孫 青,陳丹丹,戴紅娟

（1.江蘇省泰州醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園區(qū)管理委員會(huì)，江蘇 泰州 225300；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；3.安若維他藥業(yè)泰州有限公司，江蘇 泰州 225300）

0 引言

美羅培南是廣譜非腸給藥的半合成碳青霉烯類抗生素,因其不僅對(duì)革蘭陽性和革蘭陰性菌均有較強(qiáng)的抗菌活性,而且對(duì)超廣譜β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定,在臨床多用于混合感染和嚴(yán)重感染的治療。美羅培南最常見的不良反應(yīng)是過敏反應(yīng),偶見過敏性休克；還可引起消化系統(tǒng)和皮膚系統(tǒng)等不良反應(yīng)[1]。

美羅培南聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生的影響尚無研究,現(xiàn)行版中國藥典也并未收載美羅培南聚合物雜質(zhì)檢測(cè)的方法[2]。因此,有必要建立有效檢測(cè)美羅培南中聚合物雜質(zhì)的方法,考察聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生的條件及穩(wěn)定性,以控制聚合物雜質(zhì)產(chǎn)生,有效降低不良反應(yīng)。

近年來,高效分子排阻色譜技術(shù)逐漸成熟[3-4]。本文使用TSK gel G2000SWxL凝膠色譜柱,建立高效分子排阻色譜系統(tǒng),測(cè)定美羅培南（見圖1）中的聚合物雜質(zhì),并考察聚合物雜質(zhì)的穩(wěn)定性。

圖1 美羅培南結(jié)構(gòu)式

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

實(shí)驗(yàn)儀器：Waters 2695高效液相色譜儀（沃特世公司）；2998 PDA 光電二極管矩陣檢測(cè)器（沃特世公司）；Seven Easy pH 儀（Mettler公司）；Mettler XS1O5DU型電子天平（Mettler公司）。

試藥：美羅培南對(duì)照品（由中國食品藥品檢定研究院提供,產(chǎn)品批號(hào)130506—202004,含量以美羅培南 C17H25N3O5S 計(jì)86.8%）；水為去離子水,乙腈為色譜純,三乙胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙酸銨均為分析純。

注射用美羅培南,山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào)321033003,規(guī)格0.5 g。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為TSK gel G2000SWXL凝膠色譜柱（7.8 mm×30.0 cm,5 μm）,流動(dòng)相0.1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)至中性）-乙腈（95∶5）；流速0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2 溶液的配制

精密稱取美羅培南對(duì)照品適量,加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含美羅培南1 mg的溶液,作為美羅培南對(duì)照品溶液,備用。

精密稱取注射用美羅培南樣品適量,加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含美羅培南1 mg的溶液,作為供試品溶液,備用。

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取2.2的溶液,采用Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器對(duì)上述1.0 mg/mL的對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,結(jié)果顯示,在220和280 nm波長(zhǎng)處主成分吸收較好。對(duì)比這兩個(gè)波長(zhǎng)發(fā)現(xiàn),在220 nm處聚合物雜質(zhì)峰吸收值更高,所以采用220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 空白及輔料

為排除溶劑對(duì)檢測(cè)的干擾,按2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,空白溶劑色譜圖基線平穩(wěn),不干擾美羅培南的聚合物雜質(zhì)測(cè)定。2.4.2 加速破壞試驗(yàn)

取2.2中的溶液,分別進(jìn)行強(qiáng)光破壞（強(qiáng)光照射試驗(yàn)24 h、照度為5 000 lx）、紫外線破壞（254 nm紫外照射3 h）、高溫破壞（60 ℃加熱1 h）、氧化破壞（加入0.3%過氧化氫溶液1 mL,室溫放置1 min）、酸破壞（加入0.1 mol/L鹽酸溶液1 mL,室溫放置1 min,用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液中和）、堿破壞（加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL,室溫放置1 min,用0.1 mol/L鹽酸溶液中和）,另一份不做任何破壞處理,作為對(duì)照,以上溶液按2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,記錄色譜圖（見圖2）。結(jié)果顯示,經(jīng)過6種劇烈條件的破壞處理后,對(duì)照品中聚合物雜質(zhì)含量均有不同程度的增加,幾種破壞條件均可使聚合物雜質(zhì)含量增加。聚合物雜質(zhì)含量由高到低依次為高溫破壞、酸破壞、紫外破壞、堿破壞、氧化破壞、強(qiáng)光破壞,經(jīng)破壞處理后的聚合物雜質(zhì)峰均能與美羅培南達(dá)到完全分離,表明該方法專屬性良好。

圖2 加速破壞試驗(yàn)色譜圖

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參考專屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,在高溫破壞條件下,有利于美羅培南聚合物雜質(zhì)的產(chǎn)生,同時(shí)對(duì)主峰檢測(cè)的影響較小,故本文采用高溫破壞（60 ℃加熱1 h）方法制備實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)適用性溶液。取2.2項(xiàng)下的溶液適量,60 ℃加熱1 h,按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,記錄色譜圖。主成分美羅培南的保留時(shí)間為14.101 min,理論板數(shù)以美羅培南計(jì)為19 944,聚合物雜質(zhì)峰1與聚合物雜質(zhì)峰2的分離度為4.2,聚合物雜質(zhì)峰2與美羅培南峰的分離度為7.7,均大于2.0,符合HPSEC系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的分離度要求。

2.6 美羅培南峰線性考察

精密稱取美羅培南對(duì)照品按美羅培南計(jì),適量加水溶解并逐步稀釋制成約含美羅培南1 976 μg/mL,988.0 μg/mL,494.0 μg/mL,197.6 μg/mL,98.80 μg/mL,49.40 μg/mL,19.76 μg/mL,9.880 μg/mL,1.976 μg/mL,0.988 μg/mL,0.494 μg/mL的對(duì)照品溶液。按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,以美羅培南溶液的濃度c為橫坐標(biāo)、 聚合物雜質(zhì)的峰面積A為縱坐標(biāo)繪制曲線,當(dāng)美羅培南溶液質(zhì)量濃度為0.000 5～2 mg/mL時(shí),得到線性方程y=24 139 387x+52 881,相關(guān)系數(shù)R是

0.999 99,線性關(guān)系良好。

2.7 聚合物雜質(zhì)峰線性考察

溶液配制同2.2,按2.1色譜條件進(jìn)樣,根據(jù)結(jié)果繪制曲線,橫坐標(biāo)為美羅培南的濃度,縱坐標(biāo)為聚合物雜質(zhì)峰面積總和。繪制散點(diǎn)圖后進(jìn)行線性曲線擬合,得到線性方程為y=157 009x-2 237.5（R=0.998）,表明美羅培南溶液質(zhì)量濃度為0.05～2 mg/mL時(shí)與聚合物雜質(zhì)峰面積之和線性關(guān)系良好。

2.8 定量限與檢測(cè)限

取2.7中的美羅培南對(duì)照品溶液,逐步稀釋,按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,結(jié)果顯示,測(cè)得的美羅培南的檢測(cè)限（S/N=3）為0.49 μg/mL,定量限（S/N=10）為1.47 μg/mL,靈敏度良好。

2.9 進(jìn)樣精密度試驗(yàn)

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液,按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,連續(xù)進(jìn)10針,測(cè)定美羅培南峰面積,對(duì)照品中美羅培南峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.4%,進(jìn)樣精密度良好。

2.10 耐用性考察

2.10.1 流速的影響

分別設(shè)置流速為0.6 mL/min,0.8 mL/min,1.0 mL/min,按2.1色譜條件分析2.3中的系統(tǒng)適用性溶液,結(jié)果顯示,在0.6～1.0 mL/min流速條件下,聚合物雜質(zhì)峰均能與美羅培南峰有效分離,理論塔板數(shù)良好?？紤]主成分峰的保留時(shí)間,最終選擇流速為0.8 mL/min。

2.10.2 柱溫的影響

分別設(shè)置柱溫為20 ℃,25 ℃,30 ℃,結(jié)果柱溫在（25±5）℃范圍內(nèi)均檢測(cè)出兩個(gè)聚合物雜質(zhì)峰,且分離效果較好,方法耐用性較好。2.10.3 對(duì)照品穩(wěn)定性考察

取新鮮配制的對(duì)照品溶液,在室溫（約24 ℃）下放置24 h,按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,選取0 h,1 h,2 h,4 h,6 h,8 h,10 h,12 h,24 h時(shí)進(jìn)樣分析。結(jié)果表明：美羅培南主成分在室溫下放置一段時(shí)間,峰面積變化不明顯,RSD為1.2%；但美羅培南聚合物雜質(zhì)峰面積增加顯著,室溫放置24 h內(nèi),聚合物雜質(zhì)峰面積逐漸增加,24 h后為0 h的14倍。由結(jié)果可見,美羅培南水溶液不穩(wěn)定,極易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì),為了保證檢測(cè)的可靠性,避免操作導(dǎo)致的誤差,溶液必須現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.11 樣品聚合物的測(cè)定

取注射用美羅培南（山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào)321033003）,按照2.1色譜條件進(jìn)行液相分析,記錄色譜圖。采用美羅培南自身對(duì)照外標(biāo)法計(jì)算聚合物峰含量,美羅培南前的峰均為聚合物峰,該批注射用美羅培南聚合物含量為0.33%,參照2015年版中國藥典,該值符合一般注射用β-內(nèi)酰胺類抗生素的聚合物限度要求。

3 討論

3.1 測(cè)定方法的選擇

藥典中記載的檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素中高分子雜質(zhì)的方法多為以葡聚糖G-10為填料的凝膠色譜法,該色譜柱存在柱效低、主峰和高分子雜質(zhì)峰不能有效分離、分析時(shí)間較長(zhǎng),且不能使用有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)[3-5]。本文建立以TSK gel G2000SWXL為色譜柱的高效分子排阻色譜法對(duì)美羅培南中的聚合物雜質(zhì)進(jìn)行分析,TSK gel G2000SWXL凝膠色譜柱填料主要為球狀親水改性硅膠,是一種新型分子排阻色譜柱,可分離相對(duì)分子質(zhì)量500～15 000的高分子雜質(zhì),聚合物雜質(zhì)主要在主峰前洗脫[4]。

由于聚合物雜質(zhì)對(duì)照品難以獲得,參考中國藥典2020年版頭孢米諾鈉有關(guān)物質(zhì)Ⅱ的檢測(cè),結(jié)合本實(shí)驗(yàn)對(duì)美羅培南主峰線性考察結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)采用的是自身對(duì)照外標(biāo)法來計(jì)算聚合物雜質(zhì)含量。因注射用美羅培南樣品較難獲得,本文沒有對(duì)更多廠家的樣品進(jìn)行聚合物含量的測(cè)定。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,作者分別以0.1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)至中性）-乙腈（95∶5）、磷酸鹽緩沖液（pH 7.0） -乙腈（95∶5）、0.01 mol/L乙酸銨溶液（冰醋酸調(diào)至中性）-乙腈（95∶5）為流動(dòng)相進(jìn)行液相分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以0.1%三乙胺溶液-乙腈（95∶5）為流動(dòng)相時(shí),美羅培南主峰前可分離出兩個(gè)雜質(zhì)峰,主峰與各高分子雜質(zhì)峰的分離度最好,故本文采用0.1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)至中性）-乙腈（95∶5）為流動(dòng)相。

3.3 美羅培南穩(wěn)定性的考察

本文建立一種有效的色譜系統(tǒng)測(cè)定美羅培南中的聚合物雜質(zhì)含量,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。由2.5可知,美羅培南易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì),在254 nm紫外光照射24 h后,美羅培南主成分峰幾乎全部被破壞,產(chǎn)生大量的聚合物雜質(zhì),因此美羅培南在儲(chǔ)存、運(yùn)輸及使用過程中應(yīng)盡量避免紫外光的照射,除紫外光外,美羅培南在堿性、高溫及酸性條件下也容易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì)。由2.10.3可知,美羅培南的水溶液在室溫條件下極易產(chǎn)生聚合物雜質(zhì),放置24 h后,聚合物雜質(zhì)峰面積增長(zhǎng)約14倍,因此,注射用美羅培南生產(chǎn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制配液、除菌過濾、制劑灌裝的工序時(shí)間。醫(yī)療機(jī)構(gòu)使用美羅培南時(shí)應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用,從而減少美羅培南聚合物雜質(zhì)的產(chǎn)生,降低不良反應(yīng)發(fā)生率,提升藥品質(zhì)量,保障人民群眾用藥安全。