周 陽, 米旭光, 蒲文星, 汪文濤, 景 猛, 孟繁凱

（1. 長春中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，吉林 長春 130117；2. 吉林省人民醫(yī)院中心實驗室，吉林 長春 130021；3. 吉林省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長春 130021）

重度腦損傷造成的神經(jīng)功能缺失一直是臨床治療中的重點和難點，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和社會回歸。氧化應激是活性氧類（reactive oxygen species，ROS）和氧自由基相對超負荷引起的細胞應激反應，是腦損傷發(fā)生發(fā)展的重要機制之一，也是神經(jīng)元細胞死亡的主要原因。大腦耗氧量高，而且腦組織富含脂質(zhì)，對氧化應激非常敏感［1］。研究［2-3］表明：當神經(jīng)細胞內(nèi)氧化/抗氧化的平衡被打破，神經(jīng)細胞內(nèi)過氧化物堆積，過量產(chǎn)生的ROS 直接攻擊神經(jīng)細胞生物膜，導致線粒體功能障礙、脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)和DNA 的氧化，神經(jīng)元細胞功能受損或發(fā)生凋亡。褪黑素主要由松果體分泌，是一種具有調(diào)節(jié)晝夜生理規(guī)律、抗炎、抗氧化、抗衰老和調(diào)節(jié)自身機體免疫等生理功能的胺類激素。研究［4-5］表明：褪黑素及其代謝衍生物具有很強的自由基清除特性，是ROS 和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）的有效抗氧化劑。研究［6-8］顯示：褪黑素抗氧化應激損傷與提高細胞自噬能力有關，神經(jīng)細胞對細胞碎片和一些老化蛋白質(zhì)的清除主要是通過自噬作用完成，細胞自噬功能障礙與神經(jīng)細胞損傷進展密切相關，但機制尚不清楚。本研究主要以過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2） 誘導神經(jīng)母細胞瘤株（SH-SY5Y） 細胞氧化應激損傷，檢測細胞增殖、凋亡、ROS 水平和自噬情況，探討褪黑素對H2O2誘導的SH-SY5Y 細胞氧化應激的研究損傷的影響，初步探討其相關機制，為褪黑素改善中樞神經(jīng)細胞氧化應激的研究提供實驗和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SH-SY5Y 細胞（吉林省人民醫(yī)院中心實驗室保存）；H2O2、褪黑素和2-苯基-N-乙酰色胺（Luzindole）（美國Sigma 公司），DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Gibco 公司），胰蛋白酶（+EDTA）和1%青霉素-鏈霉素溶液（100×）（北京全式金生物技術有限公司），細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）、Annexin Ⅴ-FITC 細胞凋亡試劑盒、ROS 檢測試劑盒和SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒（中國碧云天生物試劑公司），微管相關蛋白1 輕鏈3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3B，LC3B）、GAPDH、Anti-mouse IgG和Anti-rabbit IgG （美國Cell Signaling Technology公司），單丹磺酰戊二胺（monodansylcadaverine，MDC）（中國阿拉丁試劑公司），4%多聚甲醛（福州飛凈生物科技有限公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（型號3111）和流式細胞儀（型號A24863）（美國Thermo Fisher公司），凝膠成像儀（型號5500Multi，上海天能科技有限公司），手動倒置顯微鏡（型號DMI3000B）和Leica數(shù)碼攝像頭（型號DFC495，德國Leica公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)SH-SY5Y 細胞在含10% FBS 胎牛血清、1% 青霉素-鏈霉素溶液（10000 U·mL－1青霉素和10 g·mL－1鏈霉素） 的DMEM 完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。當細胞融合生長率達到80%～90%時使用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）傳代，取對數(shù)生長期生長狀況良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 CCK-8 法檢測各組SH-SY5Y 細胞存活率將SH-SY5Y 細胞分為對照組、H2O2組、不同濃度褪黑素組和Luzindole 組。選擇增殖活躍并處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y 細胞，以1×104L－1的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板上。對照組為正常培養(yǎng)的SH-SY5Y 細胞；H2O2組培養(yǎng)24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μL 含有200 μmol·L－1H2O2的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；不同濃度褪黑素組加入100 μL 含有不同濃度（1、5 和10 μmol·L－1）褪黑素的培養(yǎng)基預處理24 h 后，棄去舊培養(yǎng)基，加 入100 μ L 含 有200 μmol·L－1H2O2的 培 養(yǎng) 基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；Luzindole 組加入100 μL含有50 μmol·L－1Luzindole 的培養(yǎng)基處理1 h 后，加入含有100 μL 含有10 μmol·L－1褪黑素的培養(yǎng)基預處理24 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入100 μ L 含有200 μmol·L－1H2O2的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每組設5 個復孔，檢測前每孔加入CCK-8 試劑10 μL，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后，使用酶標儀記錄450 nm 波長處各孔的吸光度（A）值，計算各組細胞存活率。細胞存活率=處理組A 值/對照組A 值×100%。實驗重復3 次。

1.4 DCFH-DA 熒光探針檢測各組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平SH-SY5Y 細 胞 以1×106L－1的 密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中。按照“1.3”步驟中方法進行分組及給藥，各組細胞處理完畢后，按照1∶1000 采用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol·L－1，各孔加入DCFH-DA 于37 ℃繼續(xù)孵育30 min，每隔5 min 顛倒混勻，孵育結束收集懸浮細胞，采用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分洗去未進入細胞的DCFH-DA，再用500 μL無血清培養(yǎng)基重懸細胞，立即采用流式細胞儀檢測。以相對平均熒光強度值表示細胞中ROS 水平。

1.5 流式細胞術檢測各組SH-SY5Y 細胞凋亡率SH-SY5Y 細胞以1×106L－1的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中。按照“1.3”步驟中方法進行分組及給藥，處理完畢后，各組細胞檢測前采用4 ℃預冷的PBS 緩沖液洗滌2 次，隨后加入不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并且收集細胞。加入1×AnnexinⅤ結 合 緩 沖 液1 mL，500 r·min－1離 心5 min 后棄上清，加入結合緩沖液195 μL 重懸細胞。并在懸液中加入Annexin-Ⅴ-FITC 10 μL 和PI 5 μL，混勻后37 ℃避光孵育15 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。右下象限表示早期凋亡細胞（Annexin Ⅴ-FITC+/PI－），右上象限表示晚期凋亡細胞（Annexin Ⅴ-FITC+/PI+）。細胞凋亡率＝早期凋亡率＋晚期凋亡率。

1.6 Western blotting 法檢測各組SH-SY5Y 細胞中微管相關蛋白輕鏈3-Ⅱ（microtubule-associated protein light chain3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）蛋 白 表 達水平SH-SY5Y 細 胞 以1×106L－1的 密 度 接種 于6 孔細胞培養(yǎng)板中。按照“1.3”步驟中方法進行分組及給藥，各組細胞處理完畢后，待檢細胞加入RIPA細胞蛋白裂解液100 μL，提取細胞總蛋白，采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA） 法測定蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE 凝膠，經(jīng)過上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，加入一抗過夜孵育。次日經(jīng)TBST 洗脫抗體后，加入二抗室溫下孵育2 h，再用TBST 漂洗3 次。最后將膜浸泡于顯影液中顯影曝光，凝膠成像分析儀中采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析蛋白灰度值，計算LC3-Ⅱ蛋白表達水平。LC3-Ⅱ蛋白表達水平=LC3-Ⅱ蛋白條帶灰度值/LC3-Ⅰ蛋白條帶灰度值。

1.7 MDC 染色檢測各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度SH-SY5Y 細胞以1×106L－1的密度接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中。按照“1.3”步驟中方法進行分組及給藥，各組細胞處理完畢后，采用MDC（50 μmol·L－1）染色，37 ℃孵育30 min。孵育后，PBS 緩沖液洗滌1 次，4%多聚甲醛固定。固定后，采用熒光顯微鏡對樣品進行觀察分析，激發(fā)波長335 nm，發(fā)射波長525 nm。采用Image Pro Plus 6.0 軟件分析各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度，計算細胞自噬泡熒光強度。細胞自噬泡熒光強度=各組熒光值/對照組熒光平均值。

1.8 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism Version 8.0 軟件和Image Pro Plus 6.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。各組SH-SY5Y 細胞存活率和凋亡率、ROS 水平、LC3-Ⅱ蛋白表達水平及自噬泡熒光強度符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組SH-SY5Y 細胞存活率與對照組比較，H2O2組SH-SY5Y 細胞存活率降低（P＜0.01）。與H2O2組比較，不同濃度褪黑素組細胞存活率均升高（P＜0.05）。與10 μ mol·L－1褪 黑 素 組 比 較，1 μmol·L－1褪黑素組和Luzindole 組SH-SY5Y 細胞存活率降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組SH-SY5Y 細胞的存活率Tab. 1 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups(n=5，±s，η/%）

表1 各組SH-SY5Y 細胞的存活率Tab. 1 Survival rates of SH-SY5Y cells in various groups(n=5，±s，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05 vs H2O2 group；#P＜0.05 vs 10 μmol·L－1 melatonin group．

Group Control H2O2 Melatonin 1 μmol·L－1 5 μmol·L－1 10 μmol·L－1 Luzindole Survival rate 100.00±2.8554.64±5.85*61.32±4.28△#65.93±1.10△67.72±2.29△57.72±2.48△#

2.2 各組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平與對照組比較，H2O2組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平升高（P＜0.001）。與H2O2組比較，不同濃度褪黑素組細胞中ROS水平均降低（P＜0.01）。與10 μmol·L－1褪 黑 素 組 比 較， 1 和5 μmol·L－1褪 黑 素 組 及Luzindole 組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平明顯升高（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖1 和表2。

表2 各組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平Tab. 2 ROS levels in SH-SY5Y cells in various groups(n=3，±s，η/%）

表2 各組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平Tab. 2 ROS levels in SH-SY5Y cells in various groups(n=3，±s，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs H2O2 group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 10 μmol·L－1 melatonin group．

Group Control H2O2 Melatonin 1 μmol·L－1 5 μmol·L－1 10 μmol·L－1 Luzindole ROS level 1.80±0.5475.37±5.87*66.19±0.68△△#57.50±0.71△△#52.50±2.17△△62.33±2.20△##

圖1 流式細胞術檢測各組SH-SY5Y 細胞中ROS 水平Fig.1 ROS levels in SH-SY5Y cells in various groups detected by flow cytometry

2.3 各組SH-SY5Y 細胞凋亡率與對照組比較，H2O2組SH-SY5Y 細 胞 凋 亡 率 升 高（P＜0.01）。與H2O2組比較，不同濃度褪黑素組細胞凋亡率明顯降 低（P＜0.05 或P＜0.01）。與10 μmol·L－1褪 黑 素 組 比 較， 1 和5 μmol·L－1褪 黑 素 組 及Luzindole 組SH-SY5Y 細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖2 和表3。

圖2 流式細胞術檢測各組SH-SY5Y 細胞的凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups detected by flow cytometry

表3 各組SH-SY5Y 細胞凋亡率Tab. 3 Apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups(n=3，±s，η/%）

表3 各組SH-SY5Y 細胞凋亡率Tab. 3 Apoptotic rates of SH-SY5Y cells in various groups(n=3，±s，η/%）

*P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs H2O2 group；#P＜0.05 vs 10 μmol·L－1 melatonin group．

Group Control H2O2 Melatonin 1 μmol·L－1 5 μmol·L－1 10 μmol·L－1 Luzindole Apoptotic rate 2.84±0.6950.85±1.69*47.13±1.29△#46.34±1.31△#32.52±1.66△△43.02±2.40△△#

2.4 各組SH-SY5Y 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達水平與對照組比較，H2O2組SH-SY5Y 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高（P＜0.01）。與H2O2組比較，不同濃度褪黑素組SH-SY5Y 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高（P＜0.01）。與10 μmol·L－1褪黑素組比較，1 和5 μmol·L－1褪黑素組及Luzindole組SH-SY5Y 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達水平降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測各組中SH-SY5Y 細胞中LC3-Ⅱ蛋白表達電泳圖（A）和直條圖（B）Fig. 3 Electrophoregram（A）and histogram（B）of LC3-Ⅱprotein expressions in SH-SY5Y cells in various groups detected by Western blotting method

2.5 各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度與對照組比較，H2O2組SH-SY5Y 細胞熒光強度升高（P＜0.05）。與H2O2組比較，10 μmol·L－1褪黑素組SH-SY5Y 細胞中熒光強度升高（P＜0.05）。與10 μmol·L－1褪黑素 組比較，1 μmol·L－1褪黑 素組和Luzindole 組SH-SY5Y 細胞中熒光強度降低（P＜0.05）。見圖4 和表4。

表4 各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度Tab. 4 Fluorescence intensities of autophagy vacuoles in SH-SY5Y cells in various groups (n=3，±s）

表4 各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度Tab. 4 Fluorescence intensities of autophagy vacuoles in SH-SY5Y cells in various groups (n=3，±s）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs H2O2 group；#P＜0.05 vs 10 μmol·L－1 melatonin group．

Group Control H2O2 Melatonin 1 μmol·L－1 5 μmol·L－1 10 μmol·L－1 Luzindole Fluorescence intensity 1.00±0.181.67±0.27*1.91±0.24*#2.46±0.51*2.69±0.43△1.89±0.21#

圖4 各組SH-SY5Y 細胞自噬泡熒光強度(Bar=50 μm)Fig.4 Fluorescence intensities of autophagy vacuoles in SH-SY5Y cells in various groups(Bar=50 μm)

3 討論

重度腦損傷會產(chǎn)生一定程度數(shù)量的ROS 及氧自由基，引起神經(jīng)元細胞的氧化應激損傷或凋亡［9］。H2O2在細胞內(nèi)可以進一步轉(zhuǎn)變成活性更強的羥自由基，已被廣泛用于多種不同類型的細胞中誘導氧化應激［10］，通過破壞細胞內(nèi)分子（DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)），導致神經(jīng)元細胞凋亡和壞死［11］。褪黑素具有強親脂性抗氧化和清除自由基的作用，可以有效地降低在自由基生成條件下引起的分子損傷［12-13］。研究［14］表明：褪黑素能逆轉(zhuǎn)H2O2和1-甲基-4-苯基吡啶離子（1-methyl-4-pehnyl-pyridine，MPP+） 對SH-SY5Y 細胞活力毒性的影響，因此研究褪黑素抵抗神經(jīng)細胞氧化應激損傷的機制具有重要意義。

本研究結果顯示：加入H2O2后SH-SY5Y 細胞的存活率下降，并且H2O2加入后SH-SY5Y 細胞中ROS 水平明顯升高。上述結果表明：H2O2通過誘導SH-SY5Y 細胞發(fā)生氧化應激損傷，降低細胞存活率。而褪黑素處理SH-SY5Y 細胞后，可恢復H2O2抑制的細胞存活率，且呈劑量依賴性。同時褪黑素可下調(diào)H2O2提高的ROS 水平和細胞凋亡率。上述結果表明褪黑素通過抑制H2O2引起氧化應激損傷，改善SH-SY5Y 細胞存活率。

目前普遍認為，ROS 和RNS 是維持細胞自噬的主要細胞內(nèi)信號傳感器，所有細胞來源的ROS均通過激活自噬和細胞凋亡等機制保證組織在氧化應激損傷中的存活［15-17］。自噬是一種細胞應對壓力條件的溶酶體降解過程，可去除改變的蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的細胞器，以維持細胞穩(wěn)態(tài)［18］。而在壓力情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)環(huán)境受損導致蛋白質(zhì)成熟受損，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激源可以調(diào)節(jié)自噬，自噬反過來誘導細胞存活或死亡［19］。褪黑素具有抗氧化和抗炎作用，可以調(diào)節(jié)細胞凋亡和細胞自噬［20-21］。研究［22］顯示：褪黑素可調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激過程的許多靶點，其除了起抗氧化和抗細胞凋亡作用以及抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激外，還可誘導與兔出血性疾病病毒感染相關的自噬，減少并抑制病毒RNA 復制。在小鼠實驗中，褪黑素能通過增強小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的自噬途徑，減輕小鼠繼發(fā)性腦損傷［23］。本研究結果顯示：隨著褪黑素濃度的增加，自噬關鍵蛋白LC3-Ⅱ表達水平逐漸升高，自噬泡熒光強度逐漸增加，表明褪黑素可激活SH-SY5Y 細胞自噬。

為了驗證褪黑素是否通過自噬改善SH-SY5Y細胞存活率，本研究采用了一種非選擇性褪黑素受體拮抗劑Luzindole。有研究［24］顯示：褪黑素通過阻斷ROS 積累和p53/ERK/p38 激活在鐵過載誘導的成骨分化功能障礙及衰老過程中發(fā)揮保護作用，而這種保護作用可以被Luzindole 消除。另外，褪黑素通過激活SIRT6 和AMPK-PGC-1α-AKT 信號通路增強線粒體自噬，減輕糖尿病心肌病并降低心肌對缺血再灌注損傷的易感性，而Luzindole 能抑制褪黑素的保護作用［25］。本研究結果證實：加入Luzindole 后，褪黑素對SH-SY5Y 細胞的存活率升高、凋亡率降低、ROS 水平降低、自噬激活的作用均被減弱。這些結果表明：褪黑素通過激活SHSY5Y 細胞自噬，抵抗H2O2引起氧化應激損傷，改善SH-SY5Y 細胞存活率。

綜上所述，褪黑素能促進H2O2誘導的SHSY5Y 細胞的增殖，降低細胞凋亡，提示褪黑素在神經(jīng)元細胞氧化應激損傷過程中具有重要的保護作用，其機制可能與調(diào)節(jié)細胞中ROS 水平，提高神經(jīng)細胞自噬水平有關。