唐彬 劉文彬 李小波 王寧 金小寶

（廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院 廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510006）

紫杉醇（taxol）是一種二萜類抗癌化合物，已在臨床上廣泛應(yīng)用于晚期卵巢癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌等的治療［1-2］。紫杉醇市場(chǎng)需求大，但紫杉醇主要存在于資源有限、生長(zhǎng)緩慢的紅豆杉屬植物的樹(shù)皮中，且含量?jī)H有0.01%-0.07%，導(dǎo)致紫杉醇原料藥價(jià)格高昂，市場(chǎng)供不應(yīng)求［3］。目前，紫杉醇的獲得方法有天然植物提取法、化學(xué)全合成法、化學(xué)半合成法、植物體外細(xì)胞培養(yǎng)法、植物內(nèi)生真菌提取培養(yǎng)法以及代謝工程等［4］?；瘜W(xué)半合成是唯一得到應(yīng)用的工業(yè)化生產(chǎn)方法。紫杉醇的半合成指以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ（10-deacetylbaccatin III，10-DAB）為前體通過(guò)10步化學(xué)反應(yīng)合成紫杉醇［5］。7-木糖紫杉烷類化合物屬于紫杉醇母核類化合物，主要存在于紅豆杉的根、莖、葉中，含量豐富，這類化合物包括：7-木糖-10-去乙酰基紫杉醇（7-β-xylosyl-10-deacetylpaclitaxel，7-XDT）、7-木糖-10-去乙?；馍紝帀A、7-木糖-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ等，如7-XDT在紅豆杉樹(shù)皮中的含量高達(dá)0.5%，但是在傳統(tǒng)的制備工藝中，這類化合物往往被當(dāng)做副產(chǎn)物處理，沒(méi)有得到有效利用［6-7］。

7-木糖紫杉烷糖基水解酶（7-β-xylosyltaxanes glycoside hydrolases，7-β-xyl） 是 一 種 β-木 糖 苷 酶（EC3.2.1.37）。研究報(bào)道放線菌Leifsonia shinshuensis產(chǎn)生的7-β-xyl可通過(guò)水解7-XDT的C7位的木糖基團(tuán)生成10-去乙酰紫杉醇（10-deacetylpaclitaxel，10-DAT）和10-DAB［8］。10-DAT雖無(wú)法用于目前的紫杉醇的半合成，但在紅豆杉中，10-去乙酰巴卡亭III 10 β-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶（10-deacetylbaccatin III-10-β-O-acetyltransferase，DBAT）可直接通過(guò)C-10位羥基乙?；磻?yīng)將10-DAT轉(zhuǎn)化為紫杉醇［6］。蜚蠊、白蟻等蜚蠊目昆蟲(chóng)均有食木的習(xí)性，已有研究報(bào)道美洲大蠊腸道內(nèi)生菌可產(chǎn)生高活性木聚糖酶［9］，目前尚未見(jiàn)從美洲大蠊腸道內(nèi)生菌中發(fā)現(xiàn)7-β-xyl的相關(guān)報(bào)道。課題組前期從美洲大蠊腸道分離獲得159株放線菌和122株非放線菌［10］。本研究擬從美洲大蠊腸道內(nèi)生菌中篩選高產(chǎn)7-β-xyl的菌株，旨在為7-β-xyl提供新的酶源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 美洲大蠊腸道內(nèi)生菌，為本課題組前期分離所得，保存于廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要培養(yǎng)基 高氏合成I號(hào)培養(yǎng)基；木聚糖液體培養(yǎng)基：硫酸銨1.0 g/L，磷酸氫二鉀7.0 g/L，磷酸二氫鉀3.0 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，木聚糖2.0 g/L，蒸餾水溶解并定容至1 L，調(diào)節(jié)pH為7.2-7.4；木聚糖瓊脂培養(yǎng)基：在木聚糖液體培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，美國(guó)）；N-1300V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社，日本）；ZWY-1102C溫控回旋立式雙層搖床（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司，上海）；2695-2996高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司，美國(guó)）。

1.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑 7-XDT標(biāo)準(zhǔn)品（上海麥克林生化科技有限公司，Lot：C12006981）；10-DAT標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，Lot：MO1028SE13）；10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，Lot：H11S9X70008）；玉米芯木聚糖（上海源葉生物科技有限公司，Lot：Y04J11J117661）；4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷（上海源葉生物科技有限公司，Lot：K27D8B50806）；剛果紅（天津市福晨化學(xué)試劑廠）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

1.2.1.1 剛果紅透明圈法初篩產(chǎn)木聚糖酶菌株 用滅菌牙簽挑選單菌落點(diǎn)接在以木聚糖為唯一碳源的木聚糖瓊脂平板培養(yǎng)基上，于28℃培養(yǎng)7 d。0.1%的剛果紅浸染30 min，再用1 mol/L的NaCl洗液脫色30 min。測(cè)量透明圈直徑（D）、菌落直徑（d），并計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值（D/d）［11］。

1.2.1.2 熒光顯色法復(fù)篩產(chǎn)木聚糖酶菌株 木糖苷酶可水解4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷的木糖苷鍵，生成小分子基團(tuán)和熒光發(fā)色基團(tuán)，在365 nm下可發(fā)出強(qiáng)烈熒光［12］。將4-甲基傘形酮-β-D-木糖苷噴灑于培養(yǎng)7 d具有透明圈的菌落上，靜置1 h，在365 nm紫外燈照射下觀察，同時(shí)拍照記錄。

1.2.2 薄層色譜法篩選產(chǎn)7-β-xyl菌株 參照Wang等［13］的方法，選取D/d值較大且熒光顯色的菌株作為受試菌株，挑取單個(gè)菌落接種于裝有100 mL木聚糖液體培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，28℃、180 r/min培養(yǎng)3 d，進(jìn)行菌株增菌培養(yǎng)。再將5 mL的種子菌懸液接種于50 mL木聚糖液體培養(yǎng)基，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵2 d，在發(fā)酵液中加入4 mL 0.5 mg/mL的7-XDT甲醇溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 d。發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，取上清液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，萃取液減壓濃縮。每50 mL發(fā)酵液萃取物用1.5 mL甲醇溶解，以氯仿-甲醇（9∶1，V/V）為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層色譜法（thin layer chromatography，TLC）點(diǎn)板，5%硫酸乙醇溶液100℃加熱顯色。7-XDT、10-DAT、10-DAB標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用甲醇配制，濃度為0.5 mg/mL。

1.2.3 高產(chǎn)7-β-xyl菌株WA11-2-9的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定 菌株WA11-2-9接種于高氏合成Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)5-7 d，觀察菌落的形態(tài)特征，并通過(guò)革蘭染色法觀察菌體形態(tài)和顏色。根據(jù)《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》［14］測(cè)定生理生化特性。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程股份有限公司，中國(guó)）提取菌株WA11-2-9的DNA，使用通用引物（27F ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R ：TACGGCTACCTTGTTACGACTT）對(duì)目標(biāo)菌株的16S rDNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，并送華大基因公司測(cè)序。將WA11-2-9的16S rDNA序列與NCBI與已知的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將比對(duì)的結(jié)果利用Mega7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)將該菌株序列上傳至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，申請(qǐng)登錄號(hào)（GenBank Accession）。

1.2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10-DAT轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

1.2.4.1 10-DAT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分成配制0.05、0.10、0.15、0.20、0.30、0.40 mg/mL 的 10-DAT溶液。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定10-DAT峰面積。繪制10-DAT濃度-峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線。

色譜條件：流動(dòng)相為乙睛∶水（45∶55，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm，檢測(cè)器PDA（光電二極管陣列），進(jìn)樣體積10 μL，流速0.8 mL/min，柱溫室溫，色譜 柱 YMC-Pack ODS-AQ C18柱（250 mm×4.6 mm ODS-5 μm，12 nm）。

1.2.4.2 菌株WA11-2-9轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 將從章節(jié)1.2.2得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物樣品進(jìn)行HPLC分析，并與7-XDT、10-DAT、10-DAB三種標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行比對(duì)。重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物峰面積。樣品轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10-DAT峰面積代入10-DAT標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程，計(jì)算轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10-DAT的濃度。樣品轉(zhuǎn)化率（%）=生成10-DAT摩爾數(shù)/轉(zhuǎn)化前7-XDT摩爾數(shù)×100%。

1.2.5 7-β-xyl酶學(xué)性質(zhì)的初步研究

1.2.5.1 最適反應(yīng)溫度和pH 最適反應(yīng)溫度：將粗酶液分別置于20、25、30、35、40、45和50℃水浴條件下反應(yīng)后，測(cè)定β-木糖苷酶酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算其相對(duì)酶活。最適反應(yīng)pH：分別在 pH 為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的條件反應(yīng)后，測(cè)定β-木糖苷酶酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算其相對(duì)酶活。β-木糖苷酶的酶活測(cè)定方法參考湯勇等［15］的方法。

1.2.5.2 溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和金屬離子穩(wěn)定性 溫度穩(wěn)定性：將粗酶液分別在20、25、30、35、40、45和50℃提前孵育1 h，然后迅速冷卻至4℃，并測(cè)定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計(jì)算其相對(duì)酶活。酸堿穩(wěn)定性：將粗酶液用不同的pH的緩沖液稀釋10倍，4℃孵育1 h，并測(cè)定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計(jì)算其相對(duì)酶活。金屬離子穩(wěn)定性：配制 0.1 mol/L不同金屬離子溶液（Mg2+、Ca2+、Fe3+、Zn2+、Na+和K+），按 1 / 500 的體積比加入到酶液中，4℃孵育1 h，并測(cè)定β-木糖苷酶酶活，以未處理的酶液酶活為100%，計(jì)算其相對(duì)酶活。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

根據(jù)產(chǎn)透明圈和產(chǎn)熒光顯色的指示，測(cè)試的178株美洲大蠊腸道內(nèi)生菌中，55株菌具有木聚糖酶活性。如圖1-A所示，55株菌中包含41株放線菌和14株非放線菌。41株放線菌分屬于6個(gè)屬，包含鏈霉菌屬（Streptomyces）30 株、纖維菌屬（Cellulomonas）4株、小單胞菌屬（Micromonospora）3株、白蟻菌屬（Isoptericola）2株、無(wú)色桿菌屬（Achoromobacter）1株、戈登氏菌屬（Gordonia）1株。如圖1-B所示14株非放線菌包含3株巴氏菌（Pasteurella）、3株腸球菌（Enterococcus）、2株貪銅菌（Cupriavidus）、2株檸檬酸桿菌（Citrobacter）、2株嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、1株克呂沃爾氏菌（Kluyvera）、1株摩根氏菌（Morganella）。剛果紅水解圈結(jié)果如圖2所示，透明圈直徑（D）、菌落直徑（d）以及透明圈直徑與菌落直徑比值（D/d）如表1所示，菌株熒光顯色圖如圖3所示。

圖3 產(chǎn)木聚糖酶菌株的熒光顯色圖Fig.3 Fluorescence color image of xylanase-producing strain

表1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的菌落直徑、剛果紅透明圈直徑及比值Table 1 Colony diameters，Congo red transparent circles and their ratios of xylanase-producing strains（n=3）

圖1 產(chǎn)木聚糖酶菌株種屬分布Fig.1 Distribution of xylanase-producing strains

圖2 產(chǎn)木聚糖酶菌株的剛果紅水解圈Fig.2 Congo red transparent circles of xylanase-producing strains

2.2 產(chǎn)7-β-xyl菌株的篩選和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的初步鑒定

TLC結(jié)果顯示7-XDT的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以10-DAT為主，未見(jiàn)明顯10-DAB斑點(diǎn)。其中10株菌具有將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT的能力，分別為8株鏈霉菌（WA 1-37、WA 2-17、WA 2-34、WA 3-2-36、WA 4-65、WA 11-1-1、WA 11-1-3和WA 11-2-9）和2株貪銅菌（WA 14-2-3和WA 14-2-7）。其中菌株WA11-2-9有較好的轉(zhuǎn)化效果，故選取菌株WA11-2-9進(jìn)行后續(xù)研究。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC顯色如圖4所示。

圖4 菌株WA11-2-9轉(zhuǎn)化產(chǎn)物TLC結(jié)果Fig.4 TLC result of transformed product of strain WA11-2-9

2.3 菌株WA11-2-9的鑒定

2.3.1 菌株WA11-2-9的形態(tài)學(xué)觀察 菌株WA11-2-9菌落在高氏合成Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基上呈圓形，灰白色，干燥無(wú)光澤，不透明，輕微隆起（圖5-A）。革蘭染色為陽(yáng)性，菌體呈短桿形（圖5-B）。基本符合鏈霉菌的形態(tài)特征。

圖5 菌株WA11-2-9的形態(tài)學(xué)特征Fig.5 Morphological characteristics of strain WA11-2-9

2.3.2 菌株WA11-2-9的生理生化鑒定 WA11-2-9生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，結(jié)果基本符合Streptomyces enissocaesilis的生理生化特性。

表2 菌株WA11-2-9的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain WA11-2-9

2.3.3 菌株WA11-2-9的分子生物學(xué)鑒定 將PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖6-A）顯示目的條帶在1 000-2 000 bp之間。經(jīng)測(cè)序、Blast同源性比對(duì)，結(jié)果（圖6-B）表明該菌株與Streptomyces enissocaesilis strain NRRL B-16365處于同一分支，相似性高達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)特征可將菌株WA11-2-9鑒定為Streptomyces enissocaesilis。將菌株WA11-2-9的16S rDNA通過(guò) Bankit 向 GenBank 申請(qǐng)獲得登錄號(hào)為MZ411692。

圖6 菌株WA11-2-9 分子生物學(xué)鑒定Fig.6 Molecular biology identification of strain WA11-2-9

2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物10-DAT轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

2.4.1 10-DAT標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以10-DAT濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。10-DAT標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示。線性回歸方程為y = 2 587x +45.60，R2= 0.999，線性擬合良好。

圖7 10-DAT的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 10-DAT standard curve

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品和菌株WA11-2-9的HPLC分析圖譜結(jié)果 由圖8可知，7-XDT、10-DAT、10-DAB三種標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間分別為10.595 min、17.873 min和5.776 min。菌株WA11-2-9轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在10.595 min、17.852 min和5.762 min均有吸收峰，表明可WA11-2-9可將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT和10-DAB，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物以10-DAT為主，經(jīng)計(jì)算菌株WA11-2-9將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT的轉(zhuǎn)化率為21.52%。

圖8 菌株WA11-2-9轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC分析圖譜Fig.8 HPLC analyzing spectrum of transformed product of strain WA11-2-9

2.5 7-β-xyl酶學(xué)性質(zhì)的初步結(jié)果

2.5.1 最適反應(yīng)溫度和pH 7-β-xyl酶促反應(yīng)最適反應(yīng)溫度是35℃（圖9-A），最適反應(yīng)pH為6.0（圖9-B）。

圖9 7-β-xyl的最適反應(yīng)溫度和pHFig.9 Optimal reaction temperature and pH of 7-β-xyl

2.5.2 溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性、金屬離子穩(wěn)定性 7-β-xyl在20℃時(shí)最穩(wěn)定，隨著溫度逐漸上升，穩(wěn)定性逐漸下降（圖10-A）；7-β-xyl在pH 6-7范圍內(nèi)穩(wěn)定性較強(qiáng)，酶活力超過(guò)70%（圖10-B）；金屬離子的穩(wěn)定性如圖10-C所示，Ca2+、Zn2+、K+對(duì)酶活有促進(jìn)作用，其中Ca2+作用最為顯著，而Na+、Mg2+稍有抑制作用，F(xiàn)e3+有較強(qiáng)的抑制作用。

圖10 7-β-xyl的溫度穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和金屬離子穩(wěn)定性Fig.10 Thermal stability，pH stability and metal ion stability of 7-β-xyl

3 討論

β-木糖苷酶屬于木聚糖酶，是木聚糖類半纖維素水解酶系的重要組成部分，主要催化水解木糖苷基團(tuán)［16］。β-木糖苷酶主要存在于細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物和部分高等植物中［17-18］。7-β-xyl是一種β-木糖苷酶，已在放線菌和細(xì)菌、真菌中發(fā)現(xiàn)［19］。美洲大蠊，俗稱蟑螂，食性復(fù)雜，腸道生理生化環(huán)境

復(fù)雜特殊，腸道微生物菌群多樣［20］。本研究通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)美洲大蠊腸道中鏈霉菌、纖維菌、小單胞菌、棲白蟻菌、無(wú)色桿菌、戈登氏菌等放線菌和巴氏菌、腸球菌、貪銅菌、檸檬酸桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、克呂沃爾氏菌、摩根氏菌等非放線菌均可產(chǎn)木聚糖酶。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其中美洲大蠊腸道內(nèi)生鏈霉菌和貪銅菌均可產(chǎn)7-β-xyl。在此之前有其他學(xué)者已在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了 7-β-xyl，如 Wang 等［13］和劉宇等［21］分別研究發(fā)現(xiàn)馬特鏈霉菌、天藍(lán)色鏈霉菌具有產(chǎn)生7-β-xyl的能力。

微生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物自身的酶類進(jìn)行轉(zhuǎn)化，與化學(xué)合成法相比具有反應(yīng)條件溫和且選擇性強(qiáng)、環(huán)保無(wú)環(huán)境污染、副產(chǎn)物少、后處理簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)［22］。目前已有研究通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化法利用7-木糖紫杉烷類化合物或紅豆杉樹(shù)枝生產(chǎn)紫杉醇的半合成底物。李勇超等［23］發(fā)現(xiàn)用紅豆杉枝條與菌株 Trichoderma sp.耦合發(fā)酵，可用于生產(chǎn)10-DAB；朱鳳芝等［24］從污水處理廠污水中篩選中一株可將巴卡廷III高效轉(zhuǎn)化為10-DAB的團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）。本研究中高產(chǎn) 7-β-xyl的菌株WA11-2-9鑒定為Streptomyces enissocaesilis，暫未看到Streptomyces enissocaesilis能產(chǎn)生β-木糖苷酶的報(bào)道。7-XDT的轉(zhuǎn)化研究中顯示W(wǎng)A11-2-9可將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT和10-DAB，且以10-DAT為主。這說(shuō)明7-XDT發(fā)生了C-7木糖水解反應(yīng)生成了主要產(chǎn)物10-DAT，同時(shí)也發(fā)生了13位側(cè)鏈水解反應(yīng)產(chǎn)生了副產(chǎn)物10-DAB，結(jié)果同李建華［25］的一致。因此推測(cè)7-β-xyl有不同亞型，從而導(dǎo)致7-XDT酶解產(chǎn)物的多樣化，如只產(chǎn)10-DAT、只產(chǎn)10-DAB、既產(chǎn)10-DAT又產(chǎn)10-DAB。文獻(xiàn)報(bào)道7-XDT通過(guò)糖基水解酶LXYL-P1-2和DBAT相偶聯(lián)，將7-XDT直接轉(zhuǎn)化為紫杉醇［6］，這提示我們?cè)诤罄m(xù)研究中可以通過(guò)基因工程技術(shù)在紅豆杉細(xì)胞中過(guò)表達(dá)7-β-xyl基因，促進(jìn)紅豆杉中紫杉醇的表達(dá)。也可以通過(guò)在體外共表達(dá)7-β-xyl和DBAT，通過(guò)“一鍋法”酶催化合成紫杉醇。

進(jìn)一步研究顯示W(wǎng)A11-2-9將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT的轉(zhuǎn)化率為21.52%。李建華等［26］從土壤微生物中篩選獲得3株能夠特異將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT的微生物，但是轉(zhuǎn)化率僅為5%。在張衡的研究中通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化，使ITM-1512菌株10-DAT的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到 40.66%±13.22%［27］。Li等［28］對(duì)嗜熱細(xì)菌Dictyoglomus turgidum中的7-β-xyl進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得的重組酶將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT的轉(zhuǎn)化率達(dá)到了98%。Dou等［29］從云南紅豆杉的根際土壤中分離得到一株能產(chǎn)生7-β-xyl的Cellulosimicrobium cellulans菌株，并通過(guò)優(yōu)化7-β-xyl粗酶的反應(yīng)條件顯著提高7-β-xyl的轉(zhuǎn)化效率，3 h可以將98%的7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAT。上述研究提示我們?cè)诤罄m(xù)的研究中，應(yīng)通過(guò)優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)基、優(yōu)化反應(yīng)條件、酶學(xué)性質(zhì)的研究等方法進(jìn)一步提高WA11-2-9的7-β-xyl轉(zhuǎn)化效率。

4 結(jié)論

從178株美洲大蠊腸道內(nèi)生菌中篩選出55株菌產(chǎn)木聚糖酶，其中8株鏈霉菌和2株貪銅菌可產(chǎn)生7-β-xyl。高產(chǎn)菌株WA11-2-9經(jīng)形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定為Streptomyces enissocaesilis。菌株WA11-2-9可將7-XDT轉(zhuǎn)化為10-DAB和10-DAT，主要產(chǎn)物10-去乙酰紫杉醇的轉(zhuǎn)化率為21.52%。