逄雪夢(mèng)，鄭心

1 山東中醫(yī)藥大學(xué) 山東濟(jì)南 250014 2 青島市中醫(yī)院 山東青島 266033

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）[1-2]是一種與環(huán)境和遺傳等因素有關(guān)的常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率在我國(guó)高達(dá)1%。其是以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，與氣道高反應(yīng)性有關(guān)。支氣管哮喘分為發(fā)作期與緩解期，發(fā)作時(shí)主要以喘息胸悶為主，或伴有咳嗽。西醫(yī)治療[3-4]BA，主要以吸入抗炎、支氣管擴(kuò)張劑為主，依賴性較強(qiáng)，不能達(dá)到良好的治愈效果。中醫(yī)藥治療呼吸系統(tǒng)疾病療效確切，副作用小，早已成為新的治療BA的支持或替代療法。

射干麻黃湯出自《金匱要略》，主治[5]寒痰郁肺結(jié)喉證。其證見(jiàn)咳嗽、氣喘、喉間痰鳴似水雞聲，或胸膈滿悶，或吐痰涎。方中用射干9g，麻黃12g，生姜12g，細(xì)辛、紫菀、款冬花各9g，五味子12g，大棗7枚，半夏12g，諸藥合用，共奏溫肺化飲、下氣祛痰之功。有臨床實(shí)驗(yàn)[6-8]表明，射干麻黃湯治療BA總有效率為91.6%，可改善血清嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）、脂質(zhì)過(guò)氧化物（LPO）、呼出氣一氧化氮（FeNO），明顯改善患者第1秒用力呼出量/用力肺活量（FEV1/FVC）且改善中醫(yī)癥候積分，緩解喘息、咳嗽、咳痰、胸悶等癥狀。現(xiàn)代藥理學(xué)表明[9]，射干麻黃湯治療BA可降低痰液黏稠度、促進(jìn)氣道纖毛運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)痰液排除等。但由于中藥方劑成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)眾多，射干麻黃湯治療BA的藥效基礎(chǔ)和作用機(jī)制尚不明確，本研究采用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[10]的研究方法，探究射干麻黃湯治療BA的藥效基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供新的理論研究資料。

材料與方法

1 射干麻黃湯中入血活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)和分析平臺(tái)[11]（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP），分別以方劑中各藥物為關(guān)鍵詞，搜索其所含的化學(xué)成分。根據(jù)藥物代謝動(dòng)力學(xué)[12-14]（absorption and distribution and metabolism and excretion， ADME），將篩選條件定義為生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，收集有效入血活性成分；并根據(jù)平臺(tái)的成分靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，收集射干麻黃湯中有效入血成分的作用靶點(diǎn)。

2 射干麻黃“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述收集的有效入血活性成分與其作用靶點(diǎn)輸入Cytoscape3.2.1[15]，構(gòu)建“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)射干麻黃湯中的有效成分與作用靶點(diǎn)進(jìn)行圖像的可視化并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。其中，“節(jié)點(diǎn)（node）”表示有效成分與作用靶點(diǎn)，“邊（edge）”表示成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

3 與BA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)檢索

GeneCards[16]是包含有 HUGO、GDB（ Human Genome Organization/Genome Database） 命名委員會(huì)認(rèn)可的人類基因有關(guān)數(shù)據(jù)的 Web 網(wǎng)上智能檢索系統(tǒng)，收錄上萬(wàn)種基因有關(guān)數(shù)據(jù)。本研究以“bronchial asthma”“BA”為關(guān)鍵詞，檢索Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)，收集與BA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。

4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

使用Cytoscape中的BisoGenet插件，對(duì)射干麻黃湯作用靶點(diǎn)與BA相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein Interaction，PPI）繪制，并使用Merge功能對(duì)兩網(wǎng)絡(luò)合并，取取交集，即為射干麻黃湯治療BA的PPI調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

使用CytoNCA插件[17]，對(duì)此網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，分析指?biāo)包括各節(jié)點(diǎn)的度中心性（degree centrality，DC）、介度中介性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）和局部邊連通性（loal average connectivity，LAC）。首先將BC大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù) 2倍的節(jié)點(diǎn)定義為big hubs；然后篩選其他各指標(biāo)均大于所有節(jié)點(diǎn)中位數(shù)的節(jié)點(diǎn)，即為射干麻黃湯治療BA的關(guān)鍵靶基因。

5 GO生物學(xué)過(guò)程分析與KEGG信號(hào)通路富集分析

將上述關(guān)鍵基因使用DAVID富集分析功能，進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程分析以及KEGG通路富集分析。使用omicshare（http://omicshare.com/tools/home/task/index.html）將通路分析富集結(jié)果進(jìn)行可視化，以氣泡圖的形式展示。

結(jié) 果

1 入血活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，共檢索射干麻黃湯中的成分1494個(gè)，其中射干56個(gè)，麻黃363個(gè)，生姜265個(gè)，細(xì)辛192個(gè)、紫菀91個(gè)、款冬花148個(gè)，五味子130個(gè)，大棗133個(gè)，半夏116個(gè)。根據(jù)ADME篩選原則，共納入方劑的有效入血活性成分144個(gè)，各藥物中的有效入血成分?jǐn)?shù)目分布如圖1所示。有效成分作用靶點(diǎn)1658個(gè)。

圖1 根據(jù)ADME篩選出的射干麻黃入血活性成分?jǐn)?shù)量

2 射干麻黃湯“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

使用Cytoscpe構(gòu)建上述活性成分與作用靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，如圖2所示。分析“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，可知在網(wǎng)絡(luò)中共包含節(jié)點(diǎn)33個(gè)，邊1802條。其中，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇是位于網(wǎng)絡(luò)較核心位置的活性成分，其度（Degree）值分別為544、204、156、150、130；較為重要的作用靶點(diǎn)為PTGS2、NCOA2、PTGS1、SCN5A、PPARG。由此可以證實(shí)射干麻黃湯各成分在治療BA上相互協(xié)同，通過(guò)多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮其治療作用。

圖2 射干麻黃湯的“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

3 與BA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)的檢索

通過(guò)檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)，共收集與BA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)1832個(gè)，將上述靶點(diǎn)輸入Cytoscpe構(gòu)建疾病靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。

4 射干麻黃湯治療BA的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

分別構(gòu)建射干麻黃湯的PPI網(wǎng)絡(luò)與作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)。其中，射干麻黃湯PPI網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)2489個(gè)，邊14650條；BA靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)包含節(jié)點(diǎn)5907個(gè)，邊29173條。提取其交集網(wǎng)絡(luò)，獲得射干麻黃湯治療PPI網(wǎng)絡(luò)，節(jié)點(diǎn)2363個(gè)，邊14395個(gè)。根據(jù)篩選原則，篩選出射干麻黃湯治療BA的關(guān)鍵靶點(diǎn)115個(gè)，篩選策略圖如圖3所示。

圖3 射干麻黃湯關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選策略

5 GO生物學(xué)過(guò)程分析與KEGG通路富集分析

使用DAVID對(duì)上述關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程分析，其共涉及576種生物學(xué)過(guò)程，其中涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、病毒過(guò)程、肽基酪氨酸自磷酸化、fcε受體信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化、蛋白質(zhì)磷酸化、刺激性C型凝集素受體信號(hào)通路等生物學(xué)過(guò)程。對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果顯示其共涉及111條信號(hào)通路，包括癌癥相關(guān)信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Erbb信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘附、TNF信號(hào)通路等。富集結(jié)果氣泡圖如圖4所示，其中面積表示富集基因數(shù)，顏色表示P值。

圖4 射干麻黃湯治療BA信號(hào)通路富集分析結(jié)果氣泡

討 論

隨著全球環(huán)境污染的加劇和生化壓力的增加等因素，BA成為最常見(jiàn)的慢性病之一，環(huán)境大氣中的化學(xué)觸發(fā)物（顆粒物質(zhì)和氣體成分，如二氧化氮和臭氧）和生物觸發(fā)物（空氣過(guò)敏原），空氣過(guò)敏原會(huì)刺激過(guò)敏個(gè)體氣道過(guò)敏 從而誘發(fā)支氣管哮喘的癥狀，其發(fā)病率及死亡率持續(xù)上升，目前全球大約有3億人患有BA，我國(guó)患病人數(shù)達(dá)3000多萬(wàn)。目前BA的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，或與氣道的免疫-炎癥機(jī)制、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制以及遺傳、環(huán)境共同作用有關(guān)，有學(xué)者認(rèn)為IgE介導(dǎo)的過(guò)敏是最重要的誘發(fā)因素和致病因素。2016版《支氣管哮喘防治指南》[18]指出，符合典型哮喘的臨床癥狀和體征，并同時(shí)具備氣流受限客觀檢查 （支氣管舒張?jiān)囼?yàn)、支氣管激發(fā)試驗(yàn)或PEF及其變異率測(cè)定）中的任一條， 并除外其他疾病所引起的喘息、氣急、胸悶、咳嗽，即可以診斷為BA。在治療方面[19]，BA目前尚不能完全根治，但可以通過(guò)長(zhǎng)期使用藥物控制其發(fā)作次數(shù)，改善患者生活質(zhì)量。西醫(yī)治療BA主要用藥包括β2受體激動(dòng)劑、糖皮質(zhì)激素、茶堿與氨茶堿、抗膽堿類、白三烯受體拮抗劑等，且有最新研究指出吸入皮質(zhì)類固醇 （ICS） 與 長(zhǎng)效β受體激動(dòng)劑（LABA）聯(lián)合應(yīng)用是治療中度或重度BA的最佳組合。達(dá)到擴(kuò)張支氣管，減輕炎癥反應(yīng)與過(guò)敏反應(yīng)的目的。目前抗細(xì)胞因子治療作為支氣管哮喘治療的新方法，特別是基于人性化單克隆抗體、可溶性受體、肽抑制劑等的藥物，但是不受控制或控制不力的哮喘仍然是一個(gè)問(wèn)題。

中醫(yī)將BA歸于“哮病”“喘證”的范疇，哮喘發(fā)作時(shí)“喉中哮鳴有聲，呼吸困難，甚則喘息不能平臥”，《醫(yī)學(xué)入門(mén)》指出，哮必兼喘，而喘未必兼哮。中醫(yī)認(rèn)為，“伏痰”是哮病發(fā)作的夙根，正如《丹溪心法》中指出：“哮喘專主于痰”；而人體外感六淫觸動(dòng)伏痰，引起哮喘發(fā)作，正如《景岳全書(shū)》：“喘有夙根，遇寒即發(fā)，或遇勞即發(fā)者，亦名哮喘”?！捌樯抵?，肺為貯痰之器”，哮病的發(fā)生發(fā)展與肺脾兩臟密切相關(guān)，屬“本虛標(biāo)實(shí)”之證。因此中醫(yī)治療哮喘的基本原則[20]為“發(fā)時(shí)治標(biāo)，平時(shí)治本”，注重“補(bǔ)肺、健脾、化痰”之應(yīng)用。射干麻黃湯是傳統(tǒng)治療外寒內(nèi)熱哮喘的方劑，擅于溫肺化飲、降逆平哮。方中射干清熱解毒，合麻黃宣肺平喘、化痰利咽；紫菀、款冬花化痰止咳；細(xì)辛、生姜、半夏溫肺化飲，大棗、甘草止咳和中，全方以宣肺化痰為主，正對(duì)病機(jī)。

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)收集方法，發(fā)現(xiàn)射干麻黃湯中含有有效成分114種，槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、木犀草素、豆甾醇、麻黃堿、偽麻黃堿是其中較為重要的有效成分，均有研究證實(shí)其對(duì)BA有抑制作用。劉清毅[21]證實(shí)射干麻黃湯可降低肺組織中白介素5（IL-5）和白介素6（IL-6）的表達(dá)，從而抑制支氣管哮喘；龔國(guó)清等[22]證實(shí)了山奈酚、槲皮素能抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)，影響氣道重塑。洪麗軍[23]等證實(shí)木犀草素可明顯提高血清中IFN-γ及降低白介素4（IL-4）含量，減輕肺組織浸潤(rùn)、管壁及平滑肌厚度。姚鳳等驗(yàn)證了[24]β-谷甾醇可抑制TNF-α與白介素6（IL-6）等炎癥因子，下調(diào)NF-κB活化水平，從而抑制小氣道炎癥。

本研究KEGG通路富集分析顯示，PI3K/AKT信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路、FoxO信號(hào)通路、Erbb信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、焦點(diǎn)粘附、TNF信號(hào)通路等。PI3K信號(hào)通路與脂類第二信使相關(guān)[25]，使細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)通路活化，從而調(diào)節(jié)T細(xì)胞的發(fā)育、活化、增殖與分化，而T細(xì)胞是哮喘發(fā)生過(guò)程中重要的炎癥細(xì)胞。，NF-κB信號(hào)通路是BA中研究較多的通路，其與哮喘氣道炎癥及氣 道重塑關(guān)系密切[26-27]。而FoxO信號(hào)通路、Erbb信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等均有實(shí)驗(yàn)或文獻(xiàn)證實(shí)其與炎癥細(xì)胞的生成、分布、浸潤(rùn)有直接或間接關(guān)系。這也充分說(shuō)明了射干麻黃湯在治療支氣管哮喘中多途徑的作用特點(diǎn)。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)射干麻黃湯治療支氣管哮喘進(jìn)行了作用機(jī)制分析，表明其具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，但由于主要依托于數(shù)據(jù)庫(kù)信息，且網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法主要依托于相互作用關(guān)系的數(shù)量關(guān)系而為引入劑量、劑型、煎藥方法等因素，因此對(duì)分析結(jié)果還存在進(jìn)一步精確的空間。