林 瑞，杜秋旻，李永春，閆美霖，何家麗，苗晶囡，徐 丹，邱軍強(qiáng) (海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 570100)

黃藥子為薯蕷科薯蕷屬植物黃獨(dú)(DioscoreabulbiferaL)的塊莖，在我國(guó)的海南島主要分布于崖縣、保亭、東方、澄邁和瓊海等地[1-2]。唐代《千金·月令》最早記載：“以萬州黃藥子浸酒可治癭疾”；而在《開寶本草》中則記載著：“主諸惡腫瘡瘺、喉痹、蛇犬咬毒”；《本草綱目》將其功效則記錄為：“涼血降火、消癭解毒”；《海南植物志》所收載的功效為：“零余薯，具有止血、去毒的功用，可治疝氣、腰痛”?！冬F(xiàn)代中藥大辭典》描述為：“臨床常用黃藥子單、復(fù)方制劑治療食道癌、胃癌、直腸癌和甲狀腺癌等多種癌癥，為當(dāng)今治療癌癥的主要中藥之一”。其中黃獨(dú)乙素作為黃藥子的主要活性成分之一，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的增殖均具有抑制作用[3-5]。因其具有廣泛的藥理活性，對(duì)黃獨(dú)乙素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化具有重要意義。本研究采用超聲波提取法，利用超聲波的空化效應(yīng)有效提高黃獨(dú)乙素的得率，縮短提取時(shí)間[6-7]。同時(shí)借助響應(yīng)面法優(yōu)化法確定料液比、提取時(shí)間和超聲提取次數(shù)等因素，從而得到黃獨(dú)乙素的最佳提取條件，旨在為后續(xù)的黃獨(dú)乙素相關(guān)研究中提供理論依據(jù)。

1 儀器與試劑

百麗福-150中藥粉碎機(jī)(永康市敏業(yè)工貿(mào)有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，SB25-12DTD超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，高效液相色譜儀(美國(guó)Waters)，EYELA-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)。

黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于南京源植生物科技有限公司，黃藥子飲片購(gòu)于?？谟谰刺盟帢I(yè)，無水乙醇、甲醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取10 mg黃獨(dú)乙素標(biāo)準(zhǔn)樣品，甲醇溶液定容至100 mL，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)樣品母液。將母液進(jìn)行稀釋，依次配成濃度為4、6、8、10、12、14和16 mg/L的10 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取5 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液通過高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，采用Symmetry C18(150 mm×3.9 mm,5 μm)，以甲醇-水-磷酸(40∶60∶0.08)為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm[8-9]。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，取其平均值。結(jié)果分別以黃獨(dú)乙素濃度(mg/L)、峰面積為X軸和Y軸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出回歸方程和回歸系數(shù)?；貧w方程為Y=502 800X+13.202，R2=0.999 2，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，可用于測(cè)定待測(cè)物質(zhì)中黃獨(dú)乙素的含量。

2.2 樣品中黃獨(dú)乙素的含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取貯藏備用的黃藥子粉加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，混合均勻后置于超聲環(huán)境下進(jìn)行提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，用容量瓶定容到一定體積，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的檢測(cè)方法測(cè)定其中的黃獨(dú)乙素含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。計(jì)算黃獨(dú)乙素的得率[10]。

2.3 黃獨(dú)乙素的提取工藝優(yōu)化

2.3.1乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響

分別研究乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%、15%、20%、35%、40%、55%、60%、75%、80%、90%，固定料液比(g/mL)為1∶80、提取次數(shù)為3次、超聲時(shí)間為5 h的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響。結(jié)果表明不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率有一定影響，但乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃獨(dú)乙素得率達(dá)到最大值。因此選擇最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.2料液比對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響

分別研究料液比(g/mL)為1∶10、1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160和1∶180，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取次數(shù)為3次、超聲時(shí)間為5 h的條件下，考察料液比對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響。結(jié)果表明，隨著料液比的增加，黃獨(dú)乙素的得率也在不斷增加，當(dāng)料液比(g/mL)為1∶60時(shí)就達(dá)到了峰值，之后再增加料液比對(duì)黃獨(dú)乙素得率的提高沒有太大影響。推測(cè)可能溶劑的增加，使得黃藥子中一些可溶性的化學(xué)成分溶解量也逐漸增加，從而對(duì)黃獨(dú)乙素的提取有一定的影響[11]。所以在后續(xù)的研究中，最后選擇最佳的料液比(g/mL)為1∶60。

2.3.3提取次數(shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響

分別研究提取次數(shù)為1、2、3、4、5、6、7次，固定料液比(g/mL)為1∶80、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、超聲時(shí)間為5 h的條件下，考察提取次數(shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響。結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響相對(duì)較小，提取3次后黃獨(dú)乙素得率已達(dá)到穩(wěn)定，再增加提取次數(shù)，其得率也沒有明顯的提高。因此，選擇最佳提取次數(shù)為3次[11]。

2.3.4超聲提取時(shí)間對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響

分別研究超聲提取時(shí)間為1、2、3、4、5、6和7 h，固定料液比(g/mL)為1∶80、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、提取次數(shù)為3次的條件下，考察超聲提取時(shí)間對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響。結(jié)果表明，在超聲提取時(shí)間2 h之前，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，黃獨(dú)乙素的得率不斷增加，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到5 h以后，黃獨(dú)乙素的得率增加的較為緩慢。因此考慮提取成本和實(shí)際情況，選擇最佳提取時(shí)間為5 h[12]。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，由于乙醇濃度對(duì)黃獨(dú)乙素的得率影響呈現(xiàn)一定的規(guī)律性變化，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃獨(dú)乙素的得率達(dá)到最高，乙醇體積分?jǐn)?shù)過低或者過高均不利于黃獨(dú)乙素的提取[13]。因此后期單因素試驗(yàn)固定提取黃獨(dú)乙素的乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

通過Design-export軟件并根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)方案優(yōu)化提取工藝。其中響應(yīng)值為黃獨(dú)乙素的得率，自變量為提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比，對(duì)黃獨(dú)乙素的提取工藝作進(jìn)一步優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平見表1。

表 1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

2.4.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以黃藥子中黃獨(dú)乙素的得率(Y)為響應(yīng)值，以提取次數(shù)(A)、提取時(shí)間(B)與料液比(C)3個(gè)因素為自變量，利用Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面進(jìn)行試驗(yàn)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果見表2。

表 2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Design-export軟件對(duì)建立的黃獨(dú)乙素得率響應(yīng)面回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3所示。模型的F值和P值分別為5.24和0.0201，P<0.05，達(dá)到顯著水平；方差分析失擬項(xiàng)為0.072，差異不顯著；R2=0.867 6，說明該試驗(yàn)?zāi)茌^好的反映真實(shí)情況以及各因素與黃獨(dú)乙素得率的聯(lián)系。表3中對(duì)回歸模型系數(shù)的顯著性結(jié)果分析顯示，二次項(xiàng)A2、B2、C2系數(shù)的顯著性均小于0.05，且C2系數(shù)的顯著性小于0.01，對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響顯著，表明A2、B2和C2對(duì)于最終的提取結(jié)果影響顯著。三個(gè)影響因素對(duì)黃藥子中黃獨(dú)乙素的提取影響大小順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)<提取時(shí)間<料液比。

表 3 響應(yīng)面回歸模型方差分析和回歸分析結(jié)果

圖1和圖2是提取次數(shù)、提取時(shí)間和料液比對(duì)響應(yīng)值黃獨(dú)乙素得率的等高線圖和響應(yīng)面圖。等高線圖均趨于扁圓形，表明這些因素之間的交互作用較為顯著；反之，如果等高線圖為圓形，則表示這些因素之間的交互作用不顯著。同時(shí)響應(yīng)面坡度的陡峭程度，表明不同因素水平的改變對(duì)響應(yīng)值影響的大小。三維圖中的坡度越陡，表示該因素條件對(duì)黃獨(dú)乙素得率的響應(yīng)值影響越大。

結(jié)果表明，交互項(xiàng)提取次數(shù)和提取時(shí)間、提取次數(shù)和料液比、提取時(shí)間和料液比的等高線都接近扁圓，AC交互作用所形成的扁圓趨勢(shì)更加明顯，說明AC交互作用更加顯著，其次為BC，最后為AB。在AC和BC的3D圖中可知(見圖2)，與A和B方向比較，C響應(yīng)面曲線較陡；在AB的3D圖中可知，B響應(yīng)面曲線較A的陡。以上可得出，響應(yīng)面分析結(jié)果與回歸模型顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果是一致的。

圖 1 因素交互作用對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響2D圖

圖 2 交互作用對(duì)黃獨(dú)乙素得率的影響3D圖

2.4.2驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面法得到黃獨(dú)乙素最優(yōu)提取工藝條件為：提取次數(shù)3次、提取時(shí)間5 h和料液比(g/mL)為1∶65，在這個(gè)條件下，黃獨(dú)乙素得率最高，達(dá)0.377%。為了驗(yàn)證所建立模型的準(zhǔn)確性，按照以上條件對(duì)黃獨(dú)乙素進(jìn)行實(shí)際提取，平行進(jìn)行3次，測(cè)得黃獨(dú)乙素的得率為(0.378±0.02)%，和預(yù)測(cè)值接近，表明優(yōu)化方法和建立的模型準(zhǔn)確，可信任。

3 討 論

近年來，大量文獻(xiàn)報(bào)道了藥食同源天然產(chǎn)物活性成分，如多糖、花色苷、多酚、黃酮和揮發(fā)油等內(nèi)含物的提取均采用響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。同時(shí)在提取過程中通過輔助超聲波或者微波等提取技術(shù)進(jìn)行活性成分的提取，這些提取技術(shù)顯著提高了上述活性成分的提取效率。其中超聲波輔助提取法是通過超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的物理效應(yīng)和空化效應(yīng)，促進(jìn)提取液中所有化學(xué)物質(zhì)分子的振動(dòng)頻率增加，加速各類活性成分的溶出與提取，從而提高其提取效率[14-16]。

本研究以超聲波輔助提取技術(shù)對(duì)黃藥子中的黃獨(dú)乙素進(jìn)行提取工藝研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，從而優(yōu)化得到其最佳提取工藝。根據(jù)模型得出的最優(yōu)提取工藝條件為：提取次數(shù)3次、提取時(shí)間5 h和料液比(g/mL)1∶65，此時(shí)黃獨(dú)乙素的實(shí)際得率為(0.378±0.02)%。最優(yōu)提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，優(yōu)化方法和建立的模型準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。方差分析失擬項(xiàng)為0.072，差異不顯著，R2=0.867 6，表明該試驗(yàn)?zāi)茌^好的反映真實(shí)情況以及各因素與黃獨(dú)乙素得率的聯(lián)系，且優(yōu)化后的試驗(yàn)方法的得率大于各單因素試驗(yàn)的得率，說明該提取工藝是合理可行的。