董樹國，霍玲玲，邵千禧，王 敏 (吉林醫(yī)藥學院藥學院，吉林 吉林 132013)

五味子為木蘭科藤本類植物，因五味子果實有酸、甘、苦、辛、咸共五味，故稱五味子。五味子可興奮人體的中樞神經(jīng)及呼吸系統(tǒng)，并且對人們血壓、肝臟、心臟有一定調(diào)節(jié)能力，對人的視覺能力及聽覺能力有強化作用，能夠促進分泌膽汁，提高抗菌能力[1]?，F(xiàn)代研究表明，五味子中含有多種能對人身體產(chǎn)生影響的化學成分，主要含有有機酸、木脂素、多糖、多酚、氨基酸等化學活性成分[2-3]。超聲波提取新技術(shù)是利用超聲的空化作用加速植物有效成分的溶出，提高有效成分的提取率和原料的利用率，已廣泛用于植物多酚的提取[4-5]。本研究利用超聲波提取進行五味子多酚的提取，以多酚提取率為考察指標，以提取時間、提取溫度、料液比、乙醇濃度為考察因素，利用正交試驗法對其提取條件進行優(yōu)化，并研究了五味子多酚對超氧陰離子自由基、羥自由基、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)自由基的清除能力，為進一步研究與應(yīng)用五味子多酚提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子(吉林省長白山區(qū))；沒食子酸(純度>99%，國藥集團化學試劑有限公司)；硫酸亞鐵、鄰菲啰啉(分析純，沈陽大慶試劑；)三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、DPPH(分析純，麥克林試劑有限公司)；焦性沒食子酸(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；其他試劑均為分析純。

FA1104N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；T6新世紀紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 沒食子酸標準曲線的繪制

取7個10 mL容量瓶，分別準確加入2.0 mg/mL沒食子酸標準品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別加入酒石酸亞鐵溶液4 mL，用KH2PO4-NaH2PO4(pH值7.5)的緩沖溶液定容至刻度，靜置5 min，測定溶液在540 nm處的吸光度。以沒食子酸標準液濃度及吸光度值分別為橫、縱坐標，繪制出沒食子酸標準曲線，并擬合線性方程為Y=1.583X-0.007 7，R2=0.999 6。在濃度范圍0.1～0.6 g/L內(nèi)沒食子酸標準溶液吸光度與濃度呈線性關(guān)系。

1.3 五味子中多酚提取及含量測定

稱取五味子粉末2.0 g，按照不同的料液比加入乙醇溶液，進行超聲波輔助提取，分別移取適量實驗所得的多酚提取液，利用酒石酸亞鐵法測定提取液中多酚的濃度并計算提取率[6-7]。

1.4 正交試驗

根據(jù)前期實驗結(jié)果，以提取時間、提取溫度、料液比和乙醇濃度為考察因素[8-9]，選取五味子多酚的提取率作為考察指標，利用L9(34)正交試驗進行優(yōu)化，正交試驗的因素水平設(shè)定見表1。

表 1 正交試驗因素水平設(shè)計

1.5 體外抗氧化實驗

1.5.1鄰苯三酚自氧化法測定清除超氧陰離子能力

取10 mL容量瓶7個，1～5號容量瓶中放入50 mmol/L pH值8.2的Tris-Hcl緩沖液3 mL，分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的五味子多酚提取液，取25 mmol/L鄰苯三酚1 mL加入，震蕩混勻，6號管不加入鄰苯三酚溶液，而7號管以蒸餾水替代五味子多酚提取液，在25 ℃條件下，進行20 min水浴，滴加一滴濃鹽酸以終止反應(yīng)，在420 nm波長處測定吸光度，對每份樣品進行3次測定，取三者的平均值。計算超氧陰離子自由基的清除率[10-11]。

1.5.2Fenton法測定清除羥自由基能力

取11個10 mL的容量瓶，在1號容量瓶中加入7.5 mmol/L鄰菲啰啉溶液1.0 mL，再加入pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液1.0 mL，7.5 mmol/L硫酸亞鐵溶液1.0 mL，0.1%的H2O21.0 mL，采用去離子水進行定容，在37 ℃下水浴1.0 h，在波長為536 nm處測定吸光度值。在2～6號容量瓶中分別加入體積為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的五味子多酚提取液，7號容量瓶中不加入H2O2及五味子多酚提取液，重復(fù)上述1號容量瓶的操作，分別測其吸光度值。計算羥自由基的清除率[12]。

1.5.3分光光度法測定清除DPPH自由基能力

取10mL的容量瓶11個，在1～5號容量瓶中分別放入樣品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和2 mL 0.04 g/L的DPPH溶液，以無水乙醇定容，以無水乙醇為參比溶液，在波長517 nm處測定吸光度。在6～10號容量瓶中分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的樣品溶液和2 mL的無水乙醇溶液，在波長517 nm處測定吸光度。11號容量瓶加入2 mL DPPH溶液和2 mL乙醇，搖勻后于40 ℃避光靜置10 min，以無水乙醇定容，測定吸光度。計算樣品清除DPPH自由基清除率[13-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表2。結(jié)果表明，對五味子多酚提取率影響最大因素為超聲溫度，然后依次為時間、料液比和乙醇濃度。篩選出的最佳提取工藝條件組合為A3B3C2D1，即提取溫度為65 ℃，乙醇濃度80%，料液比(g/mL)1∶25，超聲時間10 min。

在正交試驗的基礎(chǔ)上，按照最佳提取條件進行3次重復(fù)提取，得出提取率分別為5.42%、4.94%、5.14%，RSD為4.67%，表明五味子多酚的最佳提取工藝條件具有較好的重現(xiàn)性。

2.2 體外抗氧化性結(jié)果

2.2.1清除超氧陰離子自由基的能力

五味子多酚對超氧陰離子自由基的清除能力結(jié)果見圖1。由圖1可見，五味子多酚對超氧陰離子自由基的清除率隨著濃度增加而增加，當五味子多酚濃度為4.5 mg/L時，對超氧陰離子自由基的清除率為42.1%，當五味子多酚濃度提高到27 mg/L時，對超氧陰離子自由基的清除率為87.9%。

表 2 正交試驗結(jié)果

2.2.2清除羥自由基的能力

五味子多酚對羥自由基的清除率結(jié)果見圖2。由圖2可見，當五味子多酚濃度為4.5 mg/L時，對羥自由基的清除率為45.6%，當五味子多酚濃度提高到27 mg/L時，對羥自由基的清除率為85.8%。當五味子多酚濃度較低時，隨著多酚濃度的升高，對羥自由基清除率的趨勢增加較明顯，當五味子多酚濃度較高時，羥自由基的清除率增加趨勢較為緩慢。

2.2.3清除DPPH自由基的能力

五味子多酚對DPPH自由基的清除率結(jié)果見圖3。由圖3可見，當五味子多酚濃度為9.0 mg/L時，對DPPH自由基的清除率為4.76%，當五味子多酚濃度提高到54.0 mg/L時，對DPPH自由基的清除率為83.8%，當五味子多酚濃度低于36 mg/L時，隨著多酚濃度的升高，對DPPH自由基的清除率增加較明顯，當五味子多酚濃度高36 mg/L時，DPPH自由基的清除率增加趨勢較為緩慢。

圖 1 超氧陰離子的清除試驗結(jié)果 圖 2 羥自由基清除試驗結(jié)果 圖 3 DPPH自由基清除試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

利用超聲波輔助提取法提取五味子多酚，通過正交試驗，得出五味子多酚超聲波輔助提取的最佳提取工藝為：超聲溫度65 ℃，乙醇濃度80%，料液比(g/mL)1∶25，超聲時間10 min，通過重復(fù)性實驗表明，五味子多酚最佳提取工藝具有較好的穩(wěn)定性?？寡趸匝芯?，結(jié)果表明，隨著五味子多酚濃度的升高，對超氧陰離子自由基、羥自由基及DPPH清除率也隨之升高，顯示五味子多酚具有良好的抗氧化活性。