陳春林，胡玲榕，楊 玲，童燕靈，胡望舒

西紅花苷快速抗抑郁作用及其調節(jié)mTOR-BDNF信號通路的研究

*陳春林，胡玲榕，楊 玲，童燕靈，胡望舒

（宜春學院化學與生物工程學院，江西，宜春 336000）

探討不同濃度西紅花苷（Crocin）的抗抑郁作用及可能機制。建立皮質酮（CORT）誘導的PC12細胞損傷模型；不同濃度（1、10、30 μmol/L）西紅花苷預處理細胞，CCK-8法檢測細胞活力，在熒光顯微鏡下觀察細胞突觸形態(tài)；Western Blot檢測細胞BDNF、mTOR蛋白的表達；體外研究中，將40只小鼠分成5組，灌胃生理鹽水、CRO10 mg/kg、CRO30 mg/kg、CRO100 mg/kg、氟西汀20 mg/kg后行強迫游泳和懸尾實驗，記錄其累積不動時間。實驗結果表明，西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞有保護作用，且能夠改善模型小鼠的抑郁樣行為，其機制可能與mTOR-BDNF通路密切相關。

抗抑郁；西紅花苷；皮質酮；BDNF；mTOR

抑郁癥(Depression)是一種常見的慢性精神疾病，主要表現(xiàn)為心情低落[1]、睡眠障礙、認知功能障礙，嚴重的患者可能會出現(xiàn)自殺等行為[2]。有研究表明，影響著世界21%人口的抑郁癥將成為第三大疾病[3]。單胺氧化酶抑制劑、5-羥色胺再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥等為目前臨床治療抑郁癥的一線藥物。但這些傳統(tǒng)的抗抑郁藥物作用率低、起效緩慢，不良反應多，不能及時緩解抑郁癥患者的痛苦。因此，使用具有抗抑郁作用且安全性較高的中藥已經成為治療抑郁癥的新療法[4]。

臨床藥物起效緩慢可能與海馬神經元再生及可塑性機制有關[5]，新蛋白質的合成是形成神經元突觸可塑性的關鍵。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路通過調節(jié)下游轉錄因子表達而促進突觸蛋白的合成，從而增加神經突觸的可塑性[6]。腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）是mTOR信號通路的重要調節(jié)因子，在促進神經元的生長發(fā)育，調節(jié)突觸的可塑性等方面發(fā)揮重要的作用。另有研究表明，西紅花苷能顯著增加亞急性抑郁模型大鼠海馬組織CREB、p-CREB、BDNF和VGF蛋白的表達，提高神經元的興奮性，從而起到抗抑郁的作用[7]。

西紅花苷（Crocin）是從中藥材梔子和西紅花中提取的主要活性成分之一[8]。大量的臨床研究表明西紅花苷的藥理作用，如抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、抗炎[11]、壯陽、保肝利膽及抗糖尿病等。另有研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷在中樞神經系統(tǒng)中具有抗焦慮[12]作用。隨機雙盲對照實驗表明，在治療輕中度抑郁癥方面，西紅花苷與丙咪嗪有相當的治療效果[13]。本實驗將探究西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞的保護作用，同時探討基于mTOR-BDNF信號通路的可能作用機制，其次通過建立小鼠急性抑郁模型，觀察其對抑郁樣小鼠行為學的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性ICR小鼠（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司）；PC12細胞（上海泰然生物科技有限公司）；西紅花苷（上海源葉生物技術有限公司）；皮質酮（阿拉丁生物科技公司）；DMEM培養(yǎng)基（1645799）、FBS胎牛血清（GIBCO公司）；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、牛血清蛋白（BSA）購自索萊寶生物科技公司；鹽酸氟西汀；β-actin抗體（Cell Signaling Technology）；mTOR抗體（Cell Signaling Technology公司）；BDNF抗體（Cell Signaling Technology公司）；廣譜蛋白Marker（北京索萊寶生物科技有限公司）；山羊抗鼠二抗（Jackson ImmunoResearch公司）；化學發(fā)光底物（Bridgen科技有限公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組

1.2.1 細胞培養(yǎng)

PC12細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是37℃、5%CO2。處于對數生長期的PC12細胞用于實驗。并按照不同組別的要求，對各組細胞進行不同的處理。

1.2.2 CORT損傷模型的建立

取對數生長期的PC12細胞接種于96孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁，每孔加入不同濃度皮質酮（50、100、200、300、400、500 μmol/L），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用CCK-8法測定細胞存活率，并確定皮質酮損傷PC12細胞的最適濃度以用于后續(xù)實驗。

實驗過程中每組設定6個復孔，平行實驗3次。細胞存活率（%）=（OD 實驗組- OD 調零組）/（OD 對照組- OD 調零組）×100%。

1.2.3 不同濃度西紅花苷對皮質酮損傷的細胞存活率的影響

取對數生長期的PC12細胞按照下列分組接種于96孔板中：①調零組：加入等量培養(yǎng)基。②空白對照組：細胞正常培養(yǎng)，不加任何處理因素。③皮質酮模型組：細胞貼壁后加入適當濃度的皮質酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h。④西紅花苷+皮質酮組：細胞貼壁后先加入不同濃度的西紅花苷（1、10、30 μmol/L）預處理1 h，再加入適當濃度的皮質酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 CCK-8法檢測細胞存活率

取對數生長期的PC12細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中，加入100 μL的細胞懸液，置于CO2培箱中培養(yǎng)；待細胞貼壁后吸棄舊培養(yǎng)基，加入不同濃度藥物預處理1 h，再加入適當濃度皮質酮繼續(xù)培養(yǎng)24 h；每孔加等量的CCK-8試劑，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1-4 h，用酶標儀450 nm波長測定其OD值。實驗中設定調零組、空白對照組、皮質酮模型組及藥物預處理組，每組設定6個復孔，平行實驗重復3次。計算公式為：細胞存活率（%）=（OD 實驗組-OD 調零組）/（OD 對照組-OD 調零組）×100%。

1.4 細胞突觸形態(tài)觀察

上述各組細胞接種于6孔板中，按“1.2.3”中的方法對各組細胞進行處理后，于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞突觸形態(tài)并拍照（×20）。神經元計數：每孔隨機選取5個視野，定義軸突長度大于細胞體者為陽性，取5個視野的平均數作為該組的實際細胞數。軸突長度的計算：測量每個神經元最長的軸突長度，并隨機測量30個神經元，計算軸突的平均長度。實驗重復3次。

1.5 Western Blot法檢測蛋白的表達

取對數生長期的PC12細胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿中，按“1.2.3”中的方法對各組細胞進行處理后，用預冷的PBS緩沖液沖洗3次，加入細胞裂解液后冰上裂解30 min，收集蛋白樣品于離心管中，12 000 r/min離心10 min；取上清液，采用Bradford法進行蛋白定量。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），進行抗原抗體反應，用 Alpha Fluor Chem 凝膠成像儀檢測化學發(fā)光并拍照保存，并用DRAFT-alpha view分析及圖像處理軟件對保存圖像中目的條帶進行灰度分析。

目的蛋白相對含量＝目的條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.6 動物分組及給藥

強迫游泳實驗和懸尾試驗各40只小鼠。小鼠適應性培養(yǎng)7 d后，將40只小鼠隨機分組：生理鹽水組、西紅花苷（10、30、100 mg/kg）組、氟西汀組（20 mg/kg），每組8只。各組均灌胃等量的藥物。

1.7 行為學實驗

1.7.1 小鼠強迫游泳實驗

正式實驗前一天小鼠預游泳15 min，第二天將小鼠置于實驗所在房間適應1 h，給予相應藥物30 min后進行6 min的游泳實驗，觀察小鼠強迫游泳不動時間。使用內徑為14 cm，高為20 cm的燒杯，水溫（23±2）℃，水深15 cm，以確保小鼠不能通過爪子或尾部觸及底部支撐身體。用相機觀察6 min，記錄后4 min內小鼠的累積不動時間（s）。“不動”是指小鼠在水中不掙扎或僅有微小的肢體運動以保持頭部伸出水面。

1.7.2 小鼠懸尾實驗

小鼠給予相應藥物30 min后，將其尾部2 cm處（距尾根3/4的部位）固定到掛鉤上，使小鼠處于倒懸狀態(tài)，用擋板隔開小鼠的視線，觀察6 min，記錄后4 min小鼠的累積不動時間（s）。

1.8 統(tǒng)計學處理

以上所有實驗數據用均數±標準差（mean±SEM）表示，采用Prism 5統(tǒng)計進行單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結果

2.1 皮質酮（CORT）損傷PC12細胞模型的建立

實驗結果如圖1所示，用不同濃度的皮質酮（50、100、200、300、400、500 μmol/L）處理PC12細胞24 h后，細胞存活率隨皮質酮濃度的增加而逐漸降低，并呈劑量依賴性。濃度為500 μmol/L的皮質酮對PC12細胞的損傷程度約為50%且比較穩(wěn)定。根據實驗結果采用500 μmol/L的皮質酮作用24 h建立PC12細胞損傷模型。

圖1 不同濃度皮質酮對PC12細胞存活率的影響（* P < 0.05, ***P < 0.001與對照組比較）

2.2 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞存活率的影響

實驗結果如圖2，與對照組相比，皮質酮模型組的細胞存活率明顯降低（< 0.001）。用不同濃度的西紅花苷預處理PC12細胞1 h，用500 μmol/L的皮質酮作用24 h，細胞存活率由皮質酮模型組的63.5%（< 0.001）上升為66.8%、79.9%、119.4%（< 0.001）。

圖2 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞存活率影響（###P<0.001，與對照組比較; ***P<0.001，與皮質酮模型組比較）

2.3 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞神經元突觸形態(tài)的影響

實驗結果如圖3所示，各組藥物與皮質酮損傷的PC12細胞共培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，皮質酮模型組細胞的軸突長度顯著降低（<0.001）；與皮質酮模型組相比，不同濃度的西紅花苷預處理組均能明顯增加神經元軸突長度。

2.4 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞中蛋白表達的影響

2.4.1 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞中BDNF蛋白表達的影響

與正常組相比，皮質酮處理24 h后，皮質酮模型組BDNF蛋白的表達明顯降低（<0.05）；與皮質酮模型組相比，不同濃度的西紅花苷組能提高損傷細胞中BDNF蛋白的表達，但沒有顯著性差異。實驗結果見圖4。

圖4 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞中BDNF蛋白表達的作用(#P< 0.05, 與對照組比較）

2.4.2 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞p-mTOR蛋白表達的影響

與正常組相比，皮質酮處理24 h后，皮質酮模型組p-mTOR蛋白的表達明顯降低（< 0.05），與皮質酮模型組相比，CRO1 μM組、CRO30 μM組能提高損傷細胞中p-mTOR蛋白的表達，但沒有顯著性差異。實驗結果見圖5。

圖5 西紅花苷對皮質酮損傷的PC12細胞中p-mTOR蛋白表達的作用(# P < 0.05, 與對照組比較）

2.5 西紅花苷對急性抑郁樣小鼠行為學的影響

2.5.1 對強迫游泳累積不動時間的影響

各組給予相應藥物30 min后，與生理鹽水組相比，西紅花苷10 mg/kg組、西紅花苷30 mg/kg組、西紅花苷100 mg/kg組、氟西汀20 mg/kg組均能明顯減少小鼠在強迫游泳中的累積不動時間（< 0.001）。實驗結果見圖6。

圖6 西紅花苷對小鼠強迫游泳累積不動時間的影響（***P < 0.001 與生理鹽水組比較）

2.5.2 對懸尾累積不動時間的影響

給予相應藥物后，與生理鹽水組相比，西紅花苷10 mg/kg組、西紅花苷30 mg/kg組、西紅花苷100 mg/kg組、氟西汀20 mg/kg組均能減少小鼠在懸尾中的累積不動時間。實驗結果見圖7。

圖7 西紅花苷對小鼠懸尾實驗中累積不動時間的影響

3 討論

抑郁癥是一種嚴重的全球性疾病，全世界的抑郁癥病人高達3.5億。由于傳統(tǒng)抗抑郁藥物的不良反應多且抑郁癥發(fā)病機制復雜，學者們開始深入研究中藥在抑郁癥方面的治療[14]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療抑郁癥的特點體現(xiàn)在其對多個靶點、多個信號通路、多個機制的調節(jié)作用[15]。柴胡皂苷能夠顯著提高抑郁模型大鼠腦內單胺類神經遞質的水平，減少神經元的損傷，從而改善抑郁癥[16]。另外，五乙酰梔子苷的抗抑郁作用機制可能是調節(jié)HPA（Hypothalamic-pituitary-gonadal，HPA）軸的功能，進而改善CUMS大鼠的抑郁樣癥狀[17]。本實驗將梔子中的主要效應成分西紅花苷作為快速抗抑郁作用的中藥分子進行進一步研究。

研究表明西紅花苷可以通過上調內源性PACAP的表達來激活ERK和CREB信號通路，進而增強突觸可塑性和提高神經元存活率[18]?？诜骷t花苷能夠改善腸道微生物群的結構和屏障功能，減少炎癥因子和增加BDNF蛋白表達，以緩解小鼠的抑郁樣行為[19]。PC12細胞是一種腎上腺髓質嗜鉻瘤細胞，現(xiàn)已廣泛用于神經藥理學研究。糖皮質激素（Glucocorticoids，GC）持續(xù)升高會損傷海馬神經元，導致機體神經內分泌系統(tǒng)紊亂，進而造成抑郁癥。本實驗采用皮質酮建立PC12細胞損傷模型，并發(fā)現(xiàn)其對細胞損傷呈濃度依賴性。500 μM皮質酮能顯著降低細胞存活率，因此選用此濃度作為后續(xù)實驗的造模濃度。結果顯示西紅花苷能顯著提高抑郁樣PC12細胞的存活率，這表明西紅花苷對皮質酮誘導損傷的PC12細胞的保護作用。

強迫游泳實驗和懸尾實驗是常見的模擬行為絕望實驗，用于初步篩選抗抑郁藥物[20]。根據實驗結果，CRO10 mg/kg，CRO30 mg/kg，CRO100 mg/kg組能明顯減少小鼠在強迫游泳實驗中的累積不動時間，上述結果表明了西紅花苷的抗抑郁作用。

研究表明，抑郁癥的發(fā)病機制和發(fā)病過程與BDNF有關，腦內BDNF含量的降低有可能導致抑郁癥的發(fā)生[19-20]。BDNF通過與其受體TrkB結合，激活一系列與抑郁癥相關的信號通路，進而調節(jié)神經元突觸的可塑性，進而促進神經元的生長發(fā)育。Vahdati等的研究結果顯示，西紅花苷能以劑量依賴性的方式提高亞急性抑郁模型大鼠腦內的BDNF蛋白水平。研究發(fā)現(xiàn)西紅花苷能在細胞水平上顯著激活PI3K/Akt通路，增加Akt、mTOR和p-p70S6K水平[20]。本實驗采用Western Blot法檢測PC12細胞中BDNF、mTOR等相關蛋白的表達。實驗結果顯示，不同濃度的西紅花苷均能提高皮質酮損傷的PC12細胞中相關蛋白的表達。

4 小結

本實驗結果表明，西紅花苷能夠減少皮質酮對PC12細胞的損傷，增加細胞中BDNF蛋白以及p-mTOR的表達。此外，灌胃不同濃度的西紅花苷，可以顯著改善小鼠在急性抑郁模型中強迫游泳的抑郁樣行為。但西紅花苷的抗抑郁作用具體的信號通路及機制還需要進一步研究。

[1] 李小平,劉文,姚昭,等.井岡山大學醫(yī)學生抑郁流行病學調查及影響因素分析[J].井岡山大學學報:自然科學版, 2018, 39(1):109-113.

[2] Klerman G L,Weissman M M.The changing epidemiology of depression[J].Clinical Chemistry,1988,34(5):807.

[3] Collins Pamela Y,Patel Vikram,Joestl Sarah S,et al.Grand challenges in global mental health[J]. Nature,2011,475:27-30.

[4] ALZ,ATX,ASW,etal.Curcuminproduces antidepressant effects via activating MAPK/ERK-dependentbrain-derived neurotrophic factor expression in the amygdala of mice[J].Behavioural Brain Research,2012,235(1):67-72.

[5] 孫奕,張志珺.海馬神經元再生及可塑性與抑郁癥[J].國際精神病學雜志,2007(3):144-147.

[6] 王金夢,楊玉,劉星玥,等.基于信號通路的中藥抗抑郁癥作用機制研究進展[J].中華中醫(yī)藥學刊,2021,39(1):115-118.

[7] F Vahdati Hassani,Naseri V,Razavi B,et al.Antidepressant effects of crocin and its effects on transcript and protein levels of CREB, BDNF, and VGF in rat hippocampus[J].Daru-journal of faculty of pharmacy,2014,22(1):16.

[8] 李萌,馬致潔,章從恩,等.西紅花對皮質酮誘導的PC12細胞損傷的保護作用研究[J].世界中醫(yī)藥,2019,14(4):833-838.

[9] Ochiai T,Shimeno H,Mishima K I,et al. Protective effects of carotenoids from saffron on neuronal injury in vitro and in vivo[J].Biochim Biophys Acta,2007,1770(4):578-584.

[10] Abdullaev F I,Espinosa-Aguirre J J.Biomedical properties of saffron and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials[J].Cancer Detection & Prevention,2004,28(6):426-432.

[11] Amin B,Nakhsaz A,Hosseinzadeh H.Evaluation of the antidepressant-like effects of acute and sub-acute administration of crocin and crocetin in mice[J].Avicenna Journal of Phytomedicine,2015,5(5):458-468.

[12] Dorri S A,Hosseinzadeh H,Abnous K,et al.Involvement of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) on malathion induced depressive-like behavior in subacute exposure and protective effects of crocin[J].Iranian Journal of Basic Medical Sciences,2015,18(10):958-966.

[13] Akhondzadeh S,Fallah-Pour H,Afkham K,et al.Comparison of Crocus sativus L.and imipramine in the treatment of mild to moderate depression:A pilot double-blind randomized trial [ISRCTN45683816][J]. Complementary and Alternative Medicine,2004,4:12.

[14] 許鵬,章程鵬,周童.中醫(yī)藥改善抑郁癥發(fā)病機制的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2021,27(9):244-250.

[15] Gill V, Laugharne J,Janca A. Complementary and alternative medicine in the treatment of anxiety and depression[J].Current Opinion in Psychiatry, 2008, 21(1):37-42.

[16] 戈宏焱,陳博,許丹,等.柴胡皂苷A對抑郁模型大鼠腦中單胺類神經遞質及其代謝產物含量的影響[J].高等學校化學學報,2008(8):1535-1538.

[17] Ge J F,Peng L,Cheng J Q,et al. Antidepressant-like effect of resveratrol:Involvement of antioxidant effect and peripheral regulation on HPA axis[J].Pharmacology Biochemistry&Behavior,2013, 114-115(Complete):64-69.

[18] Lu L,Wu D,Wang K,et al.Beneficial effects of crocin against depression via pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide[J]. BioMed Research International, 2020, 2020(53):1-10.

[19] Qx A,Rs A,Cw A,et al.Crocin-I alleviates the depression-like behaviors probably via modulating "microbiota-gut-brain"axis in mice exposed to chronic restraint stress[J].Journal of Affective Disorders,2020,276:476-486.

[20] 崔廣智.芍藥苷抗抑郁作用的實驗研究[J].現(xiàn)代藥物與臨床, 2009, 24(4):231-233..

RAPID ANTIDEPRESSANT EFFECT OF CROCIN BASED ON mTOR-BDNF SIGNALING PATHWAY

*CHEN Chun-lin, HU Ling-rong, YANG Ling, TONG Yan-ling, HU Wang-shu

（College of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000, China）

The objective was to investigate the antidepressant effect and the possible mechanism of crocin at different concentrations. The PC12 cell injury model was induced by corticosterone. The cells were pretreated with crocin at different concentrations (1, 10, 30 μmol/L), and the cell viability was detected by CCK-8 assay. The synaptic morphology of cells was observed under fluorescence microscope. The expression of BDNF and mTOR protein was detected by Western Blot. In thestudy, 40 mice were divided into 5 groups and given normal saline, Cro10 mg/kg, Cro30 mg/kg, Cro100 mg/kg, and fluoxetine 20 mg/kg, and performed with the forced swimming and tail suspension experiments, and the cumulative immobility time was recorded. The results showed that crocin had a protective effect on corticosterone-damaged PC12 cells and improved the depression-like behavior of model mice, the mechanism of which may be closely related to mTOR-BDNF pathway.

antidepressant; crocin; corticosterone; BDNF; mTOR

1674-8085（2022）03-0041-06

R285.5

A

10.3669/j.issn.1674-8085.2022.03.007

2021-05-10；

2022-01-16

國家自然科學基金項目(81560584)；江西省2020年大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(202010407011)

*陳春林(1984-)，男，江西贛州人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事神經藥理學研究(E-mail:chenchunlinycxy@163.com).