高夢茹, 韓 婧, 馬 鑫,

(江南大學1. 藥學院、2. 醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122)

隨著人們生活方式現(xiàn)代化、膳食結(jié)構(gòu)改變以及缺少鍛煉等因素影響，肥胖已經(jīng)成為世界性的公共健康問題。肥胖癥是一種慢性代謝性疾病，多數(shù)研究表明肥胖會引發(fā)氧化應(yīng)激[1]。以往的研究表明，氧化應(yīng)激常與內(nèi)皮功能紊亂相關(guān)，其特點是過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生，導致一氧化氮生物利用度的降低，引發(fā)內(nèi)皮細胞收縮因子增加，進而引發(fā)血管舒張功能障礙[2]。瞬時受體電位4型(transient receptor potential vanilloid type 4，TRPV4)是一種選擇性的陽離子通道，可被多種因素激活，如溫度、機械力、化學激動劑等[3]。最近，越來越多的證據(jù)表明，TRPV4在調(diào)節(jié)ROS產(chǎn)生和血管擴張中起著重要作用[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯氧化酶2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，Nox2)，已被證明是ROS產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)器[5]，其他研究表明，Nox2在血管舒張功能中起著重要的調(diào)節(jié)作用[6]。TRPV4和Nox2均參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和血管舒張反應(yīng)，以往的研究也證明，TRPV4-Nox2能夠形成復合物起作用[7]，然而，探索TRPV4-Nox2復合體對肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激和血管舒張功能影響的研究較少，因而開展了本研究，擬探討減弱TRPV4-Nox2的耦聯(lián)狀態(tài)是否能幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激和血管舒張障礙，隨后以TRPV4-Nox2復合體為靶點進行藥物篩選，擬尋找一種副作用更小靶向性更高的藥物，為肥胖相關(guān)并發(fā)癥的治療提供新思路和新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 4周齡SPF級雄性C57 BL/6J小鼠(上海斯萊克公司)，飼養(yǎng)于江南大學醫(yī)學院實驗動物中心(倫理號：JN.No 20200515c0501230[061])，于無菌、通風良好的環(huán)境進行12 h晝夜交替飼養(yǎng)，小鼠飼養(yǎng)溫度在18 ℃～25 ℃，相對濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始正式實驗。

1.1.2藥品與試劑 CM-H2DCFDA染料購自美國Invitrogen公司(貨號C6827)，恩曲替尼(Entrectinib)購自美國阿拉丁公司(貨號E302199-100 mg)，佛波酯(PMA)購買自美國sigma-aldrich公司(貨號P1585)，GSK1016790A購買自美國sigma-aldrich公司(貨號G0798)TRPV4抗體購買自Alomone公司(貨號sc-130543)，Nox2抗體購買自Santa-Cruz Biotech公司(貨號ACC-034)，F(xiàn)luo-4 AM購自美國Invitrogen公司(貨號F14201)，腺相關(guān)病毒購自和元生物有限公司(Flt1為內(nèi)皮細胞的啟動子，幫助腺相關(guān)病毒靶向內(nèi)皮細胞表達)。

1.1.3儀器 Wire myograph 620 M(丹麥DMT公司)，激光共聚焦(德國蔡司公司)，凝膠成像儀(美國伯樂公司)

1.2 方法

1.2.1模型建立及實驗分組 將C57 BL/6J與敲除小鼠在檢疫間隔離1周，隨后隨機將這些小鼠分成兩組，放入飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。飼養(yǎng)期間，一組小鼠喂正常飲食(含有25%脂肪)，另外一組小鼠喂食高脂飲食(含有45%脂肪)，期間每周定時監(jiān)測小鼠體重，14周后，HFD組小鼠體重增長未超過ND組體重20%的小鼠排除，其余進行TC、LDL、HDL檢測，TC，LDL有明顯增加，HDL明顯減少說明肥胖模型造模成功，否則排除。腺相關(guān)病毒小鼠模型構(gòu)建，取ND小鼠、HFD小鼠、TRPV4 KO-HFD小鼠，隨機分組，每組10只，實驗組(Nox2 △3)：使用尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注射AAV-Flt1 Nox2 △3病毒，用以減弱TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度；對照組(Vector)：使用尾靜脈注射的方式向小鼠體內(nèi)注射載體病毒。注射濃度根據(jù)試劑說明書確定，注射后21 d，取主動脈進行免疫熒光觀察，共聚焦顯微鏡552 nm激發(fā)光能觀察到內(nèi)皮細胞有明顯紅光，說明造模成功，否則排除。

1.2.2原代主動脈內(nèi)皮細胞分離與培養(yǎng) 取對照組與肥胖模型組小鼠，使用二氧化碳對小鼠進行安樂死處理。打開胸腔，快速分下主動脈，使用無菌PBS清洗后，剪碎置于含胰酶(2 g·L-1)的PBS中，37 ℃水浴消化25 min，1 200～3 000 r·min-1離心5 min。收取沉淀，使用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基重懸種于6孔板中，2 h后更換培養(yǎng)基，此后5代內(nèi)可用于實驗。

1.2.3血管張力試驗 取小鼠的主動脈血管，分割為2 mm長度的小段，裝載到肌張力儀器的槽中，進行平衡和復蘇處理，隨后進行曲線記錄，待張力曲線穩(wěn)定后，加入1 μmol·L-1的去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)預收縮血管，隨后以濃度梯度的方式，加入乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)并觀察血管張力的變化。收集并處理數(shù)據(jù)，即可得到對照組與肥胖模型組小鼠的血管張力情況。

1.2.4免疫共振能量轉(zhuǎn)移實驗 細胞種于玻片上，待長至80%密度，固定30 min，通透10 min，隨后使用含有1% BSA的PBS對細胞進行封閉。30 min后加入配置好的TRPV4與Nox2一抗，4 ℃過夜，隨后室溫孵育熒光二抗2 h。染色完成后，使用共聚焦顯微鏡進行代表圖與FRET信號的采集。

1.2.5免疫共沉淀 冰上提取蛋白，向上清加入1/10體積Protein A+G瓊脂糖珠，在4 ℃下垂直旋轉(zhuǎn)混合30 min，去除非特異性結(jié)合蛋白。4 ℃，400g離心5 min，收集上清，使用BCA法測定蛋白濃度，稀釋蛋白至濃度相同后，根據(jù)抗體說明書，向裂解液中加入相應(yīng)抗體，隨后4 ℃，垂直旋轉(zhuǎn)過夜混合。d2，向混合液中加入抗體量10倍體積的Protein A+G瓊脂糖珠，隨后繼續(xù)在4 ℃的條件下，使用垂直旋轉(zhuǎn)儀混合3 h。4 ℃，400g離心5 min，收集沉淀，使用PBS清洗3次后加入50 μL的2 × SDS loading buffer。渦旋混勻，煮沸樣品10 min，使用免疫印跡技術(shù)檢測上清蛋白樣品。

1.2.6ROS檢測 分離原代主動脈內(nèi)皮細胞，等待細胞生長到80%密度后，將之種入共聚焦小皿。等待細胞生長，待形態(tài)展開后，使用NPSS清洗，隨后在避光的條件下染色15 min。運用共聚焦顯微鏡采集圖像，采集時，共聚焦激發(fā)波長設(shè)置成488 nm。拍攝完成后，使用共聚焦顯微鏡分析軟件分析熒光強度，使用對照組的熒光強度進行歸一化處理，即可獲到處理組ROS的相對含量。

1.2.7細胞內(nèi)Ca2+檢測 向HEK-293細胞中轉(zhuǎn)染TRPV4質(zhì)粒，24 h后，使用恩曲替尼(10 μmol·L-1)預孵育30 min，NPSS清洗，隨后將5 μmol·L-1Fluo-4 染料與細胞共孵育30 min，清洗細胞去除多余染料，隨后使用激光共聚焦顯微鏡以488 nm激發(fā)光進行信號收集，前30 s為基礎(chǔ)信號，30 s后加入TRPV4通道激動劑GSK-1016790A(10 nmol·L-1)激活TRPV4通道，觀察鈣信號變化。

1.2.8Western blot實驗 準備SDS-PAGE膠，向小孔中加樣品，加樣完成后，在恒壓條件下，首先使用70 V的電壓進行電泳30 min，隨后換成120 V電壓，電泳1～2 h。100 V，80 min進行轉(zhuǎn)膜，隨后，加入5% BSA進行封閉。1 h后，4 ℃孵育一抗過夜，接著室溫孵育二抗1 h，使用ECL顯色液進行顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)進行代表圖采集。

2 結(jié)果

2.1 肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激、血管舒張功能障礙，并增加TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度如Fig 1所示，與ND組相比，HFD組主動脈內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生增加(P<0.05，F(xiàn)ig 1A-B)。HFD組主動脈舒張與ND組相比，舒張功能減弱，最大舒張率明顯減少(P<0.05，F(xiàn)ig 1C-D)。通過FRET實驗，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，HFD組TRPV4-Nox2復合體之間的物理相互作用強度明顯增強(P<0.05，F(xiàn)ig 1E-F)。上述結(jié)果提示肥胖引發(fā)的TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度增加，或許是肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激、血管舒張功能障礙的原因。

Fig 1 Obesity induced oxidative stress, vasodilatory dysfunction and enhanced physical association of TRPV4-Nox2 complex

2.2 減弱TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度可改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙定點突變和免疫共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果顯示：Nox2上145-152號位的7個氨基酸是TRPV4和Nox2相互作用的關(guān)鍵結(jié)合位點(P<0.05，F(xiàn)ig 2A)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的腺相關(guān)病毒(AAV-Flt1-Nox2 △3)可明顯減弱HFD組TRPV4與Nox2之間的物理相互作用(P<0.05，F(xiàn)ig 2B)；TRPV4 KO-HFD組小鼠，由于不存在TRPV4蛋白，該腺相關(guān)病毒不影響TRPV4-Nox2復合體物理耦聯(lián)(Fig 2C)。CM-H2DCFDA染色結(jié)果表明：在肥胖小鼠中減弱TRPV4-Nox2之間的物理相互作用，明顯減少了肥胖小鼠內(nèi)皮細胞中的ROS產(chǎn)生(P<0.05,Fig 2D)。血管張力實驗結(jié)果表明：在肥胖小鼠中減弱TRPV4-Nox2之間的物理相互作用，可增加肥胖小鼠主動脈血管對ACh的響應(yīng)，增加最大舒張率(P<0.05,Fig 2E)；而在敲除鼠中，上述改變不存在(Fig 2F和G)。這些結(jié)果提示減弱TRPV4-Nox2復合體物理相互作用強度，可幫助減輕肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激并恢復血管舒張功能障礙。

Fig 2 Decreasing association between TRPV4 and Nox2 improved obesity-induced oxidative stress and vasodilatory dysfunction

2.3 恩曲替尼不影響TRPV4和Nox2的表達與功能，僅減弱TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度之前的研究發(fā)現(xiàn)恩曲替尼是一種可降低TRPV4-Nox2復合體耦聯(lián)強度的藥物[8]，此處免疫共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果再次證明這一結(jié)論：與HFD組相比，恩曲替尼明顯減弱TRPV4-Nox2復合體物理相互作用(P<0.05,Fig 3A)。隨后，通過Western blot實驗，確認恩曲替尼不影響TRPV4和Nox2的表達(Fig 3B和D)。在HEK-293細胞中轉(zhuǎn)染Nox2進行CM-H2DCFDA染色實驗，使用佛波酯(PMA)作為Nox2激動劑，結(jié)果表明：Nox2激活明顯增加ROS產(chǎn)生，而使用恩曲替尼(10 μmol·L-1，30 min)處理不影響Nox2介導的ROS產(chǎn)生，表明恩曲替尼不影響Nox2功能(Fig 3C)。使用轉(zhuǎn)染TRPV4的HEK 293進行鈣內(nèi)流實驗，使用GSK-1016790A作為TRPV4激動劑，結(jié)果表明，恩曲替尼不影響TRPV4介導的鈣內(nèi)流，表明恩曲替尼不影響TRPV4功能(Fig 3E)。上述結(jié)果提示恩曲替尼針對肥胖產(chǎn)生的作用，是由減弱耦聯(lián)引起，而非改變了TRPV4和Nox2的表達和功能。

Fig 3 Entrectinib did not affect TRPV4 and Nox2 expression and function, but only decreased

2.4 恩曲替尼可改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙CM-H2DCFDA染色結(jié)果表明：與HFD組相比，使用恩曲替尼預孵育明顯減少了肥胖小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的ROS產(chǎn)生(*P<0.05，F(xiàn)ig 4A)；血管張力實驗表明：恩曲替尼(10 μmol·L-1，30 min)預孵育后，明顯增強主動脈血管對ACh的響應(yīng)，增加了最大舒張率(P<0.05，F(xiàn)ig 4B)。上述結(jié)果提示恩曲替尼可幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激及血管舒張功能障礙，為肥胖并發(fā)癥的治療提供了新策略。

Fig 4 Entrectinib improved obesity-induced oxidative stress and vasodilatory dysfunction

3 討論

肥胖會引發(fā)慢性炎癥、代謝紊亂、氧化應(yīng)激等問題，進而引發(fā)內(nèi)皮功能障礙，破壞血管舒張功能[9]。以往的研究表明，TRPV4和Nox2是其中關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，然而，很少有人將TRPV4和Nox2作為整體進行研究。本研究使用免疫共振能量轉(zhuǎn)移等技術(shù)，證明TRPV4-Nox2之間存在物理相互作用，這一結(jié)論與以往的研究一致[7]，同時，我們使用了肥胖模型小鼠，提供新的證據(jù)補充證明了肥胖會增加TRPV4-Nox2的物理相互作用。

ROS產(chǎn)生過量會引發(fā)內(nèi)皮功能紊亂，進而導致一系列的疾病，其中，血管擴張功能障礙是引起廣泛關(guān)注的問題之一。以往的研究表明，在正常血管中，內(nèi)皮依賴性舒張主要由3種血管擴張劑[10]，一氧化氮[11]、前列環(huán)素[12]和內(nèi)皮衍生的超極化因子[13]介導，在不同的血管床中貢獻不同。在主動脈血管中一氧化氮是主要舒張因子，而ROS的過量產(chǎn)生會影響一氧化氮的產(chǎn)生和利用度，破壞主動脈舒張，因而本研究選取主動脈血管進行研究。我們發(fā)現(xiàn)肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激并破壞主動脈血管的舒張功能，這一結(jié)果與以往的發(fā)現(xiàn)一致[14-15]。此外，本研究還提供了新的證據(jù)證明，肥胖引發(fā)氧化應(yīng)激與主動脈血管舒張功能障礙是由TRPV4-Nox2復合體物理耦聯(lián)強度增加引起的，減弱耦聯(lián)可以減少肥胖相關(guān)的ROS產(chǎn)生過量和血管舒張功能障礙。

TRPV4和Nox2在全身多處均有分布，使用藥物進行系統(tǒng)性激活會引發(fā)多種副作用[16]，為減少副作用，本研究以TRPV4-Nox2復合體為靶點，進行了藥物篩選，以復合體為靶點的優(yōu)勢在于藥物靶向性的增加。以此為基礎(chǔ)，本研究另一重要發(fā)現(xiàn)是找到一種以TRPV4-Nox2復合體為靶點的藥物恩曲替尼，該藥物不影響TRPV4和Nox2的表達與功能，而僅減弱TRPV4和Nox2在肥胖條件下的過度耦聯(lián)，進而減少肥胖小鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的ROS產(chǎn)生，幫助恢復主動脈血管舒張功能。

綜上所述，在本項研究中，我們證明在肥胖小鼠中TRPV4-Nox2復合物的物理相互作用增強，并證明這種物理相互作用的增強是導致原代主動脈內(nèi)皮細胞中ROS產(chǎn)生增加的原因，同時，我們首次提供了證據(jù)證明這種增強的物理相互作用是造成肥胖小鼠主動脈血管舒張功能障礙的原因之一?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們確認能靶向TRPV4-Nox2的藥物恩曲替尼，可幫助改善肥胖引發(fā)的氧化應(yīng)激與血管舒張功能障礙。這一研究為解釋肥胖相關(guān)病理問題提供了新思路，同時為肥胖并發(fā)癥治療提供了新策略。