王小琴 黃銀萍 王蔚倩 吳萍 全舒

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 中國(guó)科學(xué)院上海高等研究院國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)設(shè)施上海 張江實(shí)驗(yàn)室，上海201210）

MLL3是人體細(xì)胞內(nèi)一種組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能異常會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，甚至引發(fā)癌癥［1-3］。SET是MLL3具有甲基轉(zhuǎn)移酶催化功能的結(jié)構(gòu)域，但其自身基本沒(méi)有甲基轉(zhuǎn)移酶活力，必須與ASH2L、RBBP5（AR）等輔助蛋白形成復(fù)合物，才能發(fā)揮完整的甲基轉(zhuǎn)移酶活力［4-5］。明確MLL3SET如何被AR調(diào)控，對(duì)于新藥物研發(fā)至關(guān)重要。

盡管有報(bào)道認(rèn)為調(diào)控因子AR與MLL3SET結(jié)合后誘導(dǎo)MLL3SET從低活性的“open”構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)楦呋钚缘摹癱lose”構(gòu)象［6-7］，然而 Li等［8］解析了單獨(dú)的MLL3SET結(jié)構(gòu)和MLL3SET結(jié)合AR后復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)二者幾乎沒(méi)有區(qū)別，從而提出了MLL3SET可能始終在兩種構(gòu)象之間震蕩的假說(shuō)。由此推測(cè)，AR通過(guò)影響MLL3SET的構(gòu)象動(dòng)態(tài)性而調(diào)節(jié)其催化活力。因此，以實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證MLL3SET是否處于“open”和“close”狀態(tài)不斷震蕩的動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)進(jìn)一步揭示MLL3SET的調(diào)控機(jī)制，尋找藥物靶點(diǎn)具有重要作用。單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（single-molecule fluoresce energy transfer，smFRET） 可 直 接 觀 測(cè)MLL3SET動(dòng)態(tài)過(guò)程，該技術(shù)依賴于化學(xué)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)在特定氨基酸位點(diǎn)標(biāo)記上熒光染料［9-12］。

常用的蛋白標(biāo)記手段是標(biāo)記半胱氨酸和非天然氨基酸［13-14］。Ryu 等［15-19］開(kāi)發(fā)出以 C321.ΔA.exp 為宿主菌的含非天然氨基酸的系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用aaRS-tRNA的正交性，將非天然氨基酸插入到合適的位置。對(duì)MLL3SET結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，可選取活性口袋兩側(cè)的4 819位和4 905位氨基酸殘基分別進(jìn)行編碼半胱氨酸的密碼子和琥珀密碼子替換，以特異性引入熒光染料標(biāo)記。然而，MLL家族SET結(jié)構(gòu)域蛋白很不穩(wěn)定，在此制備蛋白樣品方面存在巨大的挑戰(zhàn)。

本文通過(guò)改造C321.ΔA. exp基因組以表達(dá)pET-28b（+）質(zhì)粒，構(gòu)建pET28b-his-sumo-mll3setC4883S S4819C N4905X（X：TAG終止密碼子），以克服制備困難，純化到His-SUMO-MLL3SET*蛋白（*：非天然氨基酸PrK），為后續(xù)的smFRET實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21（DE3）和TransT1購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司；大腸桿菌C321. ΔA. exp購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；pKD4、pKD46、pCP20質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保藏；pET28b-his-sumomll3set質(zhì)粒由國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)中心（上海）友情提供。pEVOL-pylRS質(zhì)粒為Edward A. Lemke實(shí)驗(yàn)室友情提供。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、阿拉伯糖（L-ara）等試劑均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；N-炔丙基-賴氨酸（N-propargyl-lysine，PrK）購(gòu)自上海柘智生物科技有限公司。重組蛋白的核苷酸序列測(cè)定由金唯智生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 C321. ΔA. exp基因組的改造 第一步：構(gòu)建中間態(tài)細(xì)胞 C321.ΔA. exp lacZ∷（T7p07+Kan）。以pKD4質(zhì)粒為模板，以Kan-F 和Kan-R為引物，PCR制備出Kan基因。與此同時(shí)，以BL21（DE3）基因組為模板，以T7p07-F 和T7p07-R為引物，PCR擴(kuò)增出T7p07基因。然后將PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行膠回收，回收后的兩個(gè)基因以（T7p07+Kan）-F和（T7p07+Kan）-R為引物進(jìn)行重疊PCR，得到T7p07+Kan片段，所用引物如表1所示。T7p07+Kan基因片段通過(guò)乙醇沉淀，制備出高濃度的線性片段，然后將此片段通過(guò)電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入含有pKD46的C321.ΔA. exp感受態(tài)細(xì)胞中，pKD46質(zhì)粒將T7p07+Kan片段整合到細(xì)菌基因組上，以替換lacZ基因。隨后，利用pKD46在30℃環(huán)境中可穩(wěn)定存在于細(xì)菌中，37℃環(huán)境下則會(huì)丟失的熱敏性特征去除pKD46質(zhì)粒。C321.ΔA. exp lacZ∷（T7p07+Kan）中間態(tài)細(xì)胞構(gòu)建完成。第二步：構(gòu)建目的細(xì)胞C321.ΔA. exp lacZ∷T7p07。制備 C321.ΔA. exp lacZ∷（T7p07+Kan）電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，隨后轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒以剪切掉Kan基因。同理，利用pCP20的熱敏性特征去除pCP20質(zhì)粒，最后通過(guò)測(cè)序確保Kan基因被去除。至此，基因組改造完成。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用快速定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建突變體質(zhì)粒pET28b-his-sumo-mll3setC4883S。以野生型pET28b-his-sumo-mll3set質(zhì)粒為模板，用正向引物F1和反向引物R1通過(guò)PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)Dpn I限制性酶消化模板質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入TransT1感受態(tài)細(xì)胞。待從平板上長(zhǎng)出單克隆后，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。利用上述同樣的方法，以鑒定正確的突變體質(zhì)粒pET28b-hissumo-mll3setC4883S為模板，F(xiàn)2為正向引物，R2為反向引物，成功構(gòu)建pET28b-his-sumo-mll3setC4883S S4819C質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，以F3為正向引物，R3為反向引物，最終構(gòu)建pET28b-his-sumo-mll3setC4883S S4819C N4905X質(zhì)粒。所用引物如表1所示。

表1 PCR反應(yīng)引物序列Table 1 Primer sequences of PCR reactions

1.2.3 MLL3SET*蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 先制備C321.ΔA.exp lacZ∷T7p07感受態(tài)細(xì)胞，將pEVOL-pylRS質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中。然后制備含pEVOL-pylRS質(zhì)粒的C321.ΔA. exp lacZ∷T7p07感受態(tài)細(xì)胞，再將pET28b-hissumo-mll3setC4883S S4819C N4905X質(zhì)粒轉(zhuǎn)入上述感受態(tài)細(xì)胞。準(zhǔn)備4 mL液體LB培養(yǎng)基，加入終濃度為 100 μg/mL 卡那霉素和 34 μg/mL 氯霉素，將得到的陽(yáng)性克隆接種其中，37℃培養(yǎng)12 h。次日，準(zhǔn)備4 mL 新鮮LB培養(yǎng)基，加入上述相應(yīng)濃度抗生素，另外再加入20 μL 50 mmol/L PrK溶液，按1%接種量接種過(guò)夜培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)。待OD600值達(dá)到0.6時(shí)，冷卻降溫至16℃，依次加入4 μL 20% L-（+）-阿拉伯糖，0.2 mmol/L IPTG，培養(yǎng)12-16 h。

1.2.4 MLL3SET*蛋白的可溶性表達(dá)測(cè)試 取1 OD培養(yǎng)12-16 h的菌液離心棄上清，用100 μL緩沖液（50 mmol/L Tris pH 7.5、1 mmol/L EDTA）重懸，加1 μL 100×PIC（蛋白酶抑制劑）混合均勻，再加1 μL 10 mg/mL溶菌酶冰浴10 min。將以上體系置于液氮中速凍5 min，然后放入水中至融化，重復(fù)3-4次以使細(xì)胞完全破裂。向細(xì)胞裂解液中加0.5 μL DNase I、1.5 μL 0.5 mol/L CaCl2和 MgCl2冰 浴 10 min， 再 經(jīng)18 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀。樣品分別與蛋白上樣緩沖液混合均勻，電泳檢測(cè)蛋白可溶性表達(dá)。

1.2.5 MLL3SET*蛋白的純化 將1 L菌液3 800 r/min離心13 min收集菌體，重懸于緩沖液（50 mmol/L Tris pH 8.0、400 mmol/L NaCl、10% glycerol） 中 超聲破碎。細(xì)胞破碎液經(jīng)12 000 r/min離心，上清液在Ni-NTA層析柱中進(jìn)行親和層析。洗滌Ni-NTA上的雜蛋白后，用含300 mmol/L 咪唑的洗脫緩沖液洗脫并收集目的蛋白。將目的蛋白濃縮至8 mL，12 000 r/min離心20 min蛋白樣品除去沉淀，通過(guò)HiLoad 16/600 Superdex 75pg凝膠層析柱分離目的蛋白和雜蛋白，根據(jù)出峰位置以及SDS-PAGE分析收集目標(biāo)蛋白。為判斷His-SUMO-MLL3SET*蛋白的分子量， 用 aprotinin（6.5 kD）、ribonuclease（13.7 kD）、carbonic anhydrase（29 kD）、ovalbumin（44 kD） 和conalbumin（75 kD）5種蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品蛋白，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。借助國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)設(shè)施（上海）質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)純化得到的His-SUMO-MLL3SET*蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。簡(jiǎn)單描述如下：蛋白樣品經(jīng)變性后由胰蛋白酶消化為肽段，之后通過(guò)納流液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nano LC-MS/MS）檢測(cè)分子量，所得原始數(shù)據(jù)對(duì)含有目標(biāo)蛋白的自定義數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行肽段搜索，并通過(guò)定義特殊蛋白修飾的方法檢索目標(biāo)位點(diǎn)是否含有非天然氨基酸PrK。

1.2.6 MLL3SET*蛋白的活性測(cè)定 利用多酶級(jí)聯(lián)反 應(yīng)檢測(cè) MLL3SET甲基轉(zhuǎn)移酶 活性（ 圖 1）［20］。MLL3SETAR會(huì)將S-腺苷甲硫氨酸（SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到底物H3多肽上，生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（SAH），SAH在多種催化劑作用下，最終生成在515 nm（A515）處有吸光度的物質(zhì)即N-（4-安替比林）-3-氯-5-磺酸酯苯醌-單亞胺，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)產(chǎn)物吸光度的變化，即可分析是否具有酶活。如果具有酶活性，則隨著時(shí)間延長(zhǎng)吸光度不斷升高，直至反應(yīng)完全，吸光度不再變化。如果將酶加入反應(yīng)體系后，吸光度無(wú)變化，說(shuō)明此酶無(wú)活性。在本文中，100 μL反應(yīng)體系含25 mmol/L Tris pH 8.0的緩沖液，固定SAM濃度為200 μmol/L，H3多肽濃度為800 μmol/L，MLL3SETAR 濃度為 1 μmol/L，檢測(cè) A515吸光值隨時(shí)間的變化情況。另外，以測(cè)試緩沖液（25 mmol/L Tris pH 8.0）代替His-SUMO-MLL3SET*，其余條件均相同作為為陰性對(duì)照；以His-SUMO-MLL3SET代替His-SUMO-MLL3SET*，其余條件均相同，作為陽(yáng)性對(duì)照。

圖1 多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)測(cè)定MLL3SET*活性的原理圖Fig. 1 Diagram of the multi-enzyme coupling reaction for determining MLL3SET* activity

2 結(jié)果

2.1 基因組改造

由于C321.ΔA. exp不含有T7 RNA聚合酶基因（T7p07），無(wú)法表達(dá)pET-28b（+）質(zhì)粒，故首先將基因組中的lacZ替換為T(mén)7p07。經(jīng)基因測(cè)序和序列比對(duì)后可知，C321.ΔA. exp大腸桿菌基因組中l(wèi)acZ基因已替換成T7p07基因。構(gòu)建完成后，進(jìn)一步驗(yàn)證是否可以順利表達(dá)pET-28b（+）質(zhì)粒。將pET28b-his-sumo-mll3set質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化 C321.ΔA. exp、C321.ΔA. exp lacZ∷T7p07以 及 BL21（DE3） 進(jìn) 行表達(dá)測(cè)試。結(jié)果（圖2）表明，pET28b-his-sumomll3set質(zhì)粒轉(zhuǎn)入C321.ΔA. exp后，無(wú)論是否誘導(dǎo)，均不能表達(dá)His-SUMO-MLL3SET蛋白；轉(zhuǎn)入C321.ΔA.exp lacZ∷T7p07中后，未誘導(dǎo)條件下沒(méi)有表達(dá)His-SUMO-MLL3SET蛋白，而在誘導(dǎo)條件下成功表達(dá)，表達(dá)量約為BL21（DE3）宿主菌中表達(dá)量的25%。這表明基因組改造成功，可以利用此菌株表達(dá)pET28bhis-sumo-mll3setC4883S S4819C N4905X質(zhì)粒。

圖2 基因組改造表達(dá)測(cè)試Fig. 2 Expression test after genomic modification

2.2 構(gòu)建和表達(dá)pET28b-his-sumo-mll3set C4883S質(zhì)粒

氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)MLL3SET結(jié)構(gòu)域中總共含有6個(gè)半胱氨酸（圖3-A）。其中4個(gè)（C4851、C4899、C4901和C4906）形成較穩(wěn)定的鋅指結(jié)構(gòu)，一個(gè)（C4855）朝向蛋白內(nèi)部，可以忽略對(duì)染料標(biāo)記產(chǎn)生干擾。然而，第4 883位的半胱氨酸側(cè)鏈巰基朝向外部水環(huán)境，很可能會(huì)對(duì)標(biāo)記產(chǎn)生干擾。因此利用快速定點(diǎn)突變的方法將第4 883位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。基因測(cè)序表明，編碼4 883位氨基酸的密碼子由原來(lái)的TGT突變成AGT，成功構(gòu)建pET28b-his-sumo-mll3setC4883S表達(dá)質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，由于單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)的前提是標(biāo)記上熒光供體和受體，選取4 819位采用突變成半胱氨酸的方式標(biāo)記熒光供體，4 905位采用突變?yōu)榉翘烊话被岬姆绞接糜跇?biāo)記熒光受體。因此將4 819位和4 905位氨基酸殘基分別進(jìn)行編碼半胱氨酸的密碼子和琥珀密碼子替換（圖3-B），從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)標(biāo)記熒光供體和受體染料。

圖3 MLL3SET結(jié)構(gòu)信息（A）和表達(dá)質(zhì)粒圖譜（B）Fig. 3 MLL3SET structural information（A）and the map of the expression plasmid （B）

為確保后續(xù)活性口袋兩側(cè)氨基酸突變后能純化得到MLL3SET蛋白，故先檢測(cè)His-SUMO-MLL3SETC4883S突變蛋白表達(dá)情況。以pET28b-his-sumomll3setC4883S為實(shí)驗(yàn)組，pET28b-his-sumo-mll3set為對(duì)照組，分別在37℃和16℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，探究最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度以及蛋白表達(dá)是否受突變影響。結(jié)果（圖4）表明His-SUMO-MLL3SETC4883S表達(dá)量與His-SUMO-MLL3SET相似，且均在16℃誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)蛋白可溶性含量更高，C4883S突變對(duì)MLL3SET蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有影響。因此，可以在C4883S突變的基礎(chǔ)上再進(jìn)行雙點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。

圖4 pET28b-His-sumo-mll3set C4883S質(zhì)粒的表達(dá)測(cè)試Fig. 4 Expression test of the pET28b-His-sumo-mll3set C4883S plasmid

2.3 構(gòu)建和表達(dá)pET28b-His-sumo-mll3set C4883S S4819C N4905X質(zhì)粒

通過(guò)快速定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建pET28b-his-sumomll3setC4883S S4819C N4905X質(zhì)粒?；驕y(cè)序表明，編碼4 819位氨基酸的密碼子由原來(lái)的AGT成功突變成TGT，編碼4 905位氨基酸的密碼子由原來(lái)的AAT突變成琥珀密碼子UAG，成功構(gòu)建pET28bhis-sumo-mll3set C4883S S4819C N4905X表達(dá)質(zhì)粒。隨后，將其與pEVOL-PlyRS質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化C321.ΔA.exp lacZ∷T7宿主菌中進(jìn)行表達(dá)測(cè)試。以pET28bhis-sumo-mll3set在BL21（DE3）中表達(dá)作為陽(yáng)性對(duì)照，制備好全菌蛋白樣品后，分別進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot分析檢測(cè)。結(jié)果（圖5）表明細(xì)胞可溶性組分中含有His-SUMO-MLL3SETC4883S S4819C N4905X（簡(jiǎn)寫(xiě)為：His-SUMO-MLL3SET*），可以進(jìn)行純化。

圖5 表達(dá)His-SUMO-MLL3SET*分析Fig. 5 Analysis of expressed His-SUMO-MLL3SET*

2.4 純化His-SUMO-MLL3SET*蛋白

檢測(cè)His-SUMO-MLL3SET*蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶活性，其前提是可以純化得到高純度的His-SUMOMLL3SET*蛋白。本文首先通過(guò)Ni-NTA親和層析獲得His-SUMO-MLL3SET*蛋白（圖6中泳道8），得到的目的蛋白含有較多雜質(zhì)，純度較低。因此，再通過(guò)凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步分離目的蛋白（圖7）。球形蛋白分子量 MW與保留體積Ve存在如下關(guān)系：Ve/V0= -a log10MW+ b。根據(jù)此公式，分別代入標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量，繪制蛋白分子量與保留時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到公式 Ve/V0= -0.669 6 log10MW+ 2.925 1，R2為0.991 4。代入V0（排空體積）44.37 mL，His-SUMOMLL3SET*蛋白分子量31.78 kD（圖7），最后計(jì)算得到單體對(duì)應(yīng)的保留體積Ve為85.11 mL，二聚體對(duì)應(yīng)的保留體積Ve為76.17 mL。因此凝膠圖譜中80-90 mL對(duì)應(yīng)位置為目的蛋白，收集濃縮后分裝保存于-80℃待用。

圖6 純化His-SUMO-MLL3SET*分析Fig. 6 Analysis of purified His-SUMO-MLL3SET*

圖7 凝膠過(guò)濾色譜分離His-SUMO-MLL3SET*Fig. 7 Separation of His-SUMO-MLL3SET* by gel filtration chromatography

運(yùn)用nano LC-MS/MS質(zhì)譜法分析純化得到的His-SUMO-MLL3SET*蛋白。當(dāng)?shù)? 905位氨基酸殘基N（132.12 Da）替換為非天然氨基酸PrK（228.25 Da）后，理論分子量增加96.13 Da。圖8為IPCHCGAVNCR肽段的二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPCHCGAVNCR肽段的N增加96.06 Da，與理論增加分子量相差0.07 Da，誤差非常小，可信度高，表明重組蛋白MLL3SET蛋白4 905位氨基酸由原來(lái)的天冬酰胺N成功替換為非天然氨基酸PrK。

圖8 IPCHCGAVNCR肽段二級(jí)質(zhì)譜圖Fig. 8 MS/MS diagram of the IPCHCGAVNCR peptide

2.5 多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)測(cè)His-SUMO-MLL3SET*酶活

為確保后續(xù)smFRET實(shí)驗(yàn)結(jié)果有意義，蛋白樣品必須保持部分原有的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。將蛋白與AR組裝成His-SUMO-MLL3SET*AR（M*AR）復(fù)合物，驗(yàn)證His-SUMO-MLL3SET*蛋白樣品是否具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性。在多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系中，以不加His-SUMO-MLL3SET*為陰性對(duì)照，加入相同濃度即 1 μmol/L His-SUMO-MLL3SET（MAR） 代 替 His-SUMO-MLL3SET*為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖9-A）表明，不加His-SUMO-MLL3SET*蛋白時(shí)，在515 nm處的吸光度（A515）值基本無(wú)變化；加入His-SUMOMLL3SET時(shí)，OD值在3 min后達(dá)到最大值2，并趨于平緩；而加入His-SUMO-MLL3SET*時(shí)，OD值緩慢上升，6 min后達(dá)到1.8，并趨于平緩。

為了量化催化生成的SAH，在計(jì)算酶促反應(yīng)速率之前，首先建立SAH濃度與A515之間的關(guān)系。即分 別 用 0 μmol/L、3.125 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L 的SAH代替MAR復(fù)合物，直接加到反應(yīng)體系中，測(cè)量各個(gè)濃度SAH反應(yīng)體系的吸光值，經(jīng)擬合可得到SAH濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線 Y=0.048 91X+0.058 59，R2=0.992 4（圖 9-B）。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得，v0（M*AR）為0.098 14 μmol/（L·s），v0（MAR） 為 0.229 7 μmol/（L·s），此結(jié)果表明His-SUMO-MLL3SET*有活性，且活性約為His-SUMO-MLL3SET的43%，可進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和smFRET實(shí)驗(yàn)。

圖9 多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)測(cè)His-SUMO-MLL3SET*活性Fig. 9 Activity of His-SUMO-MLL3SET* measured by a multi-enzyme coupling reaction

3 討論

組蛋白甲基化與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)，在造血、胚胎干細(xì)胞發(fā)育及神經(jīng)發(fā)育方面具有重要作用，是表觀遺傳領(lǐng)域的主要研究?jī)?nèi)容之一［21］。MLL3作為一種重要的組蛋白H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，其異常表達(dá)調(diào)控會(huì)導(dǎo)致多種疾病［22-24］。明確其活性如何被AR調(diào)控有助于新藥物研發(fā)，而smFRET可以直接觀測(cè)MLL3動(dòng)態(tài)過(guò)程以研究MLL3催化機(jī)制。為了制備充足的蛋白用于smFRET研究，可使用高效表達(dá)的pET-28b（+）作為表達(dá)載體。該表達(dá)載體含有T7啟動(dòng)子，而C321.ΔA. exp不含有T7 RNA聚合酶基因（T7p07），故首先要改造細(xì)菌基因組，將lacZ替換為T(mén)7p07。前期也嘗試直接利用pTrc質(zhì)粒作為表達(dá)載體，其優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需改造基因組，然而MLL3蛋白非常不穩(wěn)定，即使通過(guò)對(duì)多種表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，表達(dá)量仍很低（數(shù)據(jù)未顯示），無(wú)法制備出足夠蛋白樣品，因此最終選用pET-28b（+）作為表達(dá)載體。

smFRET實(shí)驗(yàn)通常需要用到熒光標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)將熒光染料（供體和受體）以共價(jià)鍵的形式連接到被觀測(cè)的蛋白分子上。目前最常用也最成熟的方法是將熒光分子與蛋白表面的兩個(gè)半胱氨酸殘基相連接。然而，這種標(biāo)記方式具有隨機(jī)性，即每個(gè)位點(diǎn)被標(biāo)記上的熒光標(biāo)簽種類(lèi)（供體或受體）隨機(jī)，可能出現(xiàn)同時(shí)標(biāo)記上供體或同時(shí)標(biāo)記上受體的情況。為實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)標(biāo)記熒光供體和受體，本研究利用一個(gè)半胱氨酸和一個(gè)非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)標(biāo)記熒光供體和受體。通過(guò)分析MLL3SET晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)活性口袋兩側(cè)第4 819/4 820、4 904/4 905位氨基酸殘基可分別進(jìn)行半胱氨酸和非天然氨基酸突變，以引入熒光染料標(biāo)記。S4819或Q4820突變成半胱氨酸用于標(biāo)記熒光供體，V4904或N4905替換成非天然氨基酸PrK用于熒光受體標(biāo)記，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)標(biāo)記熒光染料。前期構(gòu)建4個(gè)兩兩組合的雙點(diǎn)突變質(zhì)粒進(jìn)行蛋白表達(dá)測(cè)試，結(jié)果表明S4819C（標(biāo)記熒光供體）和N4905X（標(biāo)記熒光受體）這對(duì)氨基酸殘基突變蛋白表達(dá)量和溶解性最高（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，最終選擇該兩處位點(diǎn)氨基酸突變的質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)純化以獲得待標(biāo)記樣品蛋白。

在C321.ΔA. exp宿主菌中表達(dá)含非天然氨基酸的蛋白時(shí)，需要pEVOL質(zhì)粒表達(dá)外源aaRS-tRNA，還需要pET-28b（+）表達(dá)MLL3SET蛋白。在進(jìn)行雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)化時(shí)，采用同時(shí)轉(zhuǎn)化雙質(zhì)粒的方案效率非常低，甚至可能不能獲得同時(shí)含有pEVOL-pylRS和pET28b-his-sumo-mll3setC4883S S4819C N4905X雙質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆。采用分兩步轉(zhuǎn)化的方式，先轉(zhuǎn)化其中一種質(zhì)粒，然后把轉(zhuǎn)化該質(zhì)粒的細(xì)菌做成感受態(tài)細(xì)胞，再轉(zhuǎn)入另一種質(zhì)粒，效率高。本文采用上述兩步轉(zhuǎn)化法，先轉(zhuǎn)入pEVOL-pylRS質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入pET28b-his-sumo-mll3setC4883S S4819C N4905X，最終成功構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，避免了只轉(zhuǎn)入一種質(zhì)粒、效率低等技術(shù)性問(wèn)題。

綜上，本研究制備出了充足的具有酶活性的His-SUMO-MLL3SET*蛋白，該蛋白可在較溫和的條件下進(jìn)行染料標(biāo)記，為后續(xù)的單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)研究、揭示MLL活性調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功將C321.ΔA. exp基因組中的lacZ替換為T(mén)7p07，并構(gòu)建了pEVOL-pylRS和pET28b-hissumo-mll3setC4883S S4819C N4905X雙質(zhì)粒系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，本研究成功表達(dá)和純化了含非天然氨基酸PrK的His-SUMO-MLL3SET*蛋白。最后，通過(guò)多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)測(cè)量出純化后的蛋白具有一定酶活，可用于后續(xù)的熒光染料標(biāo)記以及單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。