王 嘉 梁曉潔 高 暝 吳立文 趙耘霄 汪陽東 黃世清 張永志 傅火勇 陳益存

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 杭州 311400； 2.南京林業(yè)大學(xué) 南京 210037； 3.安吉縣龍山林場 湖州 313306)

植物枯萎病是一種土傳的真菌病害，已引起100多種植物栽培種發(fā)生枯萎病危害(Deanetal., 2012)。有一些植物種類或品種對枯萎病有顯著的抗性，可為防治該病提供思路。油桐(Vernicia)是我國傳統(tǒng)的重要化工油料樹種，已有幾千年的栽培歷史，由其種子提煉而得的桐油是一種優(yōu)質(zhì)干性油，廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、軍事及醫(yī)藥等領(lǐng)域。三年桐(Verniciafordii)是我國油桐的主栽品種，具有生長快、結(jié)實早、產(chǎn)量高的特征，但規(guī)?；N植面臨嚴重的枯萎病危害。油桐枯萎病又稱“桐瘟”，是由尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.fordii(Fof-1))引起的致死性土傳病害(Chenetal., 2016)。迄今油桐枯萎病已在我國8個省份90多個縣市爆發(fā)，對現(xiàn)有的近百萬公頃油桐林產(chǎn)生了嚴重威脅(楊素素等， 2014)。相比而言，同屬的千年桐(Verniciamontana)具有高抗枯萎病能力，但是生長緩慢、結(jié)實晚、產(chǎn)油量和質(zhì)量低(方嘉興， 2017)。目前，以千年桐為砧木、三年桐為接穗的嫁接油桐是防治枯萎病的有效方法。

隨著系統(tǒng)生物學(xué)的不斷完善和發(fā)展，利用轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)在植物抗病研究取得了重要進展。基于高通量測序的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已在植物抗病方面得到廣泛的應(yīng)用，如通過比較轉(zhuǎn)錄組分析了枯萎病菌侵染不同時期千年桐、三年桐差異表達基因的表達模式(Chenetal., 2016)； 利用轉(zhuǎn)錄組分析探索了楊樹(Populusspp.)受細菌性潰瘍病菌(Lonsdaleaquercina)誘導(dǎo)上調(diào)表達的關(guān)鍵基因(Houetal., 2016)。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)之后興起的一門新的組學(xué)技術(shù)，可以解決許多科學(xué)問題(Thévenotetal., 2015)。由于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)各有自身的優(yōu)缺點，通常對它們進行聯(lián)合分析對生物學(xué)問題進行解釋。如研究“鮑威爾”臍橙(Citrussinensis)對指狀擬青霉(Penicilliumdigitatum)侵染后的防御響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)鼠李糖、肌醇等代謝物的積累增強了臍橙對病菌侵染的抵抗力，通過茉莉酸和乙烯途徑以及增加ERFs、WRKYS和MYB等轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄豐度來觸發(fā)防御反應(yīng)，并且苯丙烷生物合成途徑也在轉(zhuǎn)錄水平上被激活(Tangetal., 2018)； 通過臍橙抗病突變體的代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)突變體中脂肪酸通路重定向，刺激茉莉酸的生物合成和信號傳導(dǎo)途徑而參與防御反應(yīng)(Heetal., 2018)。

本研究探討了三年桐和千年桐根部提取物對Fof-1生長是否有抑制作用，通過代謝組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析明確了千年桐根部抗枯萎病關(guān)鍵代謝物、響應(yīng)途徑及途徑中的關(guān)鍵基因，研究結(jié)果為闡明千年桐的抗枯萎病機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為三年桐、千年桐品種1年生實生苗，種源來自貴州獨山縣油桐主產(chǎn)區(qū)，種植于中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所后山溫室大棚。油桐病原菌Fof-1是實驗室前期從感枯萎病的三年桐根中分離并鑒定，由本課題組保留(Chenetal., 2016)。病原菌Fof-1采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，孢子制備采用合成低營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(SNA)。

1.2 三年桐、千年桐根部提取物對病原菌Fof-1的抑制作用差異

取生長良好的三年桐、千年桐幼根烘干后研磨過60目篩。分別稱取20 g烘干的樣品，用200 mL的95%乙醇超聲提取2 h，濾紙過濾后，再用100 mL無水乙醇超聲波提取1 h，用濾紙過濾后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，加水稀釋至30 mL，并用相同體積的乙酸乙酯萃取，有機樣分別蒸發(fā)濃縮到膏狀，用乙酸乙酯溶解至4 mL。將1 mL等量的油桐根部提取物母液均勻涂抹于PDA平板上，設(shè)置：千年桐母液、三年桐母液、乙酸乙酯(萃取劑)對照和純PDA對照。每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。將直徑5 mm圓形油桐枯萎病菌菌塊置于PDA平板中央。將平板放置在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。記錄菌落的生長情況和菌落直徑。采用十字交叉法測量菌落直徑并計算相對抑菌率(相對抑菌率=(對照菌絲生長直徑-處理菌絲生長直徑)/ 對照菌絲生長直徑×100%)。

1.3 病原菌Fof-1接種和樣本采集

取生長良好的Fof-1菌塊接種于SNA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7 天，配置2×106個·mL-1的尖孢鐮刀菌孢子懸浮液。挑取生長良好的三年桐、千年桐幼苗，將根表面土清洗干凈，然后將整個根系置于75%乙醇1 min，0.5%次氯酸鈉處理3 mins，90%酒精溶液浸泡30 s，無菌水沖洗3次。用大頭針將主根和側(cè)根輕輕劃幾個傷口后，在孢子懸浮液中浸泡30 min。將接種后的植株重新種植于無菌土中，放置于28 ℃的人工氣候箱中培養(yǎng)，濕度控制在90%左右，光照周期設(shè)置為16 h光照，8 h黑暗，光照強度為5 000 lx。三年桐和千年桐各處理30株，10株未感染植株作為對照。

根據(jù)枯萎病的癥狀，分別在第0、1、5和8天收集根系，液氮中速凍后保存在-80 ℃，三年桐和千年桐樣本分別被標(biāo)記為未侵染(F0； M0)、侵染早期(F1； M1)、侵染中期(F2； M2)和侵染晚期(F3； M3)。

1.4 根部次生代謝物提取及測定

選用Fof-1侵染后期的三年桐、千年桐根部樣品(F3，M3)及其3個生物重復(fù)，經(jīng)真空冷凍干燥，研磨至粉末狀； 稱取100 mg的粉末溶解于1 mL提取液(含有0.1 mg·L-1利多卡因(內(nèi)標(biāo))的70%的甲醇水溶液)中； 4 ℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率； 離心(轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，10 mins)后，吸取上清，用微孔濾膜(0.22 μm孔徑)過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜分析。

樣品在完成高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜代謝物檢測后，通過Analyst 1.6.1軟件打開“WIFF”格式的原始數(shù)據(jù)，用于定性和定量分析。過濾和去除多余的原始數(shù)據(jù)； 根據(jù)公共數(shù)據(jù)庫對代謝物進行定性分析，包括MassBank、KNAPSAcK、METLIN(Zhuetal., 2013)、MoTo DB和HMDB(Wishartetal., 2013)等； 為了確保定量分析的準(zhǔn)確性，對每個代謝物在三年桐和千年桐樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進行校正； 主成分分析(PCA)和(正交)偏最小二乘判別分析[(O) PLS-DA]； 基于(O) PLS-DA模型的變量投影重要性(Variable Importance in Project，VIP)，可以初步篩選三年桐和千年桐之間顯著不同的代謝物，結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值來進一步篩選出差異代謝物(VIP ≥ 1，差異倍數(shù) ≥ 2； 差異倍數(shù) ≤ 0.5)，并繪制火山圖和聚類熱圖。

1.5 病原菌Fof-1菌侵染后基因表達規(guī)律分析

1.5.1 cDNA文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序 利用北京艾德萊生物公司的植物RNA快速提取試劑盒對侵染前后不同時期的三年桐(F0，F(xiàn)1，F(xiàn)2，F(xiàn)3)、千年桐根部組織(M0，M1，M2，M3)進行RNA提取，通過微量分光光度計Q5000檢測RNA濃度及純度(OD260/OD280、OD260/OD230)，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳對RNA質(zhì)量進行進一步檢測。取質(zhì)檢合格的RNA樣品構(gòu)建cDNA文庫，在Illumina HiSeqTM2000上對cDNA文庫進行測序，測序策略為雙末端測序。

1.5.2 基因注釋和差異表達基因分析 將拼接好的轉(zhuǎn)錄本序列使用Blast算法(E值 ≤ 1e-5)在以下數(shù)據(jù)庫中進行基因注釋，包括Nr(NCBI non-redundant protein sequences)、Nt(NCBI non-redundant nucleotide sequences)、Swiss-Prot(A manually annotated and reviewed protein sequence database)、Pfam(Protein family)、KOG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)、GO(Gene Ontology)、KO(KEGG Ortholog database)。利用GENscan軟件對基因編碼區(qū)進行預(yù)測，得到編碼區(qū)的核酸序列和氨基酸序列。使用預(yù)測每千堿基的讀數(shù)/百萬位圖讀數(shù)據(jù)(Reads per kilobase per million mapped read，RPKM)分析轉(zhuǎn)錄本豐度，以評估基因表達水平。根據(jù)RPKM值，使用DESeq R軟件包查找差異表達基因(差異倍數(shù) ≥ 2,P< 0.05)。為明確Fof-1侵染過程中三年桐、千年桐的不同基因表達模式。根據(jù)差異表達基因的log2RPKM值進行了K-均值聚類分析，并對差異表達基因進行KEGG富集分析。

1.5.3 苯丙烷生物合成途徑的共表達網(wǎng)絡(luò)分析 利用R軟件包和加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)，選取加權(quán)截止值 > 0.50(weighted cut-off value)的基因去構(gòu)建苯丙烷類生物合成途徑中的基因網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件(https:∥cytoscape.org/download.html)對共表達網(wǎng)絡(luò)進行可視化。

1.6 實時定量PCR(qRT-PCR)驗證

使用Primer Premier 5.0對苯丙烷生物合成途徑中的4個關(guān)鍵基因的相應(yīng)序列的非保守區(qū)域設(shè)計了特異性引物。每個樣品進行3個獨立的生物學(xué)重復(fù)，并進行3次技術(shù)重復(fù)分析。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒的操作說明，在ABI7300實時定量儀器上以20 μL反應(yīng)體積進行qRT-PCR分析。擴增條件為95 ℃、30 s，然后在95 ℃ 40循環(huán)5 s，然后在60 ℃退火34 s。千年桐轉(zhuǎn)錄延伸因子1(TEF1)用作內(nèi)參以確定基因表達的正常性，并使用2-ΔΔCT方法計算基因的相對表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 千年桐根部化合物對Fof-1的生長具有明顯的抑制作用

與三年桐相比，千年桐根部提取物對Fof-1的生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，第5天抑制率達到最高，為43.2%； 在第9天，三年桐、千年桐根提取物的抑制率差異最大(圖1)。

2.2 千年桐根部黃酮類化合物在Fof-1侵染后含量上升

病原菌Fof-1侵染后的三年桐、千年桐樣品(M3，F(xiàn)3)經(jīng)UPLC和MS/MS代謝物檢測，共鑒定了622種已知代謝物，分為33類。在622種代謝產(chǎn)物中，8類代謝產(chǎn)物占據(jù)半數(shù)以上，包括有機酸(11.25%)，氨基酸衍生物(9.16%)，核苷酸及其衍生物(8.68%)，羥基肉桂?；苌?5.14%)，黃酮(4.98%)，脂質(zhì)甘油磷脂(4.98%)，黃酮醇(4.66%)和氨基酸(4.50%)。

圖1 三年桐、千年桐根部化合物對Fof-1的抑制作用差異

為了明確病原菌Fof-1侵染后三年桐、千年桐根部代謝物含量差異和變異度，進行PCA分析和(O)PLS-DA分析(Chenetal., 2009)。PCA分析結(jié)果如圖2A所示，通過觀察質(zhì)控樣品(mix1、mix2)之間的分散程度，可以確定儀器的穩(wěn)定性和可靠性，PCA結(jié)果表明，三年桐、千年桐的根部代謝物的含量差異明顯(圖2A)。同時，(O)PLS-DA分析可以最大程度地提高組間差異，有助于尋找差異代謝物(Thévenotetal., 2015)?；赑LS-DA模型的得分圖，進一步證明了三年桐、千年桐的根部代謝物含量差異明顯(圖2B)。

與三年桐相比，病原菌Fof-1侵染后千年桐根部有106種代謝產(chǎn)物含量上升(圖2C)。這些含量上升代謝物包括黃酮類物質(zhì)(黃酮、黃烷醇、異黃酮、黃烷酮、花青素、香豆素、香豆素和原花青素等32種化合物，占30.19%)，氨基酸衍生物(9種化合物，占8.49%)，核苷酸及其衍生物(8種化合物，7.55%)，奎寧酸鹽及其衍生物(7種化合物，6.60%)，羥基肉桂酰基衍生物(7種化合物，6.60%)等29類化合物。結(jié)果可見，黃酮類物質(zhì)占據(jù)最大比例，其中芒柄花苷(屬于異黃酮)和橙皮苷(屬于黃烷酮)的倍數(shù)變化分別達到2 026.26和1 185.52倍(表1)。進一步通過熱圖可以明顯看出，106種物質(zhì)在病原菌Fof-1侵染后的三年桐、千年桐根部含量有明顯差異(圖2D)。

圖2 枯萎病菌Fof-1侵染后三年桐、千年桐根部代謝組學(xué)分析

2.3 千年桐根部苯丙烷類合成途徑在Fof-1侵染后顯著富集

利用Blast算法(E-value≤1e-5)在6個公共數(shù)據(jù)庫(Nr，Pfam，KOG，Swiss-Prot，GO，KEGG)中，三年桐、千年桐共注釋了258 435和245 240個轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)RPKM值進行差異表達分析，三年桐、千年桐分別有20 031和6 366個差異表達基因。根據(jù)K均值聚類分析將這些差異表達基因分別劃分為20個表達模式。

當(dāng)植物受到病害脅迫發(fā)生生理和生化反應(yīng)之前，首先是基因表達的啟動。因此，病原菌侵染早期的基因應(yīng)答特別重要。對病原菌侵染早期的三年桐和千年桐(F1，M1)上調(diào)差異表達的基因進行分析，發(fā)現(xiàn)在三年桐和千年桐根部分別有7 015和1 986個(圖3A)。進一步KEGG通路富集分析表明，千年桐的1 986個差異表達基因顯著富集在以下7個途徑： 苯丙烷類生物合成，核糖體，其他聚糖降解，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解，乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝，煙酸和煙酰胺代謝，半乳糖代謝(P<0.05)(圖3B)。對于三年桐，7 015個差異表達基因顯著富集在以下9個途徑： 氧化磷酸化，代謝途徑，碳代謝，精氨酸生物合成，蛋白酶體，檸檬酸鹽循環(huán)，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，乙醛酸和二羧酸代謝，氨基酸的生物合成(P<0.05)(圖3B)。由以上結(jié)果分析，與抗病相關(guān)的苯丙烷類生物合成途徑只在病原菌Fof-1侵染早期的千年桐根部發(fā)生了響應(yīng)，在三年桐根部沒有發(fā)生響應(yīng)。

表1 千年桐根部Fof-1侵染后32種上調(diào)黃酮類化合物的信息

圖3 枯萎病菌Fof-1侵染后三年桐和千年桐根部基因表達分析及通路富集分析

2.4 千年桐根部苯丙烷類生物合成途徑在Fof-1侵染后上調(diào)響應(yīng)

代謝組學(xué)分析表明，在Fof-1侵染后期，千年桐的106種上調(diào)代謝產(chǎn)物中，黃酮類物質(zhì)占最大比例(32種化合物，占30.19%)。在大多數(shù)情況下，基因轉(zhuǎn)錄過程先于代謝過程發(fā)生。因此，在三年桐、千年桐的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中，將研究重點放在侵染早期(F1，M1)。與代謝組學(xué)結(jié)果一致，在Fof-1侵染早期，千年桐根部差異表達基因也富集到黃酮類生物合成途徑(P= 0.213 168)(圖3B)。苯丙烷類生物合成是黃酮類生物合成途徑的上游途徑，并由此產(chǎn)生各種化合物，包括黃烷酮、花青素、異黃酮等等(https:∥www.kegg.jp/kegg/pathway.html)，差異表達基因分析結(jié)果表明在侵染早期千年桐差異根部表達基因顯著富集到苯丙烷生物合成途徑中(P= 0.019 170 4)(圖3B)，但三年桐在侵染早期并未富集到上述途徑。

在侵染早期，千年桐差異表達基因共注釋到苯丙烷生物合成途徑中的差異表達基因有30個，包括4-香豆酸： CoA連接酶(4-coumarate: CoA ligase，4CL)，β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL)，咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)，過氧化物酶(peroxidase，POX)，反式肉桂酸4-單加氧酶(trans-cinnamate 4-monooxygenase)等編碼基因(表2)，千年桐中注釋到黃酮類生物合成途徑的差異表達基因有7個，包括黃酮類3-單加氫酶、咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeoyl-CoA O-methyltransferase，CCoAOMT)、反式肉桂酸4-單加氧酶、黃酮醇合酶(flavonol synthase，F(xiàn)LS)、柚皮素3-雙加氧酶等，其中2個咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因、1個反式肉桂酸4-單加氧酶基因(comp158232_c0；comp158238_c0；comp162378_c0)也是上述苯丙烷生物合成途徑中的基因。

2.5 千年桐根部苯丙烷生物合成途徑在Fof-1侵染后的基因互作網(wǎng)絡(luò)

利用WGCNA分析(加權(quán)截止值> 0.50)，發(fā)現(xiàn)與苯丙烷合成途徑相關(guān)的30個相關(guān)基因中，有4個是病原菌侵染后早期應(yīng)答的中心基因，包括4-香豆酸： CoA連接酶(4CL-like 7)編碼基因(comp164220_c0)，β-D-木糖苷酶(Xyl，β-D-xylosidase)編碼基因(comp163132_c0)，β-葡萄糖苷酶41(BGL 41)編碼基因(comp165691_c0)和過氧化物酶N1(POX N1)編碼基因(comp115360_c0)。這4個中心基因與其他1 625個基因具有極高的相關(guān)性(圖4A)。根據(jù)KEGG通路注釋，將1 625個基因分為5類，包括代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細胞處理和生物系統(tǒng)。其中，代謝途徑占最大比例(圖4B)。

表2 千年桐根部苯丙烷類生物合成途徑和黃酮類生物合成途徑的差異表達基因信息

圖4 枯萎病菌Fof-1后千年桐根部苯丙烷類生物合成途徑中的關(guān)鍵基因響應(yīng)其他基因的網(wǎng)絡(luò)分析

為探討在枯萎病菌Fof-1侵染后，千年桐根部顯著富集的苯丙烷類合成途徑中4個中心基因的表達變化，進行了qRT-PCR分析驗證。結(jié)果表明，千年桐根部4個中心基因CoA連接酶(4CL-like 7)編碼基因(comp164220_c0)、β-D-木糖苷酶(Xyl)編碼基因 (comp163132_c0)、β-葡萄糖苷酶41(BGL 41)編碼基因 (comp165691_c0)和過氧化物酶N1(POX N1)編碼基因 (comp115360_c0)均在病原菌Fof-1侵染早期表達量顯著升高(圖5)。這與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相一致(圖5)。

3 討論

3.1 黃酮類化合物與植物抗病的關(guān)系

由尖孢鐮刀菌引起的土傳真菌病害不僅對作物，對規(guī)?；N植的經(jīng)濟林木也造成了巨大的損失。油桐枯萎病對現(xiàn)有規(guī)?；N植的油桐林也造成了毀滅性破壞。三年桐是我國油桐主栽培品種，產(chǎn)量高、桐油品質(zhì)好，但易感枯萎病。相對于三年桐，千年桐產(chǎn)量低、桐油品質(zhì)次，但高抗枯萎病。千年桐抗枯萎病機制的研究對三年桐抗性育種有重要的指導(dǎo)意義。

植物自身產(chǎn)生的化合物對病原菌的防御起到了重要作用。苯丙烷及其衍生物是由維管植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，參與植物的許多生理活動，如生長、發(fā)育、繁殖和防御等，包括黃酮類化合物、簡單酚類、醌類等。其中，黃酮類物質(zhì)種類多、分布廣，具有豐富的生物學(xué)活性，對多種病原菌具有防御作用，黃酮類生物合成途徑基因的表達通過增加黃酮類產(chǎn)物從而增強植物對病原菌的抗性。本研究采用高效液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法對Fof-1侵染后的三年桐、千年桐根部樣本進行代謝組學(xué)分析，并篩選出32個黃酮類化合物，其含量在千年桐中顯著高于三年桐，初步推測這些黃酮類化合物可能在千年桐抗病中發(fā)揮作用。大量的研究表明，楊樹(Populusalba)中黃酮類途徑基因的表達可以增強楊樹對病原菌的抗性(Baietal., 2020)，黃酮類代謝相關(guān)基因的表達增強了大麥對禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)的抗性(Karreetal., 2019)，黃酮類途徑代謝流的增強可以增加苜蓿(Medicagosativa)對病原菌鐮刀菌(Fusariumoxysporumf. sp.medicaginis)的抗性(Gilletal., 2018)。炭疽菌(Colletotrichumsublineolum)侵染后高梁(Sorghum)會產(chǎn)生一種黃酮類物質(zhì)發(fā)揮拮抗作用(Duetal., 2010)； 從馬鈴薯(Solanumtuberosum)—洋蔥中提取的黃酮類化合物對枯萎病菌萌發(fā)及其生長也有明顯的抑制作用(Yangetal., 2019)； 苜蓿通過產(chǎn)生一種異黃酮物質(zhì)可以抵御銹病病原菌的侵染(Lietal., 2018)。

圖5 千年桐根部苯丙烷合成途徑4個中心基因響應(yīng)Fof-1侵染的qRT-PCR驗證

3.2 苯丙烷類和黃酮類生物合成途徑相關(guān)基因在抗病中的重要作用

在病原菌侵染早期，千年桐中共注釋到苯丙烷類和黃酮類生物合成途徑中的差異上調(diào)基因共有34個，其中許多基因已與植物抗病相關(guān)，如白云杉(Piceaglauca)β-葡萄糖苷酶(BGL)已被證實可以增強植物對云杉芽蟲(Choristoneurafumiferana)的天然抗性(Mageroyetal., 2015)； 咖啡酰-CoA O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)是植物中木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶，在馬尾松(Pinusradiata)中CCoAOMT可以調(diào)節(jié)木質(zhì)素的組成和含量(Wagneretal., 2011)，木質(zhì)素含量的增加具有抗生物脅迫和非生物脅迫的作用。植物過氧化物酶(POX)或其同工酶可以通過催化合成殺菌物質(zhì)、促進木質(zhì)素合成、參與乳突形成和顆粒狀沉積物的積累而構(gòu)成植物的抗病性，如馬鈴薯中POX可以增強對疫霉(Phytophthorainfestans)的抗性(Yangetal., 2020)、第3類過氧化物酶PRX34在擬南芥中表達增強了對細菌和真菌病原體的抗性(Zhaoetal., 2019)。絲氨酸羧肽酶(SCPs)具有?；D(zhuǎn)移酶功能，玉米(Zeamays)絲氨酸羧肽酶基因ZmSCP可以增強對水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)的抗性(Liuetal., 2013)。

千年桐根部在枯萎病病原菌Fof-1侵染后，黃酮類化合物含量增加，響應(yīng)的苯丙烷類生物合成途徑和黃酮類類生物合成途徑也顯著富集，上述途徑中4個中心基因在病原菌Fof-1侵染后也顯著上調(diào)。這4個中心基因中，4-香豆酸： CoA連接酶-7(4CL)是苯丙烷類生物合成途徑的限速酶，位于黃酮類化合物代謝途徑的重要分支或生物合成途徑的下游(Lietal., 2014)，與黃酮和木質(zhì)素的合成密切相關(guān)(Chenetal., 2019)。據(jù)文獻報道，香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)4CL基因的表達可以提高煙草(Nicotianatabacum)中黃酮類化合物的含量(Lietal., 2020)； 水曲柳(Fraxinusmandshurica)4CL基因可以通過增加松柏醇含量提高煙草的耐旱性和滲透脅迫能力(Chenetal., 2020)。中心基因編碼蛋白β-D-木糖苷酶(Xyl)是1個多功能蛋白，對根尖細胞的細胞壁結(jié)構(gòu)有重要調(diào)控作用(Xiongetal., 2007)。β-葡萄糖苷酶(BGL)編碼基因的表達直接影響銀杏(Ginkgobiloba)中黃酮類化合物的含量(Fangetal., 2019)。由此推測，在病原菌Fof-1侵染后，千年桐根部通過4-香豆酸： CoA連接酶-7(4CL)等中心基因的啟動，激發(fā)苯丙烷類生物合成途徑及黃酮類生物合成途徑，響應(yīng)病原菌入侵，產(chǎn)生更多的黃酮類物質(zhì)，包括芒柄花苷、橙皮苷等異黃酮和黃烷酮化合物，起到對枯萎病病原菌Fof-1的抵御作用。

3.3 展望

本研究著重討論病原菌Fof-1侵染后千年桐根部黃酮類化合物及其所在的苯丙烷類合成途徑在抗枯萎病中的作用，而病原菌Fof-1侵染后千年桐根部其他上調(diào)化合物，如兒茶素、茉莉酸等也可能在千年桐抗枯萎病中發(fā)揮作用。兒茶素合成相關(guān)基因DFR受楊樹(Populusspp.)細菌性潰瘍病菌(Lonsdaleaquercina)的誘導(dǎo)而表達上調(diào)并發(fā)揮抗病作用(Houetal., 2016)； 蘋果(Malussieversii)褐斑病菌(Diplocarponmali)的入侵會引起表兒茶素含量的顯著升高，且在抗病蘋果中的上升程度要高于感病蘋果，說明表兒茶素可能與蘋果抗褐斑病密切相關(guān)(Yinetal., 2013a)。此外，病菌入侵后茉莉酸途徑關(guān)鍵基因COII和PLD在抗病蘋果中呈現(xiàn)上調(diào)表達，外源施加茉莉酸可以提高感病蘋果對褐斑病菌的抗性(Yinetal., 2013b)； 水楊酸、茉莉酸和脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了鷹嘴豆(Cicerarietinum)對枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.ciceri)的抗性反應(yīng)，并可能激發(fā)其他信號通路(Gayatridevietal., 2012)。在番茄(Solanumlycopersicum)中茉莉酸甲酯通過水楊酸和黃酮醇的積累誘導(dǎo)了種子對半活體營養(yǎng)番茄?；图怄哏牭毒?hemi-biotrophFusariumoxysporumf.sp.lycopersici)的抗性(Krletal., 2015)。

因此，在后續(xù)的研究中，應(yīng)重點關(guān)注兒茶素、茉莉酸等化合物在千年桐抗枯萎病中的作用以及這些物質(zhì)和黃酮類化合物之間是否有協(xié)同作用，進一步解析千年桐的抗枯萎病機制。

4 結(jié)論

千年桐根部提取物與三年桐根部提取物相比較，對油桐枯萎病病原菌Fof-1的生長具有明顯的抑制作用。通過代謝組分析發(fā)現(xiàn)，與三年桐相比，千年桐根部黃酮類化合物含量增高，其中芒柄花苷、橙皮苷等異黃酮和黃烷酮化合物是三年桐的1 000倍以上。進一步通過比較轉(zhuǎn)錄組分析，千年桐根部負責(zé)黃酮類化合物合成的上游關(guān)鍵信號通路“苯丙烷類生物合成途徑”在病原菌Fof-1侵染后比三年桐顯著富集?！氨奖轭惿锖铣赏緩健敝?-香豆酸CoA連接酶(4CL-like 7)、β-D-木糖苷酶(Xyl)、β-葡萄糖苷酶41(BGL 41)和過氧化物酶N1(POX N1)編碼的4個中心基因經(jīng)qRT-PCR驗證在枯萎病病原菌Fof-1侵染早期上調(diào)表達，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。基于代謝組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析，表明千年桐在枯萎病病原菌侵染后，苯丙烷生物合成途徑發(fā)生應(yīng)答響應(yīng)，在千年桐根部產(chǎn)生異黃酮和黃烷酮等黃酮類化合物，發(fā)揮抵御病原菌入侵的作用。