田 悅, 陳慧珊, 張佩佩, 申玉芹

（吉林大學口腔醫(yī)院牙周科，吉林 長春 130021）

牙周炎是一種由細菌感染引起的牙周組織慢性非特異性炎癥疾病，是導致成年人失牙的主要原因。當感染和炎癥突破牙齦上皮組織和結締組織，蔓延至深部的牙周組織時，會引起牙齦和牙周膜膠原纖維溶解破壞以及牙槽骨吸收，導致牙周袋的形成。感染和炎癥若不受控制繼續(xù)發(fā)展則會使牙周袋進一步加深，甚至達到牙根根尖處，最終造成牙齒的松動和脫落。針對牙周炎的治療主要圍繞菌斑清除、感染控制以及療效的維護進行，如潔治、刮治、根面平整（scaling and root planning， SRP）和局部藥物的應用，臨床目標是停止牙周組織的破壞和長期保存牙齒，而使受損的牙槽骨等牙周組織進行生理性和功能性的再生是牙周修復治療的關鍵。

血管內皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF） 作為一種促進血管生成的細胞因子，參與包括牙周炎在內的許多血管生成依賴性疾病的發(fā)生發(fā)展［1-2］。一方面，牙周炎癥的進展過程中往往伴隨著新生血管的形成，炎癥組織可以使各種炎性因子表達升高，調節(jié)新生血管的形成，而新生血管形成的同時又能使炎性細胞與因子可直接到達炎癥部位加重炎癥程度，并為炎癥的肉芽組織提供氧氣和營養(yǎng)物質，使炎癥反應長期存在。新生血管又使內皮表面積增加，為細胞因子、黏附分子以及其他促炎因子產物提供更大的底物潛能。另一方面。VEGF 與牙周病炎癥的消退和修復具有相關性，其通過細胞募集使得牙周相關細胞借由新生血管到達損傷部位，并聯(lián)合其他細胞因子和生長因子發(fā)揮協(xié)同作用，促進牙周組織再生。目前VEGF 的研究因其在血管生成過程中的重要意義，集中在癌癥或其他疾病的病理過程中，在牙周炎中的作用研究多呈現在牙周炎經治療后的VEGF 表達水平的變化。國內有VEGF 在牙周組織中的表達與作用的相關報道，但并未有VEGF 促進牙周組織再生作用的描述，現針對VEGF 在牙周組織再生過程中的作用、作用機制及其在牙周組織再生中的應用進行探討，旨在為VEGF 用于調控牙周組織再生奠定基礎。

1 VEGF 的生物學特性

VEGF 是一種有效的促血管生成因子，具有促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用。VEGF 基因位于人類6p21.3 染色體上，全長14000 bp，是VEGF /血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor， PDGF）基因家族中的一部分，也稱為胱氨酸結生長因子超家族。VEGF 是一種相對分子質量為40000 的異二聚體糖蛋白，其蛋白質結構中某些雙硫鍵居于不同位置，其中包含胱氨酸結基序。

人類VEGF 家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F 和胎盤生長因子（placental growth factor， PLGF） 以及近期新發(fā)現的內分泌腺衍生的血管內皮生長因子（endocrine gland-VEGF， EG-VEGF） 等多個成員［3］，不同成員在體內執(zhí)行不同的功能。

與VEGF 進行特異性結合的具有高親和力的酪氨酸激酶受體稱為血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR），主要分為3 類：VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3。VEGFR-1 和VEGFR-2 主要分布于腫瘤血管內皮表面， 調節(jié)腫瘤血管的生成；VEGFR-3 主要分布于淋巴內皮表面，與淋巴管密度有關，調節(jié)腫瘤淋巴管的形成。VEGF 與VEGFR 的結合受到新血管發(fā)生的調節(jié)。VEGF 與VEGFR 結合后，受體自身磷酸化，從而激活了多種細胞內信號通路，誘導血管內皮細胞增生，促進新生血管形成。

2 VEGF 的成血管-成骨耦合作用

VEGF 在促進新生血管形成過程中扮演著重要角色，同時也與骨的形成和再生過程密不可分［4］。一方面，VEGF 自身作用于成骨細胞上，促進成骨細胞的趨化、增生與分化；另一方面，VEGF 能調節(jié)人間充質干細胞（human mesenchymal stem cells， hMSCs） 或 內 皮 祖 細 胞 （endothelial progenitor cells， EPCs） 向 成 骨 細 胞 的 分 化。VEGF 將成血管作用和成骨作用緊密串聯(lián)起來，使新生血管的形成參與到骨形成過程中，血管中的血液為骨組織輸送氧氣和營養(yǎng)物質，轉運代謝產物，起到了營養(yǎng)作用。在骨骼受創(chuàng)或骨折發(fā)生后，骨組織會處在炎癥所造成的缺氧環(huán)境中，其恢復需依賴血管生成和骨生成的耦合［5-6］，通過膜內成骨或軟骨內成骨的方式愈合。VEGF 在這種耦聯(lián)過程中起重要作用：在受傷的骨組織附近，大量的血管迅速形成并通過血液轉運來各種不同的細胞因子參與炎癥反應，VEGF 在其中高水平表達，促進周圍血管向骨缺損區(qū)域侵入并新生血管，對骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells， BMSCs） 行趨化作用，使干細胞增生分化為成骨細胞，然后分泌類骨質，鈣化形成骨基質，最后形成骨化中心，在這過程中，成骨細胞又能分泌VEGF 等因子反作用于血管的調節(jié)。

3 VEGF 在牙周組織再生中的作用及其機制

VEGF 通過調節(jié)參與牙周組織再生的細胞增殖、遷移和分化等功能，在炎癥發(fā)生及骨損傷部位促進血管的新生，整合新生的牙周組織，促進牙周組織的修復再生。

3.1 VEGF 促進牙周組織再生的細胞增殖和遷移VEGF 可以促 進hMSCs、 牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）和成骨細胞的增殖及遷移能力［7-8］，以提升牙周組織再生效果。 VEGF-C 依賴于細胞外調節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK） 通路和局部黏著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）通路促進hMSCs 遷移。而hMSCs 自身釋放的VEGF 可以觸發(fā)牙槽骨成骨細胞的趨化性。LEE 等［9］研究顯示：VEGF 對PDLSCs 和BMSCs的增殖均無顯著影響。但另一項研究［10］顯示：VEGF 可以呈時間依賴性地促進PDLSCs 增殖，在劃痕損傷愈合實驗中可促進細胞向創(chuàng)傷部位遷移，VEGF 還可顯著促進細胞黏附。

3.2 VEGF 促進牙周組織再生的細胞成骨分化VEGF 可以促進hMSCs 和PDLSCs 的成骨分化作用，從而增強牙周組織再生能力。VEGF-C 通過VEGFR-2 和VEGFR-3 介導，能誘導hMSCs 成骨分化，并激活ERK/Runt 相關轉錄因子2（Runtrelated transcription factor 2， RUNX2）信號通路［11］。BMSCs 和EPCs 共培養(yǎng)在含VEGF的復合支架中，應用于犬的下頜骨缺損［12］，VEGF 的持續(xù)遞送使層狀骨形成趨勢變大，可發(fā)生顯著的成骨作用。在小鼠皮下模型中植入含有BMSCs 的共聚物支架后，VEGF-A 的遞送可增強血管生成作用，但不足以促進成骨［13］。而LEE 等［9］對體外培養(yǎng)及植入小鼠皮下的PDLSCs 和BMSCs 進行觀察發(fā)現：堿 性 磷 酸 酶（alkaline phosphatase， ALP） 和Runx2 基因表達水平升高，VEGF 可促進PDLSCs和BMSCs 的成骨分化，并具有微弱的累加作用。在啟動成骨分化的過程中，VEGF 通常激活SMAD、 p38 絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）和磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K） /蛋白激 酶 B （protein kinase B， PKB/Akt） 等通路［14-19］。此外，VEGF還可通過YAP/TAZ 途徑，借由F-肌動蛋白促進轉錄共激活因子相關蛋白YAP的核定位［20］，從而促進BMSC 的 成 骨 作 用。

3.3 VEGF 促進骨缺損區(qū)域新生血管的形成VEGF 通過增強內源性內皮細胞和干細胞的遷移，使更多的血管在骨缺損部位形成［21］。由腺病毒單獨介導VEGF-A 基因表達的BMSCs 被接種于支架上植入小鼠皮下，可以增加局部的毛細血管樣或血管樣結構。犬下頜骨缺損中應用的BMSCs 和EPCs 共 培 養(yǎng) 支 架［12］，VEGF 的 加 入 使 得 缺 損 部 位毛細血管密度顯著增加。

3.4 VEGF 促進牙周組織的重建VEGF 可促進包括牙槽骨、牙周膜和牙骨質的牙周組織重建?？筕EGF 抗體貝伐單抗在小鼠牙槽骨形成過程中對血管形成抑制作用，研究［22］顯示：VEGF 被抗體中和后，骨膜蛋白的定位和表達水平改變，影響牙槽骨的形態(tài)發(fā)生，抑制血管、牙周膜和骨形成，從而使牙槽骨組織的整合遭到破壞。

4 牙周組織再生過程中VEGF 的表達水平

由于VEGF 對牙周組織再生相關細胞具有增殖和趨化等作用，且本身的促血管生成功能對炎癥疾病的發(fā)展有明顯影響，因此VEGF 的表達水平常被納入到對牙周炎治療效果的觀察中。

在牙周基礎治療及手術治療以促進牙周組織的修復再生研究中發(fā)現VEGF 水平可發(fā)生變化，如在對牙周基礎治療后患者血清和齦溝液中VEGF-A水平的研究［23］顯示：慢性牙周炎患者血清和齦溝液中VEGF-A 水平明顯高于健康對照個體，在接受包括口腔衛(wèi)生指導以及SRP 等非手術治療6 周后，VEGF-A 水平明顯降低，但探診深度（probing depth，PD）、臨床附著水平（clinical attachment level，CAL）和牙齦指數（gingival index，GI）等臨床指標均有所改善。對病情更嚴重的廣泛性侵襲性牙周炎患者進行4 周的定期潔治和SRP 后［24］，患者的臨床指標均有所改善，但患者齦溝液中VEGF 水平明顯高于健康對照組，與未治療時的齦溝液中VEGF 水平保持相對一致。而使用微創(chuàng)皮瓣反射（minimally invasive flap reflection， MIS）治療牙周組織缺損時，齦溝液中可內源性釋放VEGF，與傳統(tǒng)的開放式皮瓣清創(chuàng)術（open flap debridement，OFD） 療效比較發(fā)現：在愈合的早期階段，MIS 治療組VEGF 水平明顯高于OFD 治療組，經MIS 治療后9 個月患者PD 減少和CAL 明顯增加［25］。

自體皮質骨移植物（autogenous cortical bone graft，ACB） 與Ankaferd 止血劑（Ankaferd blood stopper，ABS）聯(lián)合應用治療骨內牙周缺損，缺損部位齦溝液中VEGF 水平明顯高于單純植骨組，血管生成和血管內皮細胞功能得到增強，ABS 的應用進一步加強了ACB 填充骨缺損的效果，促進了軟組織愈合，防止牙齦退縮，CAL 明顯升高［26］。將載有苯妥英鈉或硝苯地平的聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］微球用于大鼠上頜第一磨牙近中的牙周組織缺損處并壓實，以確保微球保持靜止并能重新分布，與傷口區(qū)域的牙周膜細胞立即接觸，結果顯示：VEGF-A 蛋白表達明顯升高，天狼星紅染色的Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col Ⅰ） 呈強陽性，骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN） 陽性表達增強，產生了廣泛的骨再生［27］。在大鼠雙側上頜第一磨牙近中處手術制造三壁骨缺損后應用釉質基質衍生物（enamel matrix derivative， EMD），VEGF 水平明顯升高，且當EMD 應用在牙周病模型的糖尿病大鼠中，VEGF 水平也明顯升高［19］，術后7 d 時軟組織傷口愈合良好，28 d 時可見狹窄的近中缺損處充滿了新形成的結締組織、牙骨質和骨組織。EMD能促進大鼠口腔黏膜手術傷口的愈合，處理過的部位顯示出血管密度升高，且VEGF mRNA 表達水平升高［19，28］。紫草素能促進人牙齦成纖維細胞增殖、遷移和細胞中VEGF mRNA 表達水平，1 μmol·L－1紫草素是刺激細胞增殖和遷移的最佳濃度，在該濃度紫草素作用下能明顯增加VEGF 的表達水平，誘導Col Ⅰ和纖連蛋白（fibronectin，FN）的產生，通過增強血管生成和牙齦結締組織的黏附促進傷口愈合［29］。阿司匹林增強PDLSCs成骨潛能的同時，VEGF-A 與VEGF-C mRNA 表達水平明顯升高［30］。骨膜素能促進PDLSCs 的增殖，增強成骨功能，VEGF 表達水平也隨之升高［31］。

光生物調節(jié)（photobiomodulation，PBM） 等非侵入性治療手段，在應用于牙周治療時能加速傷口愈合過程，提升VEGF mRNA 表達水平［32-33］。在評價近紅外低強度激光對PDLSCs 增殖、生存和成骨分化能力影響的實驗中，GHOLAMI 等［32］發(fā)現：PDLSCs 的增殖率未受影響，成骨分化能力得到提升，可在光學顯微鏡下觀察到礦物質沉積和礦化結節(jié)，且VEGF 具有較高的mRNA 表達水平。經炎癥細胞因子激發(fā)的牙齦成纖維細胞接受低水平激光治療（low-level laser therapy，LLLT）后，被抑制的牙齦成纖維細胞的遷移能力得到改善，細胞中VEGF mRNA 表達水平升高。

5 VEGF 在牙周組織再生中的應用

5.1 VEGF 與牙周支架的聯(lián)合應用目前，尋找有效的牙周再生支架材料是一個具有重要意義的研究方向。近年來，有關VEGF 和血管生成與支架材料促成牙周愈合的研究受到廣泛關注。一種應用于骨缺損愈合的薄層PLGA 涂層的β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate， β -TCP） 支 架， 能 使VEGF 包含其中并持續(xù)釋放，其在體外骨骼再生中顯示出良好的效果［34］。自組裝肽（self-assembling peptide， SAP） 納米纖維水凝膠被用作支架材料應用于手術產生的大鼠雙側第二磨牙的牙周缺損，SAP 水凝膠通過促進細胞募集和血管生成促進牙周組織缺損的愈合，VEGF 表達水平升高，在72 h內PDLSCs 增殖隨時間呈線性增加，術后4 周時可觀察到牙周膜樣膠原束和新的牙骨質狀結構薄層形成，類似于天然的牙周膜，較整齊地排列并傾斜插入牙根表面，并且骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的表達水平明顯升高，成骨細胞增殖分化，新骨形成［35］。MATSUGAMI 等［36］在 剝 離 了 大 鼠 上 頜 第一磨牙近中根的牙周膜、牙骨質和淺層牙本質后，將與短肽RADA16 結合的SAP 填充在缺損處，術后2 周通過Micro CT 法觀察，大鼠上頜骨缺損區(qū)域填充SAP 組較未填充SAP 組愈合效果更好，骨體積增高，骨小梁加厚，HE 染色結果顯示：填充SAP 的骨缺損區(qū)域有較好的愈合效果，先前的缺損區(qū)域內充滿了結締組織，靠近根端缺損部位有新骨形成，免疫組織化學染色發(fā)現新生結締組織內血管與骨組織周圍有大量VEGF 陽性細胞。

5.2 調節(jié)VEGF 的相關信號分子和通路促進牙周組織再生VEGF 能通過血管生成和細胞募集參與牙周組織的發(fā)育和重塑，因此調節(jié)有關VEGF 的信號分子可以促進牙周組織再生。與無支架材料條件下培養(yǎng)PDLSCs 的比較，mRNA-210 介導的三維羥基磷灰石陶瓷支架上培養(yǎng)的人PDLSCs 中VEGF釋放增加，成骨分化更為明顯，細胞外沉積明顯增加，骨生成相關標志物RUNX-2、ALP 和OPN 均上調［37］；通過刺激與miR-210 表達相關的細胞分泌VEGF 的能力，人PDLSCs 的黏附能力和增殖能力得到增強。采用CXCL12 基因轉導入PDLSCs，CXCL12 的過表達顯著刺激了VEGF mRNA 和蛋白表達水平，其還與VEGF 產生協(xié)同作用，增強PDLSCs 的血管生成潛力，使PDLSCs 形成更長的毛細管樣結構。在臨界顱骨缺損的大鼠模型中，CXCL12 能促進PDLSCs 的骨組織修復能力，Micro-CT 法檢查結果顯示：缺陷部位可見大量的板層狀骨質結構形成，從冠狀面和矢狀面能觀察到新骨膨脹并幾乎占據了整個骨缺損區(qū)域［38］。長鏈非編碼RNA FER1L4 的過表達能促進PDLSCs 的成骨分化，增加VEGF-A 表達，在裸鼠顱骨缺損實驗中，將具有FER1L4 過表達的PDLSCs 加載到PLGA 支架上植入缺損區(qū)域，缺損區(qū)域周圍形成新的膠原組織和骨組織， 與無FER1L4 組比較，FER1L4 過表達組新膠原纖維和骨組織的形成數量增 多， OCN 陽 性 表 達 的 范 圍 和 強 度 更 高［39］。FER1L4 的抑制劑則抑制上述過程：miR-874-3p 作為FER1L4 的抑制劑，直接靶向抑制STAT3 途徑，下調VEGF-A 表達，阻礙成骨作用。而FER1L4可以通過吸收miR-874-3p 參與PDLSCs 的成骨作用且上調VEGF-A 的表達，靶向調節(jié)VEGF-A 促進hPDLSCs 的成骨分化。對連接蛋白43 半通道（connexin 43 hemichannels， Cx43 HC） 的阻斷能上調VEGF-A 的表達［40］，在此過程中ATP 信號傳導被阻斷，ERK 1/2 信號通路被激活，最終促進牙齦傷口的愈合。EMD 通過PI3K/Akt/VEGF 途徑的調節(jié)使大鼠牙周缺損組織部位VEGF 表達水平升高［19］。紫草素通過ERK1/2 信號通路對人牙齦成纖維細胞產生影響，促進VEGF、ColⅠ和FN 的表達，對人牙齦成纖維細胞參與的傷口愈合產生增益效果［29］?？咕腖L37增加人PDLSCs中ERK1/2和核轉錄因子κB （nuclear factor-kappa B，NF-κB）p65 的磷酸化水平，誘導細胞中VEGF-A 的產生，促進血管生成的同時促進牙周組織再生［41］。

5.3 VEGF 與其他細胞因子的聯(lián)合應用在牙周炎癥消退和治愈的過程中，VEGF 不僅促進血管新生，還與通過血管聚集的各種細胞因子發(fā)生相互作用，協(xié)同促進牙周組織再生。轉化生長因子β（transforming growth factor-β， TGF-β） 是調節(jié)細胞生長和分化的多功能細胞因子，研究者利用過表達的特異性蛋白1（specificity protein 1， SP1） 增加TGF-β1 的表達水平，激活SMAD2 信號通路并加強了VEGF 的分泌，從而促進成骨細胞的血管生成［42］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （bone morphogenetic protein 2， BMP2）可以促進間充質細胞定向分化為成骨細胞，當BMP2 和VEGF 同時作用于前成骨細胞時，激活p38 MAPK 途徑，增加osterix 蛋白的核易位，增強骨誘導作用，進一步促進成骨細胞的分化與成熟［15］。牙周袋局限的空間容易形成缺氧環(huán)境，缺氧誘導因子1α （hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α） 由 絲 裂 原 細 胞 外 信 號 調 節(jié) 激 酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）/ERK 和p38 MAPK 途徑調控產生產生后，誘 導VEGF 參 與PDLSCs 成 骨 表 達 的 提 升［16-18］。在2% O2存在的低氧條件下，PDLSCs 的細胞活力、ALP 表達活性和VEGF 釋放水平均隨時間延長明顯升高，Runx2 和Sp7 mRNA 及蛋白表達水平較對照組明顯升高，且PDLSCs 的鈣化結節(jié)形成增加，在第5 天達到密度峰值。同時，缺氧介導前列腺素E2（prostaglandin E2， PGE2）和VEGF 的旁分泌作用能刺激PDLSCs 增殖及向成骨細胞分化。將胰島素樣生長因子1 （insulin-like growth factor-1，IGF-1）和VEGF 聯(lián)合應用于異種骨移植材料治療Ⅱ類骨壁缺損，在材料植入6 個月后可觀察到，與單純應用VEGF 比較，IGF-1 和VEGF 的聯(lián)合應用更能促進骨的再生，顯著改善牙周袋深度，增加CAL，測量垂直缺陷深度時可發(fā)現骨充盈量明顯改善，且未發(fā)生明顯的牙齦退縮情況［43］。而KAWAI 等［44］在MSCs 的條件培養(yǎng)基（conditioned media from MSCs，MSC-CM）中收集得到不同濃度的生長因子，包括IGF-1、VEGF、TGF-β1 和肝 細 胞 生 長 因 子 （hepatocyte growth factor，HGF），通過對大鼠MSCs 和在MSC-CM 中培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞 （human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）進行傷口愈合和血管生成的評估，RT-PCR 法檢測結果顯示：成骨和血管生成相關基因的表達水平明顯升高，并且在大鼠牙周缺損部位上植入含MSC-CM 的膠原蛋白海綿后觀察缺損部位牙周組織的再生情況，發(fā)現術后2周殘留骨中有少量骨再生，并且在新生骨質附近有細胞團積聚，MSC-CM 植入4 周后在缺損處可觀察到新生的骨組織表現出牙槽嵴樣結構，缺損處牙本質表面出現牙骨質樣結構，在牙骨質和新生骨之間還可見牙周膜狀結構。SAKAGUCHI 等［45］通過模仿MSC-CM 制作的細胞因子混合物（cytokine cocktail， CC） 包含IGF-1、VEGF-A 和TGF-β1，在體外實驗中，CC 促進了犬骨髓來源的MSCs 和牙周膜細胞的遷移，并促進HUVECs 的血管形成，體內實驗則將CC 用于犬的人造Ⅱ級根分叉病變部位，術后8 周，在缺損的全部區(qū)域均能觀察到新骨和牙骨質的形成，免疫組織化學染色可見在牙周膜周圍以及骨表面有血管性血友病因子（von Willebrand factor， vWF） 陽性細胞的管形成，顯示出CC 對血管生成以及新骨和牙骨質形成的促進作用。

6 總結與展望

牙周炎作為一種慢性感染性疾病，血管反應是其重要的中心環(huán)節(jié)。新生血管發(fā)生為破損的牙周組織帶來了修復和再生的機會［1，23］。VEGF 是重要的促血管生成因子，其在牙周組織再生過程中的表現受到關注。VEGF 對牙周炎有促進作用，但是足量的VEGF 可以激活血管內皮細胞，形成新生血管并增加血管通透性，趨化MSCs 向炎癥區(qū)域聚集，促進PDLSCs 等牙周相關細胞增殖、遷移和分化，同時促進成骨分化等細胞因子以及礦化所需的營養(yǎng)也能通過血管交通匯聚而來，這些表現表明其對損傷牙周組織具有修復能力。VEGF 在牙周炎癥組織中的水平上調現象可能使其成為評估牙周炎炎癥活躍程度的一種輔助指標。通過內源性地調節(jié)VEGF的表達水平、外源性地單獨給予VEGF，或與其他細胞因子聯(lián)合使用，VEGF 有望在這些途徑多方面地應用于牙周組織再生。