐擠壓、耐酸堿，可以在豬腸道中很好的生存、定植，使得其在生產中應用廣泛，是我國飼料添加劑目錄中12個可直接飼喂的飼用益生菌之一。本文簡單介紹枯草芽孢桿菌的生理特性，綜述其在豬生產上的應用，及其對豬生長性能、腸道健康、肉品質等的影響和作用機制，以期為枯草芽孢桿菌在豬生產中的進一步應用提供參考。

1 枯草芽孢桿菌的生理特性

枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性菌芽孢桿菌屬的一種，需氧或兼性厭氧，廣泛存在土壤及腐敗的生物體中，易于分離和培養(yǎng)[1]。芽孢狀態(tài)時能在極端環(huán)境下生存，是一種抗氧化、耐高溫、耐擠壓、耐酸堿的細菌，便于運輸、存儲及加工[2]?？莶菅挎邨U菌可以在動物消化道很好的存活及定植，黃玉嵐等[3]報道發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌WEI-62經人工胃液處理或胃腸液順序處理后，存活率均在75%以上；經人工腸液處理3 h后的存活率在90%以上。枯草芽孢桿菌在代謝過程中可產生抑菌物質，如抗菌肽等抑菌物質，抑制鏈球菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌等有害菌的生長[4-7]。另外，枯草芽孢桿菌還可以促進腸道有益菌乳桿菌和雙歧桿菌的生長[8-9]。

2 枯草芽孢桿菌在豬生產中的應用

枯草芽孢桿菌是養(yǎng)豬生產中常用的益生菌之一，傳統(tǒng)的應用形式有3種：1)直接添加于飼糧中進行飼喂；2)作為發(fā)酵菌種發(fā)酵飼糧后再進行飼喂；3)直接口服或灌胃菌粉劑。在生產中，枯草芽孢桿菌常常和酶制劑、其他益生菌及益生元復配使用。近年來也有不少研究將枯草芽孢桿菌作為機體的免疫誘導劑或作為疫苗載體[10-13]。

2.1 枯草芽孢桿菌在母豬中的應用

研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以提高母豬血清免疫球蛋白G(immunoglobulins g，IgG)和總蛋白含量，提高泌乳前3周的泌乳量[14]，并可潛在提高母豬生殖繁育能力，提高母豬窩產仔數[15-16]。并且，在母豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌，對仔豬具有代間傳遞效應。韓麗[17]在母豬妊娠第85天開始飼喂添加枯草芽孢桿菌(1.0×109CFU/kg)的飼糧，發(fā)現(xiàn)其子代哺乳期血清尿素氮和甘油三酯含量降低，糞便大腸桿菌數量降低。但是Michiels等[18]研究表明，定植于母豬腸道的枯草芽孢桿菌不會轉移至其子代，枯草芽孢桿菌如何通過母體影響其子代的機制有待進一步研究。另外，枯草芽孢桿菌可以減輕玉米赤霉烯酮誘導的初產母豬的氧化應激和組織病理學變化[19]。

2.2 枯草芽孢桿菌在仔豬中的應用

飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高仔豬的生長性能[20]。Lewton等[21]研究表明，飼糧中添加7.4×107CFU/kg的枯草芽孢桿菌可以提高仔豬氨基酸的消化率。王曉丹[22]在研究枯草芽孢桿菌對斷奶仔豬生長性能的影響時發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加250 g/t(4×109CFU/g)枯草芽孢桿菌能有效降低仔豬腹瀉率，提高仔豬平均日增重，促進仔豬生長。并且，飼糧添加枯草芽孢桿菌可影響斷奶仔豬與脂肪代謝有關的血液生化指標[23]。使用枯草芽孢桿菌對飼糧或飼糧部分原料進行發(fā)酵后，飼喂斷奶仔豬也能取得較好效果。Lee等[24]研究發(fā)現(xiàn)，添加經枯草芽孢桿菌發(fā)酵過的柑橘殘渣，仔豬平均日采食量和平均日增重線性增加。在仔豬飼糧中使用經枯草芽孢桿菌發(fā)酵過的豆粕，可提高仔豬平均日增重，降低腹瀉率，提高養(yǎng)分表觀消化率[25]。病毒侵襲的情況下，枯草芽孢桿菌的益生作用更加明顯?？诜莶菅挎邨U菌制劑可以預防仔豬因大腸桿菌誘導的水腫病的發(fā)生，降低回腸和糞便中大腸桿菌數量，減輕回腸和盲腸絨毛水腫[26]，緩解病毒性腹瀉導致的相關病理變化[27]。枯草芽孢桿菌可以減輕全身炎癥反應，提高腸道屏障的完整性，減輕大腸桿菌引起的仔豬生長受阻和腹瀉[28]。Jia等[29]研究表明，枯草芽孢桿菌可以減輕脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)污染的飼糧引起的仔豬中毒反應，減緩了DON在血清、肝臟和腎臟中的擴散。

枯草芽孢桿菌與其他菌種聯(lián)合具有良好的協(xié)同作用。Zhu等[30]使用枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和釀酒酵母對豆粕進行聯(lián)合固態(tài)發(fā)酵，結果顯示，聯(lián)合菌發(fā)酵豆粕可以顯著提高斷奶仔豬生長性能，改善腸道健康，降低空腸和回腸自噬因子微管蛋白1輕鏈3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3 b，LC3B)的含量。王亞芳等[31]研究也發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以緩解大腸桿菌等致病菌導致的腹瀉、平均日增重降低、料重比升高等，且枯草芽孢桿菌與其他菌株組合后效果更佳?？莶菅挎邨U菌與地衣芽孢桿菌聯(lián)合使用可以提高飼糧消化率[32]，改善腸道健康，緩解炎癥[33]。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)，口服飼喂枯草芽孢桿菌混合液可以重組仔豬腸道微生物區(qū)系，增強杯狀細胞的功能，改善大腸桿菌引起的腸炎。

2.3 枯草芽孢桿菌在育肥豬中的應用

枯草芽孢桿菌可以提高育肥豬的生長性能、機體免疫、抗氧化能力。王煜琦等[34]發(fā)現(xiàn)，在飼糧中添加枯草芽孢桿菌(1×109CFU/kg)，可提高育肥豬平均日增重、平均日采食量、粗蛋白質和鈣及磷的消化率、銅和鋅吸收率、血清總抗氧化能力及IgG含量等，并降低血清丙二醛含量。飼糧添加0.1%的枯草芽孢桿菌(1×109CFU/g)提高育肥豬血清總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶活性及肝臟細胞色素P450(cytochrome P450，P450)、細胞色素氧化酶2A6(cytochrome oxidase 2A6，CYP2A6)、細胞色素氧化酶2E1(cytochrome oxidase 2E1，CYP2E1)含量[35]。飼糧添加枯草芽孢桿菌可以提高育肥豬生長性能和養(yǎng)分表觀消化率，并且枯草芽孢桿菌的使用降低豬場氨氣(NH3)的排放及糞便臭味，對于養(yǎng)殖業(yè)減排和環(huán)保具有重要意義[36]。此外，枯草芽孢桿菌在改善肥育豬胴體性狀及肉質上也有很好的效果。Cui等[37]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加枯草芽孢桿菌(4×1011CFU/kg)可以顯著提高育肥豬眼肌面積，降低板油重。Meng等[38]研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加枯草芽孢桿菌(2×109CFU/kg)可以提高育肥豬肉色評分及pH?？莶菅挎邨U菌也常與其他添加劑聯(lián)合應用于育肥豬生產。彭俊平等[39]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌與植物甾醇和復合酶制劑聯(lián)合使用可以降低育肥豬料重比，降低背膘厚度，提高肉色評分。Balasubramanian等[40]將枯草芽孢桿菌與凝結芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和醋酸梭菌聯(lián)合使用，結果顯示，復合益生菌可以提高平均日增重和飼料轉化率，降低背脂含量，增加肉色評分，增加糞便乳酸桿菌數量，減少腸道大腸桿菌數量。枯草芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌聯(lián)合使用可以促進生長豬的發(fā)育，降低NH3和硫化氫(H2S)等有害氣體的排放[41]。

3 枯草芽孢桿菌的作用和機制

3.1 提高生長性能

枯草芽孢桿菌具有較好地分泌蛋白酶、纖維酶、淀粉酶、脂肪酶等活性物質，對飼糧植物源抗原蛋白具有較強的降解效果[42-43]。生產中常常作為復合益生菌之一用來發(fā)酵全價料或者某一配料原料，以降低其中的抗營養(yǎng)因子，增加飼糧的消化率。經枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的飼料和蛋白質原料，可溶性蛋白、總氨基酸含量增加，抗營養(yǎng)因子含量降低[44]。Shi等[45]利用體外發(fā)酵試驗表明，枯草芽孢桿菌可以降低玉米-豆粕型飼糧的大豆抗原、植酸、中性洗滌纖維含量，增加游離氨基酸和小肽的含量。這是枯草芽孢桿菌能提高斷奶仔豬生長性能的主要原因之一，此外枯草芽孢桿菌改善仔豬腸道健康狀況也是提高生長性能的原因。

3.2 改善腸道健康

3.2.1 提高消化酶活性

腸道消化酶的含量和活性直接影響仔豬的養(yǎng)分利用和生長性能。早期斷奶仔豬腸道發(fā)育不完善，斷奶后消化酶含量迅速降低，加上應激反應，各種酶活性受到抑制，營養(yǎng)消化率下降，生長發(fā)育受阻?？莶菅挎邨U菌能100%到達腸道中，是因為在芽孢狀態(tài)下具有良好的穩(wěn)定性?？莶菅挎邨U菌分泌的蛋白酶、脂肪酶及纖維素酶等可以補充仔豬腸道消化酶數量，協(xié)同腸道消化酶一起發(fā)揮作用[46]。Hu等[47]研究發(fā)現(xiàn)，在7日齡斷奶仔豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌可以提高其腸道中麥芽糖酶和蔗糖酶的活性。

3.2.2 保護腸道屏障完整性

仔豬腸道屏障包括機械屏障、化學屏障、微生物屏障和免疫屏障。仔豬斷奶后，腸道不適應固態(tài)飼糧，腸絨毛磨損，加上抗體含量下降，很難抵抗病原體的攻擊，小腸黏膜進一步受到傷害，引發(fā)感染性腹瀉。Douarche等[48]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以在腸道黏膜細胞表面構建一層可以提高機械阻力的生物膜。并且，枯草芽孢桿菌還可以促進小腸絨毛發(fā)育和小腸表皮細胞生長因子(epidermal growth factor，EGF)、胰島素樣生長因子-1受體(insulin like growth factor-1 receptor，IGF-1R)等mRNA的表達[49]。菌膜強度增加可使上皮細胞緊密連接蛋白表達量上調，減小了腸道受機械外力造成的損傷?？莶菅挎邨U菌可以提高腸道緊密連接蛋白表達，Gu等[50]研究表明，枯草芽孢桿菌可以改善DON誘導豬腸道屏障損傷，上調腸道緊密連接蛋白-1(zona occludens protein-1，ZO-1)和封閉蛋白(Occludin)的表達?？莶菅挎邨U菌自身分泌的殼聚糖酶有抗真菌的生物學活性[51]，另外枯草芽孢桿菌誘導小腸免疫球蛋白A(IgA)分泌細胞增殖分化，促進分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)的分泌[52]。sIgA可以促進抗原跨腸上皮逆向轉運至腸道淋巴組織中的樹突細胞亞群，緩解致病菌和病原引起的促炎反應[53]。

3.2.3 腸道免疫調節(jié)

仔豬在斷奶階段免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，當體內母源抗體減少后，被動免疫減弱，極易遭受致病菌侵襲。利用枯草芽孢桿菌能夠改善腸道黏膜免疫，提高仔豬免疫力。豬的小腸中存在許多Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)，其中TLR2和TLR9的表達有利于仔豬的生長，并且可以刺激仔豬腸道免疫反應。飼喂枯草芽孢桿菌能夠顯著提高TLR9的表達量，而TLR2表達量的提高需要枯草芽孢桿菌在腸道內萌芽，且TLR2必須與TLR1或TLR6結合形成異二聚體才能與細菌識別。李云峰等[52]通過枯草芽孢桿菌灌胃后發(fā)現(xiàn)，仔豬十二指腸中TLR9、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)表達量提高。He等[54]的結果也顯示，枯草芽孢桿菌可以上調仔豬血清IL-6的含量。IL-6不僅能夠促進B細胞和漿細胞的增殖和抗體的分泌，還能在腸道的淋巴細胞結中促進分泌免疫球蛋白M(IgM)的細胞轉化為IgA分泌細胞。祝天龍等[55]在研究枯草芽孢桿菌制劑對仔豬生長及免疫的影響發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可使相關免疫指標如IgA、IgG、補體3(C3)和補體4(C4)含量增加。利用枯草芽孢桿菌飼喂小鼠發(fā)現(xiàn)，早期免疫反應IgG2a的分泌量顯著比IgG1多，隨后IgG2b的分泌量增多[56]。IgG2a與IgG、IgG2b由不同細胞調節(jié)的免疫反應產物，前者是由輔助性T細胞1(helper 1 cell，Th1)調節(jié)的，而后者是由輔助性T細胞2(helper 2 cell，Th2)調節(jié)的免疫反應產物。以上結果表明，免疫反應初期，枯草芽孢桿菌芽孢先通過刺激Th1細胞免疫應答，轉化形成細胞毒性T淋巴細胞，反應后期主要就作用于Th2細胞，產生sIgA和IgG1。同時在免疫反應初期，枯草芽孢桿菌芽孢還能夠刺激腸道黏膜淋巴結中的炎性趨化因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和免疫干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)的表達，而IFN-γ能夠刺激吞噬細胞的吞噬作用。在一項體外試驗中發(fā)現(xiàn)，將枯草芽孢桿菌芽孢與人單核細胞共同培養(yǎng)后，可顯著提高單核細胞白細胞介素-1β(IL-1β)和TNF-α的含量，表明其芽孢激活了Th1細胞免疫應答[57]。但是，將芽孢與巨噬細胞共培養(yǎng)后，巨噬細胞中只有IL-6的mRNA表達量增加，TNF-α和IL-1α的表達差異不大，表明芽孢激活的是Th2細胞的免疫反應。

3.2.4 維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)

枯草芽孢桿菌可以改變腸道菌群的組成，其分泌抗菌物質和乳酸等降低腸道pH，抑制病原菌生長，消耗氧氣，并為雙歧桿菌、乳酸桿菌等提供厭氧環(huán)境[7]?？莶菅挎邨U菌可以促進雙歧桿菌和乳桿菌生長，抑制大腸桿菌、梭菌、鏈球菌的生長[42-43]。Yu等[58]在體外培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌通過提高過氧化氫酶的活性來緩解活性氧對乳桿菌的氧化損傷，進而促進乳桿菌生長。腸道內同種微生物存在群體感應，可通過介導基因表達對自身種群密度進行調控，當腸道缺乏益生菌時，有害病原菌會大量繁殖。Piewngam等[59]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可以通過阻斷同一細菌的不同個體間的信號傳導，進而抑制細菌的增殖，起到調控腸道菌群的作用。

3.3 改善肌肉品質

枯草芽孢桿菌通過調控育肥豬糖脂代謝和抗氧化能力改善肉品質?？莶菅挎邨U菌可以下調脂肪合成關鍵基因脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)等mRNA的表達，降低脂肪合成關鍵酶的生成，來調節(jié)機體脂質代謝[37]。研究發(fā)現(xiàn)，育肥豬背脂厚度與腸道擬桿菌豐度呈線性負相關，枯草芽孢桿菌可通過調節(jié)腸道擬桿菌的豐度來影響機體的脂質代謝[37]。此外，動物屠宰后，胴體脂肪會被緩慢氧化[60]。肉的紅度是由肌紅蛋白的含量決定的，肉中肌紅蛋白被氧化后，會降低肉色評分[61]。枯草芽孢桿菌通過育肥豬抗氧化能力改善肉質提升肉色。

4 枯草芽孢桿菌在生產應用中存在的問題

枯草芽孢桿菌在母豬、仔豬和育肥豬上均有使用，但飼喂的劑量、持續(xù)時間長短及飼喂時動物的生長階段是影響其效果的重要因素(表1)。益生菌在腸道定植后才能發(fā)揮作用，市面上很多添加于畜禽飼糧的枯草芽孢桿菌并非宿主來源，因此無法保證其在宿主腸道的定植。如Leser等[62]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌CH201無法長期定植在豬腸道。因此，選擇能夠在腸道定植的菌株可能會有更好的效果。

表1 枯草芽孢桿菌在豬生產中的使用劑量、階段和效果匯總

目前為止，枯草芽孢桿菌在豬生產上的使用還沒有統(tǒng)一的標準，生產中使用的菌種來源廣泛，種類繁多，生產工藝的不同也使得制定標準存在困難。枯草芽孢桿菌代謝產生的抗菌物質是否會導致有害菌產生耐藥性也不得而知。另外，不同的枯草芽孢桿菌生理活性和生理功能也各不相同，這也造成生產中菌株的選用存在困難。

5 小 結

綜上所述，枯草芽孢桿菌應用在豬生產上，主要是通過提高母豬繁殖性能、仔豬生長性能，改善腸道健康，改善育肥豬的肉質，提高豬的免疫力和抗病能力來改善經濟效益。相比傳統(tǒng)的直接飼喂或發(fā)酵等使用方式，近年來以枯草芽孢桿菌作為疫苗載體和免疫誘導劑的研究方法也為枯草芽孢桿菌在豬生產上的應用提供了新思路。但在實際生產中，對于劑量、使用方法還未達成一致。不同菌種的功效和作用機制，與酶制劑、其他益生菌及益生元的相互作用機制也不清楚。因此，要推動行業(yè)的發(fā)展，還需要我們對枯草芽孢桿菌的特性、作用機制做更深入的研究。