羅 嫄，胡澤鍇

（成都市藥品檢驗(yàn)研究院化學(xué)室，四川 成都 610045）

呋塞米化學(xué)名為2-[（2-呋喃甲基）氨基]-5-（氨磺?；?4-氯苯甲酸，于1969 年在我國(guó)上市，為利尿藥，其利尿作用快而短、療效高、適應(yīng)證廣、副作用小，多用于其它利尿藥無(wú)效的嚴(yán)重病例[1-4]，如心臟、腎臟、肝臟疾病所致水腫以及心力衰竭、心肌梗死合并心力衰竭等疾病[5-7]。呋塞米片的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2020 版二部，規(guī)格為20 mg/片，其含量測(cè)定為紫外分光光度法，無(wú)含量均勻度檢查項(xiàng)[8-11]。本研究參考國(guó)內(nèi)外藥典收載的方法以及相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]，建立呋塞米片含量及含量均勻度測(cè)定的高效液相色譜法，并對(duì)6 個(gè)國(guó)內(nèi)制藥廠(chǎng)家的產(chǎn)品進(jìn)行考察，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀、Waterse2695-2998 高效液相色譜儀、梅特勒-MS205DU電子天平（分度值：1/10 萬(wàn)）、島津AEG220 電子天平（分度值：1/10 000）。

1.2 試藥 呋塞米對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)100544-201503，含量99.3%），呋塞米雜質(zhì)A 對(duì)照品（USP REFERENCE STANDARD，批號(hào)：1287020，含量為98%），乙腈、四氫呋喃為色譜純，水為實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水，其余試劑為分析純。呋塞米片由國(guó)內(nèi)6 個(gè)廠(chǎng)家提供，共15 批，規(guī)格均為20 mg。輔料均由廠(chǎng)家提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水－四氫呋喃－冰醋酸（70∶30∶1）；柱溫：30 ℃；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：20 μl?；旌先軇喝”姿?2 ml，加乙腈-水（1∶1）至1000 ml，混勻。理論板數(shù)：按呋塞米峰計(jì)算不低于4000，呋塞米峰與相對(duì)保留時(shí)間1.15 倍峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取呋塞米對(duì)照品10 mg，置100 ml 量瓶中，用混合溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 測(cè)定供試品溶液：取樣品20 片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于呋塞米50 mg），置50 ml 量瓶中，加混合溶劑適量，超聲使溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml，加混合溶劑稀釋至50 ml，搖勻即得。含量均勻度檢查供試品溶液：取樣品1 片，置50 ml 量瓶中，加混合溶劑適量，超聲使溶解并定容，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液2.5 ml，加混合溶劑稀釋至10 ml，搖勻即得。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 破壞試驗(yàn)：取其中1 批樣品，分別用2 mol/L 鹽酸溶液1 ml，放置18 h、2 mol/L 氫氧化鈉溶液1 ml，放置18 h、30%過(guò)氧化氫溶液1 ml，放置18 h、80 ℃水浴加熱5 h、4000 lx 光照5 h 進(jìn)行破壞，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)以二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行呋塞米峰純度分析，可見(jiàn)光破壞產(chǎn)生雜質(zhì)較多，在上述色譜條件下呋塞米峰與相鄰降解產(chǎn)物峰良好分離，見(jiàn)圖1。陰性干擾試驗(yàn)：將各廠(chǎng)家提供的輔料按各自處方比例混合，制成相應(yīng)空白輔料溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果顯示均不干擾呋塞米峰的檢出。

圖1 方法專(zhuān)屬性考察圖譜

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密稱(chēng)取呋塞米對(duì)照品，配制為0.06、0.78、0.11、0.15、0.17 mg/ml 的溶液，照“2.2”項(xiàng)下色譜條件試驗(yàn)，記錄色譜圖，以濃度X（mg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示呋塞米線(xiàn)性方程為Y=7E+07X+28089，R2=0.9999，在0.056～0.168 mg/ml 范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5 定量限 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照溶液用混合溶劑稀釋進(jìn)樣，以呋塞米峰的信噪比約為10 時(shí)為定量限，進(jìn)樣量為0.8 ng。

2.6 精密度試驗(yàn)

2.6.1 進(jìn)樣精密度 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣，峰面積RSD 為0.12%，結(jié)果良好。

2.6.2 中間精密度 對(duì)08 批次樣品進(jìn)行中間精密度考察，RSD 為0.86%，結(jié)果良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取上述批次樣品平行制備6 份含量測(cè)定供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，6 份樣品結(jié)果RSD 為0.29%，結(jié)果良好。

2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取08 批次樣品適量，共9份，分3 組按80%、100%、120%比例加入呋塞米對(duì)照品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下含量測(cè)定供試品溶液制備準(zhǔn)確度供試品溶液，按擬定方法測(cè)定回收率，結(jié)果回收率分別為97.77%、99.25%、100.97%、100.48%、101.23%、102.00%、99.81%、99.44%、99.72%，平均值為100.08%，RSD 為1.16%（n=9）。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取呋塞米對(duì)照品溶液及08 批次含量供試品溶液，在0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣，結(jié)果顯示對(duì)照品溶液主峰峰面積的RSD 為0.68%，供試品溶液主峰峰面積的RSD 為0.76%。

2.9 耐用性試驗(yàn) 不同流速、柱溫和有機(jī)相比例、不同色譜儀和色譜柱進(jìn)行相同批次供試品的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示RSD 為0.60%（n=10）。

2.10 樣品測(cè)定 取6 個(gè)廠(chǎng)家共15 批次樣品按照擬定方法進(jìn)行含量測(cè)定和含量均勻度檢查，并與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的含量測(cè)定方法的結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 色譜條件中的流動(dòng)相參考了USP42，其檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。將呋塞米對(duì)照品進(jìn)行DAD 掃描，其在254 nm 響應(yīng)值處于低位。因在呋塞米片有關(guān)物質(zhì)研究中對(duì)呋塞米雜質(zhì)A、呋塞米雜質(zhì)B 掃描后選擇了整體檢出雜質(zhì)較多的波長(zhǎng)272 nm，且在《中國(guó)藥典》2020 版二部中呋塞米注射液含量測(cè)定下也選擇了272 nm 的波長(zhǎng)，為保持方法的延續(xù)性，將檢測(cè)波長(zhǎng)定為272 nm。

3.2 系統(tǒng)適用性 雜質(zhì)峰分離度的設(shè)定USP42 和BP2019 中對(duì)系統(tǒng)適用性溶液有配制要求，即將呋塞米對(duì)照品與呋塞米雜質(zhì)A 對(duì)照品混合配制為適宜濃度的溶液。但呋塞米雜質(zhì)A 對(duì)照品較難獲得，如若沿用，將為常規(guī)檢驗(yàn)增加難度。本研究考察了擬定色譜條件下在不同色譜柱上[Agilent ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo HYPERSIL C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、資生堂TYPE MGⅡC18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）]呋塞米雜質(zhì)A 與呋塞米主峰的分離情況（分別為3.6、2.8、3.5）及其相對(duì)保留時(shí)間（分別為1.15、1.13、1.15），可見(jiàn)呋塞米雜質(zhì)A 的相對(duì)保留時(shí)間較為穩(wěn)定，分離度均符合要求，故在擬定標(biāo)準(zhǔn)中考察相對(duì)保留時(shí)間約為1.15 處雜質(zhì)峰與主峰的分離度。