牛 捷，楊 婧,趙耀偉，王 銳

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

microRNA(miRNA)是一類在轉(zhuǎn)錄后具有活性的小RNA(19～25個(gè)核苷酸)。它們是由發(fā)夾狀的內(nèi)源性miRNA前體產(chǎn)生，這些miRNA前體是從非蛋白質(zhì)編碼基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的?，F(xiàn)有研究表明，動(dòng)、植物來(lái)源的miRNA可在一定程度上被人體吸收并發(fā)揮其相應(yīng)的作用。

miRNA與靶基因的互補(bǔ)關(guān)系，在很大程度上決定了miRNA的廣泛功能。一般來(lái)說，與miRNA完全互補(bǔ)的靶基因?qū)⑼ㄟ^RNA干擾機(jī)制被降解；而部分互補(bǔ)的靶基因會(huì)受到翻譯抑制[1]。在植物中，miRNA和蛋白質(zhì)編碼基因之間的互補(bǔ)形式以完全互補(bǔ)為主，而在哺乳動(dòng)物中，部分互補(bǔ)更為常見。miRNA參與多種功能基因的調(diào)控，涉及植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。miRNA通過促進(jìn)或抑制靶mRNA的切割或翻譯來(lái)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控，其在幾乎所有的生物學(xué)過程中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括新陳代謝和免疫功能。自miRNA在秀麗隱桿線蟲中首次被發(fā)現(xiàn)以來(lái),在所有的植物、動(dòng)物和其他真核生物中都接連發(fā)現(xiàn)了數(shù)以千計(jì)的miRNA。

一直以來(lái)，對(duì)miRNA的研究都局限在植物和動(dòng)物各自的物種內(nèi)，且miRNA具有不穩(wěn)定、易降解的特征，因此miRNA的跨界調(diào)控被認(rèn)為十分困難。且也僅存在于植物與昆蟲、動(dòng)物與寄生蟲之間。但近年來(lái)這些觀點(diǎn)被打破，發(fā)現(xiàn)植物miRNA和動(dòng)物miRNA可以進(jìn)入人體內(nèi)并發(fā)揮調(diào)控作用，這提示miRNA可能是藥用動(dòng)、植物發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是藥用動(dòng)、植物中隱藏的生物活性成分之一。但因其實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，所以目前仍存在爭(zhēng)議。

植物miRNA在生物學(xué)功能上往往比動(dòng)物miRNA更有效。因?yàn)橹参锶狈τ行У拿庖呦到y(tǒng)，因而需要對(duì)環(huán)境壓力和外部攻擊做出更快、更有效的反應(yīng)，所以植物發(fā)展出了比動(dòng)物更有效的生長(zhǎng)和防御機(jī)制。本文就植物miRNA特別是藥用植物miRNA經(jīng)口服吸收，并參與人體基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)予以分析討論。

1 植物miRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

隨著對(duì)miRNA的不斷研究，植物藥miRNA的治療潛力引起了極大的關(guān)注。但中藥的制備多以煎煮成的湯藥為主，miRNA在制備過程中結(jié)構(gòu)能否保持穩(wěn)定十分關(guān)鍵。

Xie等[2]對(duì)槲寄生miRNA在藥材制備過程中的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。一些槲寄生miRNA經(jīng)研磨、干燥、儲(chǔ)存和浸泡后仍存在，并且能在浸泡液中被檢測(cè)到。他們發(fā)現(xiàn)，暴露于核糖核酸酶、超聲波處理和熱處理可能是miRNA降解的主要原因。機(jī)械處理會(huì)增加miRNA的分解，而可能不會(huì)促進(jìn)miRNA向溶劑中的釋放。植物miRNA的甲基化可能會(huì)增強(qiáng)它們的抗降解能力，而與蛋白質(zhì)和納米顆粒等植物來(lái)源的大分子結(jié)合可能在草藥制備過程中能更有效的保護(hù)植物miRNA。

Wang等[3]利用Illumina高通量測(cè)序和實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證了高溫煮沸的新鮮人參煎液中miRNA的存在，證實(shí)經(jīng)高溫煮沸后的人參miRNA可以保持穩(wěn)定。Zhou等[4]通過Illumina測(cè)序發(fā)現(xiàn)在金銀花湯劑中MIR2911占miRNA讀數(shù)的70%以上。與其他植物miRNA或小RNA片段相比，MIR2911在金銀花湯劑制備過程中可能具有更強(qiáng)的抗高溫能力。經(jīng)RNase處理后發(fā)現(xiàn)MIR2911基本完好無(wú)損，驗(yàn)證了MIR2911的高度穩(wěn)定性。為進(jìn)一步檢驗(yàn)MIR2911的穩(wěn)定性是否依賴于其唯一序列5’-GGCCGGGGACGGACGACUGGGA-3′，將5′-GG突變?yōu)?′-AA或?qū)?′-GGA突變?yōu)?′-AAA，結(jié)果兩個(gè)突變體對(duì)RNase沒有抗性，表明MIR2911的穩(wěn)定性是基于其特定的序列和較高的GC含量。邵紅偉等[5]從甘草飲片的水煎劑中提取到了甘草miRNA,在制備水煎劑的過程中，炮制過的干燥甘草飲片經(jīng)過了高溫處理和冷凍干燥，從中仍然能夠有效地提取到miRNA，表明甘草 miRNA 具有非常強(qiáng)的穩(wěn)定性，這也為中藥源性miRNA經(jīng)消化道不易被破壞提供了佐證。

植物miRNA在均質(zhì)、哺乳動(dòng)物循環(huán)甚至煮沸過程中都完整存在，有以下幾個(gè)原因：(1)一些植物miRNA的3′端存在2′-O-甲基化，這種修飾能保護(hù)miRNA的穩(wěn)定性；(2)miRNA的一級(jí)序列(如高G，C含量)、miRNA的結(jié)構(gòu)和缺乏RNases酶切基序也增強(qiáng)了miRNA的穩(wěn)定性；(3)miRNA蛋白輔酶因子，如高密度脂蛋白和AGO蛋白質(zhì)可防止其分解；(4)植物代謝物中的草藥成分不僅為miRNA創(chuàng)造了良好的環(huán)境，而且還具有RNases抑制作用；(5)在運(yùn)輸過程中，植物miRNA被包裝成微囊泡或外切體，以保護(hù)它們不被降解。

2 植物miRNA的口服可吸收性

植物miRNA口服經(jīng)胃腸道吸收主要存在兩方面爭(zhēng)議，一方面是胃液的胃酸、胰腺和腸道菌群分泌的核酸酶和膽鹽，這些因素都可能將miRNA降解而轉(zhuǎn)化為單個(gè)核苷酸，另一方面是植物miRNA能否被胃腸道吸收及其可能的機(jī)制。

最近研究發(fā)現(xiàn)，模擬胃液的強(qiáng)酸環(huán)境沒有顯著影響植物和哺乳動(dòng)物miRNA的穩(wěn)定性。Zhang等[6]從小鼠肝臟中提取總RNA，pH 2.0環(huán)境下保存數(shù)小時(shí)，研究證實(shí)酸化對(duì)miRNA的產(chǎn)量和質(zhì)量沒有顯著影響。大多數(shù)植物和哺乳動(dòng)物miRNA在酸性條件下都能存活至少6 h，且甲基化對(duì)植物miRNA的穩(wěn)定性有保護(hù)作用。首次驗(yàn)證了具有完整結(jié)構(gòu)的核苷酸在胃腸道中對(duì)消化有抵抗力。王文娟[7]用人參湯給大鼠灌胃，經(jīng)qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證大鼠血液中含有人參miRNA，并通過靶基因預(yù)測(cè)軟件分析，發(fā)現(xiàn)人參中的部分miRNA與大鼠部分基因高度匹配。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)，人類血漿中含有許多來(lái)自外源物種的RNA，包括細(xì)菌、真菌以及玉米、大米、大豆、番茄和葡萄等。因此，植物 miRNA能在胃腸道不被分解并吸收運(yùn)送到血液和組織中是完全有可能的。Wang等[9]研究了6種典型植物miRNA在模擬胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性，以及Caco-2細(xì)胞對(duì)miRNA的吸收機(jī)制。研究結(jié)果表明，植物miRNA在模擬胃腸環(huán)境中可以保持穩(wěn)定性，而日常飲食中食物成分的混合提高了它們對(duì)極端胃腸條件的耐受性。植物miRNA在腸道中被核酸酶降解到一定程度，但其最終濃度高于發(fā)揮生物學(xué)功能所需的濃度。2′-O-甲基化有效地保護(hù)了在腸液中的植物miRNA，并顯著提高了它們的最終濃度。不同miRNA在胃腸環(huán)境中的穩(wěn)定性差異很大，并與其二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。一些miRNA的分子內(nèi)自折疊可以增強(qiáng)其在胃環(huán)境中的穩(wěn)定性，3′末端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)是抵抗RNase消化的主要因素。穩(wěn)定的植物miRNA可以通過網(wǎng)織蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被Caco-2細(xì)胞吸收。細(xì)胞對(duì)miRNA的攝取是順序依賴的，受細(xì)胞膜上兩種典型的受體NACh和TLR9的促進(jìn)。這些結(jié)果表明，一些植物miRNA在模擬的胃腸環(huán)境中是穩(wěn)定的，并可以被Caco-2細(xì)胞吸收，這是它們潛在的跨界調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)。

Yang等[10-11]利用數(shù)字液滴聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)證實(shí)了MIR2911在小鼠體液中的存在，并闡明其生物發(fā)生與植物26S rRNA的完整性有關(guān)。Yang等[12]對(duì)MIR2911的研究表明，如果將miRNA包裹在微囊泡、外切體或脂質(zhì)體等其他載體中，某些膳食microRNA的消化穩(wěn)定性可能會(huì)更高。

Zhang等[6]介紹了一種循環(huán)miRNA的可能載體——微囊泡(MVS)。外源miRNA可以通過胃腸道吸收運(yùn)送到血管和其他組織。MVS是幾乎所有類型的細(xì)胞在正常和病理?xiàng)l件下都會(huì)脫落形成的小泡。它們攜帶原始細(xì)胞的膜表面受體或配體，選擇性地與特定的靶細(xì)胞作用，并能夠轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)細(xì)胞間通訊的生物活性脂質(zhì)、mRNA或蛋白質(zhì)。人血漿中的MVS是由微粒、外切體和其他泡狀結(jié)構(gòu)組成的混合物，人血漿中的許多類型的MVS都含有miRNA。進(jìn)一步研究表明，miRNA可以選擇性地包裝到MVS中，并主動(dòng)運(yùn)送到受體細(xì)胞中。在受體細(xì)胞中，外源miRNA可以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)和受體細(xì)胞的功能[13]。例如，來(lái)自4種可食用植物(葡萄、葡萄柚、生姜和胡蘿卜)的納米顆粒已被證明具有抗炎特性。植物來(lái)源的外切體樣顆粒會(huì)被小鼠的腸道微生物區(qū)系吸收，保護(hù)它們免受結(jié)腸炎癥狀的影響[14]。由此可見，循環(huán)中的miRNA是穩(wěn)定和活躍的信號(hào)分子，可由細(xì)胞分泌的MVS遞送，這為細(xì)胞間和細(xì)胞器間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)開辟了一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

例6：在一次后期剪輯過程中，發(fā)現(xiàn)臨近傍晚補(bǔ)拍的鏡頭光線不足、色彩暗淡，造成相鄰兩個(gè)鏡頭之間的光線、色彩反差較大，視覺效果不連貫。剪輯時(shí)可以在時(shí)間軸上選擇需要調(diào)整的片段，打開“選項(xiàng)”窗口中的“色彩校正”，調(diào)整色調(diào)、飽和度、亮度、對(duì)比度、Gamma等各參數(shù)的值，還可以根據(jù)需要調(diào)整白平衡，邊調(diào)整邊觀察畫面的變化情況，直到相鄰鏡頭的色調(diào)、光線協(xié)調(diào)統(tǒng)一，完美流暢的展現(xiàn)作品。

外切體也是運(yùn)輸miRNA的一種可能載體。外切體是大小為30～100 nm的微泡，它含有不同生物分子的包括核酸，如miRNA和其他ncRNA，由不同類型的細(xì)胞分泌到細(xì)胞外液中。外切體參與多種RNA的降解和加工，參與各種RNA的代謝。外切體在多細(xì)胞生物體的細(xì)胞運(yùn)輸和細(xì)胞間通訊中起著重要作用，這些生理穩(wěn)定的外切體可以通過運(yùn)送各種類型的RNA來(lái)發(fā)揮跨物種調(diào)節(jié)的作用。外切體作為載體的優(yōu)點(diǎn)之一是它們不受免疫反應(yīng)的影響，并且它們能夠穿越生物屏障，包括血腦屏障。由此可見，外切體是理想的治療載體，它們?cè)谖锢砗筒±項(xiàng)l件下是穩(wěn)定的，并且經(jīng)預(yù)先設(shè)計(jì)的外切體可以充當(dāng)載體。其藥代動(dòng)力學(xué)取決于外切體的來(lái)源(不同的成分可能影響生物分布)、生物效應(yīng)和給藥途徑等因素。例如，從HEK293培養(yǎng)上清中分離出的外切體，先轉(zhuǎn)染腫瘤抑制因子miR-let-7a后注射入組織，能夠到達(dá)乳腺癌組織異種移植，并以EGF受體EGFR為靶點(diǎn)，產(chǎn)生治療效果[15]。在來(lái)自人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外切體的miR-143也觀察到了類似的結(jié)果[16]。MiR-143在外切體中過表達(dá)，通過下調(diào)其靶標(biāo)TFF3在小鼠中對(duì)前列腺癌產(chǎn)生抑制作用。這可以延伸到其他miRNA，如miR-134，它被發(fā)現(xiàn)通過富含miR-134的外切體傳遞時(shí)可以減少乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17]。

3 植物miRNA的體內(nèi)分布特異性

同種植物miRNA經(jīng)胃腸道吸收進(jìn)入血液和器官后，其分布濃度有差別，且不同種類植物miRNA在血液和器官中的含量也不同。

Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)MIR168a和MIR156a可以在小鼠血漿MVS、肝臟、小腸和肺中被檢測(cè)到；而MIR166a只能在血清中檢測(cè)到，組織中幾乎檢測(cè)不到。Zhou等[4]用金銀花湯給小鼠灌胃，檢測(cè)小鼠血漿及各臟器中MIR2911含量變化。連續(xù)灌胃3 d后，小鼠血漿中MIR2911濃度增加了3倍，肺中MIR2911濃度增加了8倍以上，肝臟中MIR2911濃度可增加到10倍，而在小鼠腸和腎臟中MIR2911濃度保持不變。MiR159是一種古老的基因，存在于大多數(shù)陸地植物中。Yu 等[18]發(fā)現(xiàn)miR159a主要分布在小鼠肝組織中。在小鼠的熒光圖像中，經(jīng)腹腔注射miR159a的小鼠的胸部顯示出強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，而在其他組中沒有觀察到熒光信號(hào)，表明miR159a主要分布在小鼠的肝組織中。繼續(xù)用熒光原位雜交技術(shù)分析顯示，用FAM標(biāo)記的miR159a在小鼠肝組織中有表達(dá)，主要定位于細(xì)胞間質(zhì)和胞漿。提示miR159a可被小鼠肝細(xì)胞攝取，進(jìn)而下調(diào)小鼠肝組織中GSK-3、β介導(dǎo)的NF-κB和β-1關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。

因此，在檢測(cè)人和動(dòng)物的血漿或血清中的外源miRNA時(shí)，miRNA的選擇十分重要。植物miRNA的選擇要考慮的因素主要有，植物中miRNA的濃度，以及人和動(dòng)物胃腸道對(duì)植物miRNA的選擇性吸收程度。因?yàn)槲改c道吸收植物miRNA可能是有選擇性的，在植物中含量高的miRNA不一定在血漿中處于高水平。所以在人類或動(dòng)物中檢測(cè)高豐度的植物miRNA很容易失敗。

4 植物藥miRNA的跨界調(diào)控機(jī)制

4.1 金銀花MIR2911miRNA2911(MIR2911)[4]是金銀花(HS)的非典型miRNA，從HS水煎劑中提取的MIR2911可通過靶向IE62基因直接抑制水痘-帶狀皰疹病毒的復(fù)制，具有潛在的治療流感和EV71病毒感染的作用。HS水煎劑、HS水煎劑提取RNA和人工合成MIR2911均能顯著抑制H1N1病毒復(fù)制，但對(duì)Pb2和NS1 MIR2911結(jié)合核苷酸序列發(fā)生改變的突變病毒株感染無(wú)明顯影響。重要的是，HS水煎劑對(duì)病毒復(fù)制的抑制作用可被抗MIR2911反義寡核苷酸所消除。MIR2911在體內(nèi)外對(duì)H5N1和H7N9病毒復(fù)制也有抑制作用，給予MIR2911或HS水煎劑顯著降低了由H5N1感染引起的小鼠死亡率。

4.2 人參miRNA王文娟等[7]通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，人參miRNA能夠影響INF-8、IL-10、MMP9、IL4R、MARK14、TNF-α、BCL2L1mRNA的表達(dá)，其可能影響多條免疫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的表達(dá)。

4.3 甘草miRNA邵紅偉等[5]證明甘草miRNA不僅能夠增強(qiáng)外周血單個(gè)核細(xì)胞的增殖能力，還能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞的抗原遞呈能力，這為解釋甘草具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用奠定了基礎(chǔ)。在課題組后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，何免等[19]發(fā)現(xiàn)甘草miRNA提高免疫細(xì)胞活性或刺激增殖方面的作用不大，對(duì)機(jī)體通過直接提高免疫系統(tǒng)作用也不明顯。但甘草miRNA對(duì)與癌癥發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因，如原癌基因c-JUN/c-FOS、抑癌基因p53、調(diào)控凋亡的Bax/Bcl-2、Fas/FasL信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄激活因子STAT1作用效果非常明顯。因此，甘草miRNA對(duì)多種細(xì)胞因子影響不大，僅有可能影響到其中某些基因的表達(dá)。

4.4 丹參miRNAYang等[20]發(fā)現(xiàn)，丹參中的Sal-miR-1和Sal-miR-3可調(diào)節(jié)OTUD7B/KLF4/NMHC IIA軸從而抑制血管重構(gòu)。丹參提取物Sal-miR-1和Sal-miR-3經(jīng)灌胃給藥后可進(jìn)入小鼠體內(nèi)，并能顯著抑制頸動(dòng)脈結(jié)扎所致的內(nèi)膜增生，還可抑制凝血酶誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)遷移和單核細(xì)胞與VSMCs的黏附。SAL-miR-1和Sal-miR-3通過與OTUD7B 3′UTR的不同位點(diǎn)結(jié)合，阻斷凝血酶對(duì)OTUD7B的上調(diào)作用。Sal-miR-1和Sal-miR-3下調(diào)OTUD7B可以降低KLF4蛋白的去泛素化水平，而KLF4的降低則緩解了其對(duì)NMHC IIA基因轉(zhuǎn)錄的抑制，從而提高了NMHC IIA的表達(dá)水平。此外，NMHC IIA的增加通過維持VSMC的收縮表型來(lái)抑制VSMC的遷移和單核細(xì)胞與VSMC的黏附。

4.5 辣木籽miRNAMinutolo等[21]研究了辣木籽(MO)植物精制提取物miRNAs對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答和抗HIV感染的作用。分析了MO p-miRs轉(zhuǎn)染HIV+PBMCs的效果，發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞凋亡率的增加，細(xì)胞存活率下降，表達(dá)Fas的輔助性T細(xì)胞增多，細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)降低。MO p-miRs具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Fas和BcI2介導(dǎo)的凋亡)、降低淋巴細(xì)胞活性和病毒復(fù)制的能力。同時(shí)，沒有檢測(cè)到對(duì)健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生任何影響。CD4+T細(xì)胞被MO p-miRs轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞活性顯著降低，T細(xì)胞分化改變，從而使中央和效應(yīng)器記憶細(xì)胞減少，的同時(shí)增加了終末效應(yīng)器記憶細(xì)胞。并且p-miRs轉(zhuǎn)染減少了細(xì)胞內(nèi)的HIV p24蛋白和病毒DNA整合。經(jīng)證實(shí)，p-miR858b的序列存在于MO p-miR池中，并預(yù)測(cè)其靶點(diǎn)為與HIV-Nef結(jié)合有關(guān)的VAV1蛋白。VAV1蛋白在T細(xì)胞抗原受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，可觸發(fā)多種途徑的激活。合成的p-miR858b轉(zhuǎn)染HIV+PBMC后，VAV1和HIV p24蛋白的表達(dá)降低。

4.6 生姜miRNAKalarikkal等[22]證實(shí)在生姜中類外切體囊泡的納米顆粒中存在靶向SARS-CoV-2的 miRNA，并且它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)環(huán)境中以SARS-CoV-2基因組/轉(zhuǎn)錄組為靶點(diǎn)的可能性更高。將納米顆粒形式的miRNA靶向 SARS-CoV-2，發(fā)現(xiàn)這些miRNA可以選擇性地在SARS-CoV-2的主要靶組織中傳遞。由于這些納米顆?？稍隗w內(nèi)蓄積到肺組織中，靶向SARS-CoV-2基因組的納米顆粒形式的miRNA有望作為一種新冠肺炎替代治療手段。生姜衍生的類外切體納米顆粒還可以預(yù)防肝臟相關(guān)疾病的發(fā)展，如酒精誘導(dǎo)的損傷[23]，并通過減弱細(xì)胞因子和促進(jìn)腸道細(xì)胞增殖來(lái)預(yù)防炎癥性腸病[24]。

4.7 黃芪miRNAShen等[25]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過鼻腔給藥，黃芪來(lái)源的miR-396在哮喘小鼠的脾臟、外周血和肺組織中的表達(dá)水平是內(nèi)參基因的10倍左右。經(jīng)20 μg miR-396模擬物連續(xù)7次治療后小鼠IL-5、IL-13細(xì)胞因子水平顯著降低，且miR-396下調(diào)了Th2細(xì)胞主要轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)。

4.8 天麻miRNA天麻(GE)是一種珍貴的中草藥，具有抗驚厥、神經(jīng)保護(hù)、抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。Xia等[26]通過Illumina高通量測(cè)序，在GE中發(fā)現(xiàn)了5 718個(gè)miRNA，其中52個(gè)是新發(fā)現(xiàn)的GE miRNA。功能預(yù)測(cè)表明，Gas-mi R01和Gas-mi R02可能干擾3個(gè)關(guān)鍵基因：A20、TNF-α和IκBα。將Gas-mi R01和Gas-mi R02模擬物轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，可顯著抑制NF-κB-driven基因的重要反饋調(diào)節(jié)因子A20的表達(dá)。此外，給小鼠用天麻煎煮液灌胃后，可以在小鼠的血清、肝、腦、腎、脾中檢測(cè)到高水平的Gas-mi R01和Gas-mi R02，而A20的表達(dá)降低[27-28]。這些結(jié)果提示GE miRNA是GE中的一組活性成分，可能與天麻的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

4.9 顛茄miRNAABA miRNA 9497是從顛茄中分離得到的，與智人miRNA-378有很高的同源性。Avsar等[28]首次證明ABA miRNA 9497和miRNA-378都可以通過與人中樞神經(jīng)系統(tǒng)富含ZNF-691基因的3′-UTR結(jié)合而下調(diào)該基因的mRNA表達(dá)。他們推測(cè)顛茄的神經(jīng)毒性作用可能部分源于aba-miRNA-9497對(duì)ZNF-691的調(diào)節(jié)作用。由于ZNF-691參與了炎癥等多種神經(jīng)病理過程，因此利用aba miRNA 9497靶向ZNF-691作為炎癥在多種疾病中的重要作用將引起人們的極大興趣。

5 問題與不足

植物miRNA能否口服進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮作用仍存在分歧：支持者認(rèn)為在動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到的植物miRNA是真實(shí)存在于動(dòng)物體內(nèi)的植物miRNA；而否認(rèn)者認(rèn)為這些檢測(cè)到的植物miRNA是由樣本污染或者儀器誤差造成的假陽(yáng)性結(jié)果。此類實(shí)驗(yàn)的一般思路為，為了驗(yàn)證外源miRNA能否進(jìn)入體內(nèi)并發(fā)揮作用，設(shè)計(jì)動(dòng)物喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)并設(shè)置對(duì)照組(通常是給某種動(dòng)物喂食包含不同含量植物miRNA的食物)。然后測(cè)量動(dòng)物體液或組織中的植物miRNA含量，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在植物miRNA種類和含量上的差別，最后得出支持或否認(rèn)的結(jié)論。這就顯露了不同研究團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間矛盾的原因：其一，不同動(dòng)物物種、不同植物性食物以及不同組織器官、體液的特異性；其二，樣本種類單一、數(shù)量有限。從而難以在統(tǒng)計(jì)層面將其與污染物及儀器誤差區(qū)分開。

盡管有大量研究證明外源miRNA可作用于人體，但這些miRNA的生物利用度仍然存在爭(zhēng)議。原因包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可重復(fù)性低，序列分析中存在技術(shù)錯(cuò)誤，或是研究設(shè)計(jì)本身不合理。Dickinson等[29]首先駁斥了植物miRNA攝取和跨物種調(diào)節(jié)的概念。他們給小鼠喂食對(duì)照食物、添加41%大米的食物、添加75%大米的食物。然而，用血漿和肝組織的總RNA進(jìn)行miRNA測(cè)序時(shí)，水稻來(lái)源的miR-168a在1 000多萬(wàn)個(gè)讀數(shù)中顯示不到10個(gè)讀數(shù)。同樣，健康運(yùn)動(dòng)員食用了含有高水平miR-156a、miR-159a和miR169a的水果后，血清中也沒檢測(cè)出這些miRNA。在另一項(xiàng)研究中，Huang等[30]用從玉米粉RNA中分離出的miRNA喂養(yǎng)小鼠，兩周后沒有在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到玉米miRNA，他們推測(cè)大多數(shù)miRNA在消化過程中被廣泛降解。Witwer等[31]給豬尾獼猴喂食了以植物為基礎(chǔ)富含miRNA的物質(zhì)，后用qRT-PCR檢測(cè)其血漿，沒有檢測(cè)到miR160、miR156、miR166、miR167、miR168和miR172。Snow等[32]讓健康受試者攝入含有miRNA的水果后，沒有在血漿中檢測(cè)到miR156a，miR159a和miR169a。這些不一致可能源于細(xì)胞外miRNA研究領(lǐng)域中常見的技術(shù)問題，包括miRNA濃度低，缺乏標(biāo)準(zhǔn)的RNA提取方法，以及缺乏適當(dāng)?shù)膬?nèi)部控制。分析和引物設(shè)計(jì)錯(cuò)誤也影響了幾個(gè)已發(fā)表的關(guān)于外源miRNA在人體循環(huán)中的生物利用度的文章。在Pastrello等[33]發(fā)表的文章中，作者最初在大量食用西蘭花的健康人血清樣本中檢測(cè)到了植物miRNA，但后來(lái)以引物設(shè)計(jì)策略錯(cuò)誤而導(dǎo)致虛假擴(kuò)增為由撤回了這篇文章。

此外，幾個(gè)公開可用的NGS數(shù)據(jù)集通常被植物來(lái)源的miRNA污染。通過分析來(lái)自人類組織和血清的824個(gè)測(cè)序數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)其中存在非人類的miRNA序列，包括植物來(lái)源的miRNA，盡管豐度較低。此外，Kang等[34]發(fā)現(xiàn)外源miRNA的存在和豐度，與miRNA直接攝入的器官(如肝臟)和非直接攝入的器官(如腦脊液)之間沒有明顯的相關(guān)性。他們分析了800多個(gè)體液和組織樣本，得出結(jié)論，在人體內(nèi)檢測(cè)到植物miRNA是由于交叉污染，甚至是人工制品。Heintz-Buschart等[35]驗(yàn)證，這些miRNA污染的來(lái)源，其中之一可能是因?yàn)槭褂昧松虡I(yè)miRNA純化試劑盒，從而在萃取柱中引入了外源miRNA。用不含核酸酶的水作為輸入樣本，通過這些柱子進(jìn)行RNA分離，可得到幾個(gè)小RNA。在公共數(shù)據(jù)集中可以查找到這些受污染的小RNA序列，雖然這些小RNA的含量較低。為避免這種污染，在分離RNA之前，用次氯酸鈉處理柱子，然后用無(wú)核酸酶的水清洗，可以顯著減少這些小RNA種群的污染。

以前的研究已經(jīng)解釋了植物miRNA的穩(wěn)定性。但Xie等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)，甲基化的hsa-let-7a不能在酶環(huán)境中存活(例如，RNase處理和各種槲寄生提取物)，這表明植物miRNA的甲基化可能不是在草藥制備過程中保持它們穩(wěn)定的關(guān)鍵因素。此外，合成的miRNA在與槲寄生制劑一起加工時(shí)迅速降解，表明提取物中的次生代謝物不能有效地保護(hù)miRNA不被降解。除此之外，Denzler等[36]和Howard等[37]獨(dú)立發(fā)表的研究論文指出，缺乏證據(jù)表明植物miRNA可以進(jìn)入哺乳動(dòng)物循環(huán)系統(tǒng)，認(rèn)為沒有闡明miRNA調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)代謝過程的途徑。

對(duì)于miRNA的矛盾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，需要仔細(xì)考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及操作過程中各個(gè)環(huán)節(jié)的關(guān)鍵問題，如選擇合適的miRNA、正確的miRNA提取方法、合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、最小化測(cè)序偏差、準(zhǔn)確的歸一化等。miRNA豐度并不是植物中miRNA攝取的唯一決定因素，某些富含在植物中的miRNA可能仍然在體內(nèi)無(wú)法檢測(cè)到。由于植物miRNA可能存在選擇性吸收，隨機(jī)選擇一種或兩種植物miRNA來(lái)測(cè)量攝取量具有很高的風(fēng)險(xiǎn)。究竟什么樣的序列排列或核苷酸組成是可獲得的？哪種類型的miRNA修飾可以產(chǎn)生高攝取效率？miRNA在體內(nèi)的代謝機(jī)制是怎樣的？這些問題在今后仍有待解決。常見的核酸定量技術(shù)，如實(shí)時(shí)PCR、微陣列和深度測(cè)序，還不足以識(shí)別miRNA的轉(zhuǎn)移。檢測(cè)特定miRNA的新工具正在被探索。Croci等[38]首次證明了放射性標(biāo)記的anti-miR PNA探針可以用于細(xì)胞中的分子成像，從而為miRNA表達(dá)的體內(nèi)成像提供了數(shù)據(jù)和提示。

6 展望

植物藥miRNA可以經(jīng)口服吸收并發(fā)揮跨界調(diào)控作用，讓植物藥miRNA作為活性成分發(fā)揮作用成為可能，拓寬了中藥作用機(jī)制在分子層面的研究，并為臨床藥物治療提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但現(xiàn)有相關(guān)研究中仍存在一些不足，應(yīng)針對(duì)這些不足進(jìn)行完善，改善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和糾正技術(shù)錯(cuò)誤，以解決中藥miRNA口服吸收并發(fā)揮跨界調(diào)控作用研究中的問題與不足。