鐘明月 劉春妍 顏妍 張曉慧 原海升 徐國全 張和平 王玉珍

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，呼和浩特 010011；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學教育部乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室，呼和浩特 010018）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種以肝臟中過多的脂肪堆積為特征的疾病，肥胖成年人的患病率高達50.7%［1-2］。NAFLD和肥胖、高胰島素血癥、外周胰島素抵抗、糖尿病、高甘油三酯血癥、高血壓共同構(gòu)成代謝性綜合征［3］。NAFLD可以從單純性脂肪肝發(fā)展為脂肪性肝炎和肝硬化，最終有可能發(fā)展為肝癌，其發(fā)病機制是由多因素引起的［4］。

已經(jīng)建立了幾種理論來解釋NAFLD的發(fā)病機制。人們認識較多的理論是“二次打擊假說”［5］。根據(jù)這一理論，肝臟在第一次打擊后，會對第二次打擊更加敏感。隨后，“二次打擊假說”被認為過于簡化的解釋了NAFLD的發(fā)病機制。其中還可能涉及遺傳和表觀遺傳因素、飲食、生活方式、線粒體功能障礙、輕度慢性炎癥、脂肪組織功能障礙、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）應(yīng)激、微生物群和組成性免疫。因此，最近提出的“多重打擊學說”［6-8］可能更接近NAFLD發(fā)病本質(zhì)。

盡管對NAFLD的研究取得了一定的進展，但針對其治療策略仍不清楚［9］?！澳c肝軸”被認為與NAFLD的發(fā)展有關(guān)，同時也是探究更安全有效治療NAFLD的熱點。早期研究表明，在ob / ob小鼠中用益生菌（以改善腸道菌群）或抗TNF抗體（以抑制TNF活性）治療會改善NAFLD［10］。這些研究將腸道微生物與肝胰島素抵抗、非酒精性脂肪性肝炎信號傳導聯(lián)系起來，表明“腸肝軸”在其中扮演重要角色。乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9）是從12位健康蒙古族兒童糞便分離得到的31株雙歧桿菌中篩選出的1株具有良好益生功能的新型潛在益生菌，它顯示出對胃酸和膽汁酸的高度耐受性［11］。臨床研究表示乳雙歧桿菌V9可以增加腸道內(nèi)雙歧桿菌數(shù)量，改善腸道菌群平衡，具有抗氧化、降血脂、抑制肥胖、降低甘油三酯和膽固醇表達的作用［12］。本實驗以“腸肝軸”為理論基礎(chǔ)，探究益生菌 V9 對于NAFLD 大鼠的脂代謝紊亂以及腸道炎癥和屏障功能的改善情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6-8周雄性Wistar大鼠40只，體重（120±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)條件為（25±2）℃，（60±10）%濕度，12 h/12 h-光照/黑暗交替，并自由獲得食物和水。

1.1.2 動物飼料 普通維持飼料和高脂飼料均購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司，飼料配比如表1所示。

表1 動物飼料配比Table 1 Ratio of animal feed

1.1.3 實驗試劑 乳雙歧桿菌V9由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點實驗提供；鹽酸小檗堿水合物（Berberine）購自阿拉訂試劑公司；NEFA、TG的檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司，Real-time PCR所用試劑均購自TaKaRa生物公司。

1.2 方法

1.2.1 動物實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建 適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周后，將40只雄性Wistar大鼠隨機分為5組（n=8）：空白對照組（Control）、高脂飲食模型組（HFD）、黃連素陽性藥物組（Berberine）、乳雙歧桿菌V9治療組（HFD/V9）和乳雙歧桿菌V9對照組（V9）。除空白對照組（Control）和乳雙歧桿菌V9對照組（V9）給予普通維持飼料外，剩余組分均給予高脂飲食6周構(gòu)建NAFLD模型。6周后，將高脂飲食替換為普通維持飼料，并按照大鼠體重進行灌胃給藥，陽性藥物組（Berberine）給藥劑量為50 mg/kg，HFD/V9和V9組給藥劑量為1×109CFU/mL，空白對照組（Control）和高脂飲食模型組（HFD）給予對應(yīng)的生理鹽水。4周后，禁食不禁水12 h，收集血液、肝臟以及結(jié)腸組織用于后續(xù)試驗檢測。本實驗經(jīng)內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學實驗動物福利與倫理委員會審查批準，倫理批準號為NND2021058。

1.2.2 肝組織脂代謝相關(guān)指標檢測 大鼠肝臟中非酯化脂肪酸（non-esterified fatty acids，NEFA）和甘油三酯（triglycerides，TG）水平檢測按照南京建成生物工程試劑盒說明書指定方法進行測定。

1.2.3 HE染色觀察肝臟組織病理學變化 取部分結(jié)腸組織用10%的甲醛溶液固定。將組織依次浸泡在不同梯度的酒精（30%-2 h，40%-2 h，50%-2 h，60%-2 h，70%過夜，80%-2 h，90%-2 h，100%-2 h，100%-2 h）里進行脫水，二甲苯透明（二甲苯 I-10 min，二甲苯 II＜10 min），軟蠟浸泡 40 min，硬蠟 I浸泡 1 h，硬蠟 II浸泡 1 h，最后硬蠟包埋。包埋好的石蠟制成切片（5 μm），40℃ 自來水中進行展片，60℃烤片。將組織依次浸泡在二甲苯 I、 II各10 min進行脫蠟，不同酒精梯度（100%-10 min，100%-10 min，95%-10 min，90%-10 min，80%-10 min，100%-10 min）水化，蒸餾水沖洗，蘇木精染色，1%鹽酸酒精分色，自來水沖洗，0.06%氨水返藍，伊紅快速染色30 s，不同酒精梯度脫水（80%-10 min，90%-10 min，95%-10 min，100%-10 min，100%-10 min），二甲苯 I、 II各10 min，然后用中性樹膠封片，室溫放置24 h以上，用光學顯微鏡觀察腸組織的變化情況。

1.2.4 Real-time PCR 檢測基因 IL-1β、TNF-α、TLR2、TLR9、FAS（fatty acid synthase） 的 mRNA 表 達 水平 Trizol法提取大鼠肝組織的總RNA，測定RNA濃度，要求OD260/280的比值在1.8-2.0之間，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL、Total RNA 500 ng，后用 RNase Free dH2O補至10 μL。各基因相對表達量按照公式2-△△ct進行計算，引物序列見表2。

表2 Real-time引物序列Table 2 Primer sequences of real-time PCR

1.2.5 統(tǒng)計學處理 所得數(shù)據(jù)使用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學差異分析。數(shù)據(jù)以均值±標準差（）的形成表示，按照Duncan’s多重比較法計算各組數(shù)據(jù)間顯著性差異，當P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響

如圖1所示，與Control對照組相比，NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量在HFD模型組中顯著升高（P＜0.01），V9對照組表達正常；與HFD模型組相比，各指標的含量在Berberine陽性藥物組和V9治療組中顯著降低（P＜0.01），說明乳雙歧桿菌V9可以改善NAFLD大鼠肝臟脂質(zhì)代謝異常。

圖1 肝臟中NEFA和TG的含量以及FAS和Fabp1的mRNA表達水平Fig.1 Contents of NEFA and TG，and mRNA expression of FAS and Fabp1 in the liver

2.2 乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠腸道細胞因子水平的影響

由于腸肝軸的存在，推測腸道中可能存在炎癥反應(yīng)。如圖2所示，與Control對照組相比IL-1β和TNF-α的含量在HFD模型組中顯著升高（P＜0.01），V9對照組沒有明顯差異；與HFD模型組相比，IL-1β和TNF-α的含量在Berberine陽性藥物組和V9治療組中顯著降低（P＜0.01），說明乳雙歧桿菌V9抑制了NAFLD大鼠腸道中炎性反應(yīng)。

圖2 腸道中IL-1β和TNF-α的表達水平Fig. 2 Expressions of IL-1β and TNF-α in the intestine

2.3 乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠腸道TLRs的影響

TLRs信號通路的激活促進炎癥細胞因子的表達。我們進一步研究V9是否影響腸道TLR受體的表達。如圖3所示，與Control對照組相比，TLR2和TLR9的mRNA水平在HFD模型組中顯著升高（P＜0.01），V9對照組無顯著變化；與HFD模型組相比，TLR2和TLR9的mRNA水平在Berberine陽性藥物組和V9治療組中顯著降低（P＜0.01），說明乳雙歧桿菌V9在NAFLD大鼠腸道的抗炎反應(yīng)中起到了重要作用。

圖3 腸道中TLR2和TLR9的表達水平Fig. 3 Expressions of TLR2 and TLR9 in the intestine

2.4 乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠腸道組織形態(tài)的影響

如圖4所示，通過H＆E染色觀察高脂飲食誘導的NAFLD大鼠腸道組織的形態(tài)學變化，結(jié)果顯示，在HFD模型組中結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)無明顯的改變。同樣在Control對照組、Berberine陽性藥物組和V9治療組，其腸道組織結(jié)構(gòu)均保持一定的完整性。但在乳雙歧桿菌V9作用后，腸道組織內(nèi)出現(xiàn)了大量的菌團，可能是通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群數(shù)量進而緩解了高脂飲食誘導的NAFLD。

圖4 V9對NAFLD大鼠腸道結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effects of V9 on the intestine structure in NAFLD rats

2.5 乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠腸道黏膜屏障的影響

構(gòu)成緊密連接重要成分的閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）和緊密連接蛋白（occludin），如圖5所示，與Control對照組相比ZO-1和occludin的表達在HFD模型組中顯著降低（P＜0.01），V9對照組表達正常；與HFD模型組相比，ZO-1和occludin的表達在V9治療組中顯著升高（P＜0.01），說明乳雙歧桿菌V9可以保護腸道屏障的完整性，改善NAFLD大鼠腸道的黏膜屏障功能。

圖5 腸道中ZO-1和occludin的表達水平Fig. 5 Expressions of ZO-1 and occludin in the intestine

3 討論

NAFLD是指在沒有引起繼發(fā)性脂肪堆積（例如過量飲酒）的情況下，肝臟中脂肪過多積聚的一種疾病。近年來，NAFLD患病率逐年上升，目前已經(jīng)發(fā)展成為全球最流行的慢性肝?。?3］。NAFLD與較高的心血管疾病（CVD）風險相關(guān)，盡管NAFLD在世界范圍內(nèi)的流行程度不斷上升，但截止到目前，尚無食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的NAFLD治療藥物，當下較熱的方法是通過飲食干預(yù)和改變生活方式［13-14］。本實驗以“腸肝軸”為理論依據(jù)，通過高脂飲食誘導NAFLD模型，探究乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠腸道炎癥因子表達和黏膜屏障結(jié)構(gòu)的影響。為了觀察乳雙歧桿菌V9對NAFLD大鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝的影響，分別測定了肝臟中的非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）、脂肪酸合成酶（FAS）和脂肪酸結(jié)合蛋白1（Fabp1）脂質(zhì)代謝相關(guān)指標。發(fā)現(xiàn)NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量在HFD模型組中顯著高于對照組，說明HFD模型組脂質(zhì)代謝紊亂，較易發(fā)生脂肪堆積進而轉(zhuǎn)變?yōu)橹拘愿窝?，但是乳雙歧桿菌V9與Berberine治療后，NAFLD大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂明顯得到緩解，說明乳雙歧桿菌V9在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂方面具有一定的作用。

NAFLD的主要治療目的是減少肝功能損害、肝細胞脂肪沉積和炎癥反應(yīng)。此外，腸道菌群發(fā)育與NAFLD的發(fā)生密切相關(guān)，改善腸道微生物群可以有效緩解NAFLD［15-16］。之前對肝硬化患者進行的一項隨機、雙盲、安慰劑研究表明，乳酸桿菌GGAT菌株53103（LGG），可以調(diào)節(jié)全身性炎癥，降低內(nèi)毒素血癥和腸道營養(yǎng)不良癥，并改善了腸道微生物組與代謝組的聯(lián)系［17］。本實驗通過Real-time PCR法檢測IL-1β和TNF-α的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)與HFD模型組相比，IL-1β和TNF-α的含量在Berberine陽性藥物組和V9治療組中顯著降低，說明乳雙歧桿菌V9有效抑制了NAFLD大鼠腸道中炎性細胞因子的釋放，進而減輕了腸道炎癥。

已經(jīng)研究證明，在高脂飲食誘導的NAFLD小鼠模型中，TLRs受體在從脂肪肝變性到脂肪性肝炎的進展中起關(guān)鍵作用。腸道菌群可能通過增加炎性細胞因子分泌，激活TLRs受體以及改變膽汁酸代謝來促進與NAFLD相關(guān)的肝硬化和肝癌的發(fā)展［18-20］。通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，乳雙歧桿菌V9有效降低了高脂飲食大鼠腸道中的TLR2和TLR9的mRNA水平，從而表現(xiàn)出抗炎活性。

腸道菌群的代謝產(chǎn)物可以通過不同機制影響NAFLD的發(fā)生。改變腸道菌群會增加腸道內(nèi)脂肪酸含量，使腸道通透性增高。進而使內(nèi)毒素通過門靜脈循環(huán)進入肝臟，導致炎癥反應(yīng)，從而損傷肝細胞［21］。腸道屏障功能包括了物理、化學、生物和免疫屏障的4個方面，都與NAFLD密切相關(guān)［22］。通過檢測閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）和緊密連接蛋白（occludin）在腸道內(nèi)的表達，發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌V9可以保護腸道屏障完整并通過調(diào)節(jié)TLRs受體表達，進而改善NAFLD。關(guān)于NAFLD的診斷和治療，由于發(fā)病機制的復(fù)雜性而收到多方面限制，所以對于新藥物和治療技術(shù)的探索顯得尤為重要。本實驗研究了乳雙歧桿菌V9處理對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠脂代謝、腸道炎癥和屏障功能的影響。采用益生菌改善NAFLD的研究較多，不同益生菌的效果和機理差異較大。本研究發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌V9效果較好，但仍然需要對乳雙歧桿菌V9的活性成分進行進一步鑒定，以便更好地開發(fā)利用乳雙歧桿菌V9。

4 結(jié)論

本實驗使用高脂飲食誘導建立大鼠NAFLD模型，通過觀察肝臟中脂質(zhì)代謝相關(guān)因子NEFA、TG、FAS和Fabp1的含量變化，以及腸道中IL-1β、TNF-α、TLR2和TLR9的含量變化，得出在乳雙歧桿菌V9干預(yù)下，可以改善NAFLD大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂和腸道炎癥。通過觀察大鼠腸道組織形態(tài)，以及ZO-1和Occludin的含量變化，發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌V9可以保護腸道屏障完整。