趙玉超 蔣林樹

(北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206)

過去幾十年，抗生素由于其能有效抑制動物腸道病原微生物的生長而被廣泛應用于畜禽生產(chǎn)，但長期使用抗生素導致了微生物耐藥性增強及在動物產(chǎn)品中的殘留的問題，使畜牧行業(yè)認識到必須開發(fā)抗生素替代品[1]。含有大量活性物質(zhì)的天然植物提取物具備抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抑制胃腸道甲烷排放等功能[2-3]，被認為是具有巨大開發(fā)和應用潛力的飼料添加劑，而受到越來越多的關(guān)注。認識并優(yōu)化飼用天然植物提取物的制備工藝，對揭示植物活性功能組分、生物學作用及機制，建立功能組分結(jié)構(gòu)、含量和飼喂效果的關(guān)系至關(guān)重要[4]。因此，本文對主要天然植物功能組分制備方面的研究進展作一綜述，旨在為未來的研究、開發(fā)和應用提供借鑒。

1 飼用天然植物活性功能組分研發(fā)前景與行業(yè)現(xiàn)狀

2018年，我國將黃芩和甘草等117種藥食同源的天然植物列入《飼料原料目錄》。2020年，宣布退出除中藥外促生長類藥物飼料添加劑品種后，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部改革和完善了新飼料添加劑產(chǎn)品審批制度，針對天然植物提取物在事前咨詢、縮短研發(fā)周期、數(shù)據(jù)共享和適度放寬檢測要求方面進行了制度優(yōu)化，這激發(fā)了眾多企業(yè)和科研單位研制開發(fā)新產(chǎn)品的積極性，天然植物活性功能組分應用研究與開發(fā)將迎來新階段。

在醫(yī)藥健康和食品化工等領(lǐng)域?qū)χ参锘钚晕镔|(zhì)需求的帶動下，我國專業(yè)的植物提取物企業(yè)已經(jīng)超過1 000家[5]。國內(nèi)諸多企業(yè)已經(jīng)開始針對飼用提取物產(chǎn)品進行投入，并開發(fā)了特定產(chǎn)品，如黃芪提取物和絲蘭提取物等[6]。但是，針對飼用產(chǎn)品開發(fā)的專業(yè)化企業(yè)數(shù)量還非常少，且規(guī)模小，不具備自主研發(fā)能力，產(chǎn)品制備方法不一、標準缺乏、價格較高。雖然一些產(chǎn)品已進行了飼喂試驗，但在畜禽生產(chǎn)上并不具備效益優(yōu)勢，限制了飼用天然植物活性功能組分在動物上的商業(yè)化應用。這與中小企業(yè)在提取、分離、純化和鑒定所需的新技術(shù)應用缺乏、制備工藝優(yōu)化不足有關(guān)。

另外，科學研究方面，動物營養(yǎng)學家往往對功能組分制備這一環(huán)節(jié)認識不足。誠然，現(xiàn)代色譜和光譜技術(shù)的發(fā)展使生物活性化合物的分析比以前更容易，但產(chǎn)品效果仍然取決于制備方法和優(yōu)化的參數(shù)等[7]。制備方法不同有可能導致同類產(chǎn)品在動物上的研究數(shù)據(jù)難以相互比較，影響了研究結(jié)果的深入解讀和歸納總結(jié)。而隨著制備儀器和工藝的不斷發(fā)展，植物活性功能組分的提取效率、分離純度和鑒定準確度正在不斷提高，這也將有助于其生理活性的全面研究，促進飼用開發(fā)和產(chǎn)業(yè)升級。

1 主要制備工藝概述

飼用天然植物活性功能組分包括酚類、生物堿、揮發(fā)油、苷類、多糖和有機酸等。要獲得大量且較純的植物活性功能組分是一個復雜的過程，涉及幾個步驟，包括植物初步篩選、提取、分離純化和結(jié)構(gòu)解析等[8]。圖1展示了飼用天然植物活性功能組分制備研究的基本流程。

UV-DAD:紫外-光電二極管陣列檢測器 ultra violet-diode-array detector；MS: 質(zhì)譜 mass spectrum；NMR：核磁共振nuclear magnetic resonance；HPLC-MSn：高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 high performance liquid chromatography-mass spectrum；GC-MS：氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 gas chromatography-mass spectrum；HPLC-SPE-NMR：高效液相-固體萃取-核磁共振聯(lián)用 high performance liquid chromatography-solid phase extraction-nuclear magnetic resonance；UPLC-DAD-TOF-MS：超高壓液相色譜-電二極管陣列檢測器-飛行時間質(zhì)譜 ultra-performance liquid chromatography-diode-array detector-time of flight-mass spectrum。

第1步是選擇植物品種和部位。一方面，可根據(jù)文獻報道及傳統(tǒng)的應用經(jīng)驗，評估某種植物試驗數(shù)據(jù)的可靠性，選擇合適的物種和部位；另一方面，基于化學分類學研究，也就是說，某些植物類別含有特定類型的化合物或次級代謝物，因此與它們的分類相關(guān)的植物也可能含有相同的化合物或代謝物。選擇植物后，要收集和鑒定植物材料，即收集特定植物或其部分，如葉、莖、樹皮、花、種子或根，以供進一步分析[10]。

第2步是活性功能組分的提取。傳統(tǒng)溶劑萃取(CSE)主要包括液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)和固相微萃取(SPME)。CSE工藝雖然簡便易上手，但制備效率低，耗費大量有機溶劑，造成環(huán)境污染。近年來，超聲輔助萃取(UAE)、微波輔助萃取(MAE)、酶解輔助萃取(EAE)、加壓液體萃取(PLE)、亞臨界水萃取(SWE)、瞬時控制壓降萃取(DIC)、超臨界二氧化碳萃取(SCE)等新型綠色方法開始涌現(xiàn)[7]。

第3步是活性功能組分的分離純化。植物材料的粗提過程中會有多種雜質(zhì)同時被提取出來，因此，活性功能組分的分離純化十分有必要。傳統(tǒng)的分離純化方法主要是重結(jié)晶法、紙色譜(PC)、柱色譜(CC)和薄層色譜(TLC)。CC和TLC因其方便、經(jīng)濟，適用多種固定相而仍被廣泛使用。新型的分離方法有分子蒸餾(MD)、凝膠滲透色譜(GPC)、離子交換色譜(IEC)、大孔吸附樹脂色譜(MARC)、制備型高效液相色譜法(Pre-HPLC)、高速逆流色譜法(HSCCC)、超臨界流體色譜法(SFC)和分子印跡技術(shù)(MIT)等。表1總結(jié)了主要的新型綠色提取、分離純化工藝的原理、所需儀器設(shè)備和優(yōu)缺點。天然植物功能組分多樣且復雜，制備工藝也呈現(xiàn)出多樣化特征[22-23]。

表1 天然植物活性功能組分的主要新型制備工藝

第4步是活性功能組分的結(jié)構(gòu)解析。通常采用的手段包括薄層色譜、柱色譜、快速色譜、高效液相色譜-傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜-質(zhì)譜、液相色譜-質(zhì)譜、核磁共振光譜、HPLC-二極管陣列檢測、毛細管電泳-二極管陣列檢測、電噴霧等[24]。最后是設(shè)計體內(nèi)、體外試驗對活性功能組分進行生物學效果驗證。

所有這些過程中，活性功能組分提取和分離純化所用的時間占比最多，因此選擇合適的制備方法不僅關(guān)系到目標產(chǎn)物得率和純度，也關(guān)系到結(jié)構(gòu)解析的準確性，更關(guān)系到體內(nèi)、體外評價的可靠性?；谖墨I總結(jié)，圖2展示了飼用天然植物六大活性功能組分常用的制備方法，下文詳細介紹這些活性組分的提取和分離純化研究進展。

MAE：微波輔助萃取 microwave-assisted extraction；UAE：超聲輔助萃取 ultrasound-assisted extraction；EAE：酶解輔助萃取enzyme-assisted extraction；PLE：加壓液體萃取pressurized liquid extraction；SWE：亞臨界水萃取 subcritical water extraction；SCE：超臨界二氧化碳萃取supercritical CO2 extraction；DIC：瞬時控制壓降萃取instant controlled pressure-drop；MD：分子蒸餾molecular distillation；MARC：大孔吸附樹脂色譜 macroporous adsorption resin chromatography；GPC：凝膠滲透色譜 gel permeation chromatography；IEC：離子交換色譜 ion exchange chromatography；Pre-HPLC：制備型高效液相色譜 preparative high performance liquid chromatography；HSCCC：高速逆流色譜 high-speed counter-current chromatography；MIT：分子印跡技術(shù) molecular imprinting technique。實心圓圈表示常用方法 solid circles denote common methods。

2 不同植物活性功能組分制備方法研究進展

2.1 酚類化合物

酚類化合物是飼用天然植物功能組分中最大的一類，結(jié)構(gòu)及分子質(zhì)量豐富多變，在畜禽上被證明具有抗氧化、提高免疫力等功能，主要包括酚酸、黃酮、黃酮醇、二氫黃酮醇、異黃酮、香豆素、花青素和多酚等。表2列舉了國內(nèi)外部分關(guān)于酚類化合物制備方法研究中的植物來源、方法、優(yōu)化條件。眾多提取方法中，MAE和UAE的方法較為成熟，應用最廣，最具代表性[25]。Kumar等[26]報道，采用CSE、EAE和MAE提取大豆皮中的花青素，發(fā)現(xiàn)MAE優(yōu)化后的產(chǎn)量為5 094.9 mg/L，而CSE和EAE分別為(1 246.89±68.45)mg/L和(4 064.77±163.23)mg/L，可見微波輔助具有顯著優(yōu)勢。Goltz等[27]研究表明，與CSE相比，在優(yōu)化條件下，應用UAE使甘菊花中酚類物質(zhì)產(chǎn)量提高了6.1倍，抗氧化能力提高了3.4倍。因此，UAE可以提高酚類物質(zhì)的回收率并減少溶劑用量，降低成本，可以作為CSE的最佳替代方法之一。此外，植物基質(zhì)的酶解可以釋放結(jié)合的酚類物質(zhì)，果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉酶等被證明可以用于酚類物質(zhì)的提取[7]。

表2 酚類化合物的新型制備工藝

常用的酚類純化方法主要有MARC、超濾膜法和反相HPLC[28]。應用最多的是MARC，大孔樹脂是一種常用的有機高分子吸附劑，已廣泛應用于植物活性物質(zhì)的分離純化，特別是黃酮類化合物。樹脂的選擇應考慮其結(jié)構(gòu)和極性，如表面積、孔徑、極性較低的樹脂對極性低或非極性化合物有較強的吸附能量[29]。Zhang等[30]采用EAE提取紅松中的黃酮，然后用大孔樹脂進行純化，使黃酮的純度從33.8%提升到61.7%，進而體外試驗證明了純化產(chǎn)物具有較強的抗氧化性。另外，金屬絡(luò)合也非常適用黃酮類化合物的分離純化，利用黃酮和金屬離子形成黃酮-金屬離子絡(luò)合物。經(jīng)過濾，提取物中不能與金屬反應的雜質(zhì)被去除，然后，具有較強絡(luò)合能力的物質(zhì)與絡(luò)合物反應，捕獲黃酮-金屬離子絡(luò)合物中的金屬離子，并釋放出黃酮類成分，從而增加黃酮類化合物的含量。該方法簡單、高效，容易實現(xiàn)工業(yè)化。如Wang等[31]采用MAE結(jié)合膠束萃取了甘草中的黃酮，然后采用金屬絡(luò)合+反溶劑重結(jié)晶法純化，黃酮純度從36.47%提高到90.32%，且具有較強的2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基清除能力。

Pre-HPLC是經(jīng)典的分離純化手段，柱效高、分離重復性好，可進行紫外-質(zhì)譜在線檢測，因而被廣泛使用。Pre-HPLC可進一步分為一維(1D-RPLC)和二維(正相×反相，2D-NPLC/RPLC)，其中二維在分離復雜混合物上效率更高。研究較多還有HSCCC，它是一種無載體的全液體分配色譜系統(tǒng)。與硅膠、制備型反相HPLC等方法相比，具有樣品回收率高、耗時少、環(huán)保等特點[32]。因此它特別適用于從植物中分離純化高極性化合物(如多酚)。由于其優(yōu)越的分離能力和回收率，HSCCC在天然植物產(chǎn)物的制備中的應用正在穩(wěn)步增長[33]。例如，Shu等[32]首次采用HSCCC從芍藥花中分離了8種酚類化合物，且純度均高于97%。鑒于酚類化合物分布的廣泛性及其改善動物健康的重要性，大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)是發(fā)展趨勢，因此，探索低成本的Pre-HPLC和HSCCC將極大促進畜牧業(yè)對植物酚類物質(zhì)的利用。

2.2 生物堿

生物堿是存在于天然植物中的堿性含氮有機化合物，大多含有復雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。飼用上有研究的生物堿包括苦參堿、石松堿、血根堿，來源包括苦參根、石松、野百合、博落回等。傳統(tǒng)工藝提取生物堿普遍使用的有機溶劑有己烷、甲醇、乙醇等，通過這些溶劑萃取成功制備了生物堿，并證實了它們的許多特性，如制備后產(chǎn)物得抗膽堿酯酶、抗炎、抗菌、抗真菌和抗病毒活性等[42]。應用新方法SCE、PLE、MAE等提取生物堿[42-43]，縮短了提取時間，減少了溶劑消耗，提高了產(chǎn)物質(zhì)量。與有機溶劑相比，深共晶溶劑(DES)具有低毒和生物可降解等優(yōu)點，被證明是適合生物堿的新型高效萃取介質(zhì)[44]。Kang等[45]首次采用DES提取苦參根中的苦參堿，結(jié)果表明，DES-2(氯化膽堿∶丙二酸=1∶2，與50%水)和DES-8(氯化膽堿∶乙二醇=1∶2，與30%水)產(chǎn)物得率最高，達到21.04 mg/g。另外，多技術(shù)組合應用也是研究的熱點，如Zhang等[43]組合MAE與雙水相萃取(APTE)從苦參根中提取苦參堿；Tang等[46]組合MAE與濁點萃取，使用Triton X-100-NaCl-HCl制備體系提取野百合中生物堿，這些方法的優(yōu)化和組合使得生物堿得率更高。

生物堿的分離應用較多的是CC，研究方向主要集中在填料選擇，包括大孔樹脂、硅膠等。研究表明，吸附生物堿應選擇弱極性樹脂，以AB-8、D-101和HPD100應用最多，需要優(yōu)化上樣量、吸附溫度和樣品液濃度等[47]。但由于大孔樹脂質(zhì)量參差不齊，導致純化效果不穩(wěn)定，往往回收率很低，特別是含量低的生物堿容易損失。硅膠作為另一種常用的吸附劑也被不斷改進，質(zhì)量比大孔樹脂更穩(wěn)定，Azadbakht等[48]和Mishig等[49]采用硅膠分別作為TLC和快速柱色譜的填料成功分離了秋水仙和蒙古蕕的生物堿。除了常見的大孔樹脂和硅膠外，羥丙基葡聚糖凝膠填料(Sephadex-20 LH)作為新型填料也進入研究人員視線，它是以分子篩作用力為主、兼具分配作用機制、分離效率良好的填料，可在化合物分離后期使用。例如，Xiu等[50]采用乙醇粗提馬齒莧生物堿，然后運用正-反相硅膠柱色譜分離，再采用Sephadex-20 LH柱色譜進行分離得到了一種具有抗乙酰膽堿酯酶的新生物堿。表3列舉了采用新型工藝制備生物堿的研究。

表3 生物堿的新型制備工藝

2.3 揮發(fā)油

揮發(fā)油也被稱作精油，是具有揮發(fā)性芳香氣味的物質(zhì)，以萜類為主，包括單帖、倍半萜以及含氧衍生物。飼用上關(guān)注較多有牛至精油、大蒜精油、桉樹精油、沙蔥精油、艾葉精油、肉桂精油等。傳統(tǒng)的制備方法是水蒸餾法，但產(chǎn)量較低[58]。UAE、MAE和EAE的應用有效提高了揮發(fā)油萃取效率。目前研究最多的是SCE[59]，其不使用易爆或有毒溶劑，無毒性殘留物、產(chǎn)物得率高、芳香族化合物保留率較好，適合分離植物精油[60]。Wang等[60]應用優(yōu)化的SCE使莎草精油得率達到1.82%，是傳統(tǒng)提取方法的3倍多。但是，尹浩等[61]用3種方法酶輔助溶劑萃取法(4 h)、酶輔助水蒸氣蒸餾法(4 h)和SCE(30 min)提取油樟葉精油，結(jié)果顯示，SCE工藝效率雖高，但產(chǎn)物得率和抑菌活性均次于MAE和水蒸氣蒸餾法。這說明對于SCE的應用仍需要進一步驗證優(yōu)化。

揮發(fā)油組成較為復雜，直接采用色譜分離純化很難獲得單一成分。因此，揮發(fā)油一般需要經(jīng)過MD初步分離后，再進行色譜分離[62]。MD是新型的液蒸餾技術(shù)，適用熱敏性化合物的分離，可與SCE聯(lián)合用于揮發(fā)油等組分的提取分離[15]。隨后，可采用GS-MS對揮發(fā)油進一步分離鑒定。Marques等[20，63]用HSCCC分別從胡椒葉和紅葉果的水蒸餾產(chǎn)物中成功分離了4種和3種揮發(fā)油組分，純度均高于90%，用時低于2 h。進而，Wang等[64]建立了離線DPPH-GC-MS-HSCCC流程，先用DPPH和GC-MS篩選抗氧化活性強的溫郁金精油，后采用HSCCC進行分離，這是一套高效的精油篩選、鑒定和分離方法，具有分離分辨率高、檢測靈敏度高、結(jié)構(gòu)鑒定容易，目標化合物可以定向分離?？傊?，揮發(fā)油的提取、分離和純化界限往往并不明顯，SCE同時兼有提取和純化的能力，但SCE的維持成本較高，目前還處于實驗室小試階段，對于飼用天然植物揮發(fā)油的制備仍是巨大挑戰(zhàn)。表4列舉了采用新工藝的研究進展。

表4 揮發(fā)油的新型制備工藝

2.4 植物多糖

植物多糖是由多個單糖以糖苷鍵形式連接起來的大分子活性物質(zhì)。目前，沙蒿多糖、茯苓多糖、馬齒莧多糖、當歸多糖、黃芪多糖、苜蓿多糖、枸杞多糖等已在畜禽上開展了飼喂效果評價，證明植物多糖具備抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)機體免疫功能，可作為新型飼料添加劑[70]。植物多糖的研究較多，因而提取工藝也更成熟，應用最廣泛的方法是水提醇沉法，其利用多糖的羥基與水易形成氫鍵、而不易與醇類形成氫鍵的特點，加入乙醇即可使多糖沉淀，缺點是容易造成了有效成分的大量流失。另一種傳統(tǒng)的制備方法是熱水提取，但存在提取時間長、溫度高等缺點。Ying等[71]比較了3種方法即CSE、MAE和UAE提取桑葉多糖的效果，發(fā)現(xiàn)UAE優(yōu)化條件的得率較高，這表明了UAE在制備多糖上的優(yōu)勢。也有報道稱，MAE制備可能導致部分多糖降解，因此使用MAE時，微波功率和時間需要進一步優(yōu)化[72]。Dong等[73]則檢驗了MAE-UAE聯(lián)合提取方法，產(chǎn)物枸杞多糖的抗氧化活性比傳統(tǒng)方法更高，體現(xiàn)了方法組合的提取優(yōu)勢。但是，也有報道稱，EAE同樣可以用于植物多糖的提取，如Wang等[74]組合纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，優(yōu)化提取條件，使苜蓿多糖得率達到5.05%。但EAE很少單獨使用，通常與其他提取方法組合使用，以提高多糖的得率。

植物多糖的分離純化工藝相對簡單。粗多糖的提取液往往與蛋白質(zhì)、色素、無機小分子等雜質(zhì)混在一起，需要將這些雜質(zhì)去除，以免影響多糖的質(zhì)量和純度及后續(xù)結(jié)構(gòu)表征的可靠性。在眾多植物多糖的純化方法中，常用的是Sevag法、MARC、GPC和IEC等[75]。Sevag法利用氯仿-正丁醇溶液可以將游離蛋白變性成為不溶性物質(zhì)，從而過濾蛋白，是多糖制備除蛋白最有效的方法，應用最為普遍[17,76]。除蛋白之后，一般需要再經(jīng)CC進一步純化。種分離純化色譜柱組合使用可以取得更好的效果。Fan等[18]對藜麥種子多糖粗提物進行Sevag法除蛋白，然后使用離子交換柱DEAE-52 Cellulose洗脫，洗脫液裝載到凝膠柱Sephadex G-50，進一步純化得到7種多糖?；谖墨I總結(jié)，植物多糖分離純化常用的離子交換色譜柱包括DEAE-Cellulose、DEAE-Cellulose 52、DEAE-Sepharose CL-6B和DEAE-Sepharose FF等，凝膠滲透色譜柱有Sephadex G、Sephacryl S和Sepharose CL[77]。植物多糖分離純化方法簡單經(jīng)濟，但如何選擇最佳的色譜柱和純化條件優(yōu)化仍鮮有報道，針對種類繁多的飼用植物多糖，分離純化工藝的進一步優(yōu)化選擇是今后重點研究的方向。表5列舉了采用新工藝提取植物多糖的研究。

表5 植物多糖的新型制備工藝

2.5 苷類

苷類是糖或糖的衍生物與另一非糖物質(zhì)通過糖的端基碳原子連接而成的一類化合物，又被稱為配糖體。按化學結(jié)構(gòu)類型，可以分為香豆素苷、蒽醌苷、皂苷、黃酮苷等。飼用上關(guān)注度最高的是皂苷，其可調(diào)控反芻動物瘤胃發(fā)酵，抑制甲烷排放。除了MAE和UAE外，新型綠色溶劑DES也普遍用于苷類的制備，如Milani等[84]采用DES(氯化四甲銨+乙二醇)提取甜葉菊中的甜菊醇苷，輔以超聲萃取，試驗結(jié)果表明，UAE+DES提取的甜菊糖苷是傳統(tǒng)溶劑的3倍，該研究證明了UAE+DES在提取苷類化合物上的優(yōu)勢。目前，高速剪切均質(zhì)萃取(HSHE)和離子液體(IL)萃取是苷類制備工藝的研究熱點。高速剪切技術(shù)是一種新型的均質(zhì)粉碎技術(shù)，已用于多種天然植物活性物質(zhì)的制備。Xu等[85]使用59%乙醇作為溶劑，采用HSHE提取甜葉菊中制備甜菊糖苷，證明HSHE的制備效率比MAE和UAE更高，這也為苷類制備提出了一個新思路。IL具有不揮發(fā)或極低揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性好、溶解性強等特點，是新型的綠色溶劑。Ji等[86]研究證明，與傳統(tǒng)UAE相比，基于IL溶劑(1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽)的UAE(IL-UAE)對甘草微觀結(jié)構(gòu)的破壞更大，從而使得黃酮苷和三萜皂苷提取效率更高，且IL-UAE的提取時間短，液料比小。因此，IL作為綠色萃取溶劑在苷類萃取上具有廣闊的應用前景。

苷類的分離純化方面，國內(nèi)外應用最多的MARC、Pre-HPLC和HSCCC等。在提取苷類成分時，親水成分如糖和單寧常成為粗提物中的雜質(zhì)。弱極性大孔樹脂吸附雜質(zhì)后，雜質(zhì)容易被水洗脫，然后用不同乙醇洗下吸附的苷類，得到純度較高的目標化合物，此方法在皂苷的分離中十分常用。根據(jù)許多文獻中皂苷制備的大孔樹脂吸附和解析特性，證明AB-8和D101型吸附量大、易解析且重復性能好，是分離苷類化合物較為理想的樹脂類型[87]。但是，在分離粗提物中多聚體與苷類方面，CC還存在不足，而Pre-HPLC和HSCCC作為先進的分離技術(shù)可以有效地實現(xiàn)兩者分離。李媛媛等[88]采用HSCCC，從紅葡萄皮中分離出3種花色苷，純度均高于95%。另外，MARC也可聯(lián)合Pre-HPLC或HSCCC制備分離苷類。例如，Li等[89]制備荷葉青中的皂苷，先用D101樹脂純化，再用硅膠柱色譜洗脫，然后結(jié)合Pre-HPLC分離得到4種三萜皂苷。因此，優(yōu)化以MARC為代表的柱色譜與Pre-HPLC聯(lián)用，發(fā)揮各自特點，是苷類化合物高效提取的關(guān)鍵。表6列舉了苷類化合物的新型制備工藝。

表6 苷類的新型制備工藝

2.6 有機酸

有機酸是存在于天然植物中的具有羧基的一類有機化合物，如草酸、蘋果酸、苯甲酸、水楊酸、綠原酸、檸檬酸、富馬酸、阿魏酸、咖啡酸等。有機酸的酸性可以降低動物腸道pH，抑制有害菌，有利于腸道有益菌生長，從而促進養(yǎng)分消化吸收，也被視作替代抗生素的新型飼料添加劑[97]。相較于其他功能組分，有機酸的制備工藝受到的關(guān)注度較低。飼用上關(guān)注度較高的阿魏酸主要采用酶法提取，Lau等[98]采用阿魏酸酯酶(0.02 U/g)和木聚糖酶(3 475.3 U/g)提取玉米穗富含的阿魏酸，產(chǎn)物得率達到了1.69 g/kg，提取效率明顯提高。封易成等[99]聯(lián)合應用離子液體、酶解和超聲輔助(IL-EAE-UAE)并優(yōu)化條件提取山楂中檸檬酸，與水浸提法比較，2種方法提取到的檸檬酸含量接近，但前者提取時間是25.3 min，遠低于后者的4 h?？梢?，UAE與EAE組合運用可加強對植物細胞壁的破壞，釋放更多有機酸，兩者在協(xié)同萃取有機酸上具有明顯優(yōu)勢。

有機酸分離純化方面，以MARC、Pre-HPLC、HSCCC和pH區(qū)帶精制逆流色譜(pH-zone-refining CCC)等方法為主。胡居吾等[100]聯(lián)用大孔樹脂306與GPC，進而使用Pre-HPLC對蔓三七葉中的綠原酸和異綠原酸進行分離制備，兩者純度均達到96%以上，具有良好的自由基清除作用。HSCCC的制備工藝也在不斷得到優(yōu)化，如溶劑體系的改良。張偉等[101]將離子液體[C6min][PF6]作為HSCCC兩相溶劑體系的改良劑，分離制備金銀花提取物中的綠原酸，純度為97.5%。pH-zone-refining CCC是近年來在傳統(tǒng)逆流色譜上發(fā)展起來特殊逆流色譜分配技術(shù)，根據(jù)化合物的解離常數(shù)和疏水性質(zhì)差異而實現(xiàn)分離，上樣量是傳統(tǒng)HSCCC的十幾倍，且目標產(chǎn)物純度更高，非常適合生物堿和有機酸的制備[102]。Tang等[102]為制備分離麥麩中阿魏酸的2種立體異構(gòu)體，采用了兩步分離措施，先使用HSCCC(己烷-乙酸乙酯-甲醇-水=2∶5∶2∶4)，再運用pH-zone-refining CCC(己烷-乙酸乙酯-乙腈-水= 2∶5∶2∶2)得到反式-阿魏酸和順式-阿魏酸的純度分別為99%和98%，說明了pH-zone-refining CCC分離制備有機酸上的高純度優(yōu)勢。表7列舉了采用新工藝制備有機酸的研究進展。

表7 有機酸的新型制備工藝

3 植物活性功能組分制備研究存在的問題與展望

盧德勛[108]于2004年首次提出了飼料營養(yǎng)活性物質(zhì)組學理論，強調(diào)多種營養(yǎng)活性物質(zhì)組合和整體功能，產(chǎn)品應用應融入動物營養(yǎng)工程技術(shù)體系，這為活性功能組分產(chǎn)品研發(fā)提供了理論指導。當前，雖然涌現(xiàn)了以微波、超聲、酶、超臨界流體等為代表的新型輔助萃取手段，以及以柱色譜、Pre-HPLC和HSCCC等新型分離純化方法，但方法學研究也存在諸多問題。1)制備工藝的研究大多只關(guān)注某植物中的一種(類)活性功能組分，多種植物活性功能組分在動物體內(nèi)代謝可能產(chǎn)生協(xié)同效應提高生物活性和生物利用度，因此對于單一組分追求太高純度，則可能造成制備成本提高。2)制備工藝優(yōu)化的條件不一，即使同是MAE和UAE，但選擇的優(yōu)化參數(shù)不同，導致大量研究無法進行比較和歸納；研究結(jié)果更注重產(chǎn)物的得率，而對制備過程中植物活性功能組分的分子結(jié)構(gòu)損害程度缺乏關(guān)注，而這直接關(guān)系到制備后物質(zhì)的生物活性。3)研究文獻多基于實驗室規(guī)模，大量試驗數(shù)據(jù)是在小試條件下優(yōu)化的，優(yōu)化的工藝參數(shù)與工廠化差距大，甚至不適合工業(yè)化生產(chǎn)。

對此，適合畜禽生產(chǎn)的天然植物活性功能組分制備工藝體系亟待建立。1)應進一步優(yōu)化工藝，吸納各種組分制備的特點，建立并優(yōu)化同時提取多種組分的工藝，分離純化后要結(jié)合結(jié)構(gòu)解析和體外體內(nèi)試驗綜合評價多組分提取物的相互作用，確定適宜的純度，最大化地利用天然植物的價值。2)建立制備工藝優(yōu)化的標準體系，明確MAE、UAE、EAE、IL、SCE等獨立或聯(lián)合應用應優(yōu)化的條件，針對不同植物及不同目標化合物，建立一套優(yōu)化參數(shù)值的參考范圍。制備工藝研究不僅要關(guān)注產(chǎn)物的得率，也要注重植物材料的來源和標準化，采用光譜等檢測手段，評估產(chǎn)物的降解或結(jié)構(gòu)受損情況。3)以市場化為導向，聯(lián)合畜牧企業(yè)開展調(diào)研，可選定某一類植物或某一類活性功能組分作為突破口，建立適合工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量控制參數(shù)，廣泛開展中試試驗，降低制備成本。此外，組分制備應充分認識到產(chǎn)品融入飼用技術(shù)體系的必要性，考慮活性功能組分與飼糧營養(yǎng)成分的相互作用、動物不同生理階段、不同飼養(yǎng)決策目標和環(huán)境因素等，以使活性物質(zhì)在動物體內(nèi)達到精準營養(yǎng)效果。

4 小 結(jié)

天然植物是一個十分復雜的體系，從繁多的植物中提取和分離各種活性功能組分，是促進天然植物活性功能組分飼用化必須要解決的課題。本文總結(jié)了植物各活性功能組分的主要制備方法，重點介紹了具有飼用潛力的六大活性組分制備研究進展。未來，應重點推進綠色制備工藝優(yōu)化，加強方法的聯(lián)用，強調(diào)制備效率，提高目標化合物得率和純度。針對畜牧業(yè)特點，建立從植物篩選到組分制備，再到體內(nèi)、體外試驗，從實驗室研究到工廠化生產(chǎn)的研發(fā)流程，以不斷開發(fā)低成本、環(huán)境友好且利于動物生長和健康的植物活性功能組分產(chǎn)品。