鄒 云,孫 康,陳 芳

（1.宣城市食品藥品檢驗中心，安徽 宣城 242000；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，江蘇 南京 210042；3.寧國市食品藥品檢驗所，安徽 寧國 242300）

0 引言

活性炭（供注射用）標準收載于《中國藥典》2020年版四部,是2015版時新收載的藥用輔料[1],較之前用于注射劑的木質(zhì)活性炭標準顯著提高,其中對微生物有明確的限度要求,具體檢驗方法應(yīng)按藥典要求進行方法適用性試驗,但因活性炭外觀顏色、理化特性比較特殊[2],在全面考慮試驗的同時要強調(diào)注意事項,因為關(guān)鍵點直接影響方法運行的可行性。

1 材料與試劑

1.1 活性炭（供注射用）樣品

寧國市恒達活性炭有限公司,批號為20201104（記為樣Ⅰ）、批號為20201105（記為樣Ⅱ）、批號為20201104（記為樣Ⅲ）活性炭（供注射用）樣品采用干熱滅菌工藝生產(chǎn),國內(nèi)首創(chuàng),活性炭（供注射用）產(chǎn)品研發(fā)項目列入2020年度安徽省重點研究與開發(fā)計劃長三角科技創(chuàng)新聯(lián)合攻關(guān)專項。樣品為黑色粉末,粉碎度61～75 μm（200～240目）占80%以上,依據(jù)《〈中國藥典＞2020年版四部》質(zhì)量標準檢驗[1]。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基（以上培養(yǎng)基生產(chǎn)廠家均為北京三藥科技開發(fā)有限公司）、氯化三苯基四氮唑（TTC,紅四氮唑,羅恩試劑）。

1.3 菌種

大腸埃希菌（Escherichiacoli）[CMCC（B）44 102]；乙型副傷寒沙門菌（SalmonellaparatyphiB）[CMCC（B）50 094]；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]；銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）[CMCC（B）10 104]；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）[CMCC（B）63 501]；黑曲霉（Aspergillusniger）[CMCC（F）98 003]；白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC（F）98 001],以上菌種均來自北京三藥科技開發(fā)有限公司,中國食品藥品檢定研究院監(jiān)制。

1.4 儀器

恒溫培養(yǎng)箱和Ⅱ級生物安全柜。

2 試驗環(huán)境

該方法適用性試驗在環(huán)境潔凈度D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。試驗全過程嚴格遵守?zé)o菌操作,防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境已定期按醫(yī)藥工藝潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證合格[3-4]。

3 菌液制備

按藥典操作制成不大于100 cfu/mL的大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉和白色念珠菌的菌懸液。

4 微生物計數(shù)方法適用性試驗

根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性,采取適宜的方法制備供試液。取供試品10 g,用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL溶解或稀釋制成1∶10供試液。但因樣品外觀顏色等特殊性,稀釋后的樣品溶液顯墨汁樣深黑色,平皿法培養(yǎng)后進行微生物計數(shù)時,不利于需氧菌、霉菌和酵母菌菌落的觀察、識別和計數(shù)。先后經(jīng)多次試驗：（1）1∶10供試液取1 mL每皿試驗時因活性炭顏色太深試驗組無法計數(shù)。（2）1∶10供試液取0.5 mL每皿試驗時也因活性炭顏色太深試驗組菌落無法計數(shù)。（3）采用薄膜過濾法,因1∶10供試液中活性炭顆粒過大,無法通過濾膜被截留,此方法不可行。（4）采用低速離心（500 r/min,離心5 min）法,雖然將1∶10供試液中的活性炭固體物質(zhì)分離,但除黑曲霉外的4種菌回收率均達不到,考慮活性炭吸附力較強所致,此法不可行。（5）采用1∶10供試液取0.2 mL每皿試驗,結(jié)果各菌回收率達到要求,且便于觀察計數(shù),此具體試驗過程及數(shù)據(jù)如下。

4.1 供試液的制備

取供試品10 g,加入100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,搖勻,使分散均勻,制成1∶10供試液[5]。

4.2 接種和稀釋

4.2.1 試驗組取上述制備好的1∶10供試液0.2 mL共10份,分別置10個直徑90 mm的無菌平皿中,每皿分別加入上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液1 mL,再分別注入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂（含0.001%TTC）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,倒置培養(yǎng)。為了保證科學(xué)準確,先加的5皿菌落平均值為1份,后加的5皿菌落平均值為平行制備的第2份,每種菌均按上述方法試驗。

4.2.2 供試品對照組取制備好的供試液,以稀釋液代替菌液,同試驗組操作。

4.2.3 菌液對照組取上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液1 mL,置直徑90 mm的無菌平皿中,注入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂（含0.001%TTC）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,混勻,凝固,倒置培養(yǎng)。每個菌種平行制備2平皿,按規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。

4.3 回收率試驗數(shù)據(jù)與結(jié)果

樣Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ的測量數(shù)據(jù)分別如表1—3所示。

表1 樣Ⅰ測量數(shù)據(jù)

表2 樣Ⅱ測量數(shù)據(jù)

表3 樣Ⅲ測量數(shù)據(jù)

4.4 結(jié)果判斷

試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)；從表1,2和3可知,若各試驗菌的回收試驗均符合要求,對照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù),上述試驗比值均符合要求。

5 控制菌檢查方法適用性試驗

5.1 大腸埃希菌

5.1.1 供試液制備

同上述4.1制備的1∶10供試液。

5.1.2 試驗菌大腸埃希菌[上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液]。

5.1.3 操作方法

取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基4份,每份100 mL,第1份加入1∶10供試液10 mL,第2份加入1∶10供試液10 mL及不大于100 cfu的大腸埃希菌液（1 mL）,第3份加入不大于100 cfu的大腸埃希菌液（1 mL）,第4份加入與供試品溶液等量的稀釋劑10 mL。上述4份同置35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,各取1 mL,接種至100 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中,43 ℃培養(yǎng)24 h。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,35 ℃培養(yǎng)18 h,看平板菌落生長情況（見表4）。

表4 大腸埃希菌檢查方法適用性試驗(麥康凱瓊脂培養(yǎng)基)

5.1.4 結(jié)果判斷從表4可以看出,加入菌液的供試液均檢出試驗菌,說明供試品對大腸埃希菌無明顯抗菌作用,該控制菌檢驗方法的專屬性好,方法可行。

5.2 沙門菌

5.2.1 試驗菌乙型副傷寒沙門菌[上述制備好的不大于100 cfu/mL菌液]。

5.2.2 操作方法

取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基4份,每份100 mL,第1份加入供試品10 g,第2份加入供試品10 g及不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌液（1 mL）,第3份加入不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌液（1 mL）,第4份作為空白對照。將上述4份同置35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后,各取0.1 mL,分別接種至10 mL RV沙門增菌液體培養(yǎng)基中,35 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后,取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物分別劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,35 ℃培養(yǎng)18 h,看平板菌體生長情況。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)18 h,查看培養(yǎng)結(jié)果（見表5）。

表5 沙門菌檢查方法適用性試驗

5.2.3 結(jié)果判斷從表5可以看出,加入菌液的供試液均檢出試驗菌,說明供試品對沙門菌無明顯抗菌作用,該控制菌檢驗方法的專屬性好,方法可行。

6 結(jié)語

活性炭（供注射用）微生物限度檢查中：微生物計數(shù)法（需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的檢查）采用培養(yǎng)基稀釋法,即稱取供試品10 g,加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL,混勻,作為1∶10的供試液。取1∶10供試液按0.2毫升每皿進行注皿試驗（5皿合計為1 mL計數(shù)）；控制菌檢查用常規(guī)法,大腸埃希菌檢查取1∶10供試液10 mL加至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)后按規(guī)定試驗；沙門菌檢查稱取10 g供試品加至100 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中進行增菌培養(yǎng)后按規(guī)定試驗。

因活性炭（供注射用）樣品為黑色,影響菌落觀察計數(shù),使用的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基需加TTC使含0.001%TTC,以便菌落顯色觀察計數(shù)；含供試液的平皿注入培養(yǎng)基后要格外注意手動慢搖,使供試液充分分散并與培養(yǎng)基混合均勻。