鄒雪峰 李銘剛 包玲風 陳齊斌 趙江源 汪林 濮永瑜郝大程 張慶 楊佩文

（1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，昆明 650201；2. 云南大學云南省微生物研究所，昆明650091；3. 云南省煙草公司保山市公司，保山 678000；4. 大連交通大學環(huán)境化工學院/生物技術研究所，大連 116028；5. 云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，昆明 650205）

云南省國家自然保護區(qū)哀牢山原始森林地處青藏高原東南部、著名的橫斷山脈縱谷地帶，東亞季風氣候、青藏高原季風氣候和南亞東南亞熱帶季氣候在此匯集，特殊的地形-氣候-水文特征的耦合，土壤有機制質含量豐富，蘊藏豐富的具有重大經(jīng)濟價值的物種和種質資源［1］。從對土壤微生物分離、篩選和拮抗實驗結果看，該區(qū)域原始森林土壤環(huán)境貯藏豐富的產(chǎn)鐵載體微生物資源，值得進行深入發(fā)掘與利用［2］。鐵離子是生物生命活動中的重要元素成分，在生化代謝反應和電子傳遞等生命活動過程中發(fā)揮重要作用。土壤中鐵含量豐富，但主要以Fe3+形式存在，其氧化物或氫氧化物的溶解性極低，使鐵的生物有效性大大降低［3］。土壤微生物則可以通過合成和分泌對三價鐵離子具有高親和力的小分子化合物鐵載體來螯合自然界或宿主細胞中的鐵，以滿足自身生命活動需求。鐵載體微生物作為一種特殊的寶貴資源，與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關系十分密切，在土壤肥力的提高與保持、營養(yǎng)元素的轉化、作物病害防控、環(huán)境凈化與生態(tài)系統(tǒng)的平衡等方面起著極其重要的作用，是微生物肥料、微生物農(nóng)藥、微生物食品、微生物飼料、環(huán)境激素和環(huán)境工程微生物等創(chuàng)新藥物或環(huán)保制劑研究與開發(fā)利用的重要基礎［4］。隨著研究的深入，很多結果表明多數(shù)微生物能合成至少一種鐵載體，目前為止已發(fā)現(xiàn)500多種不同類型的鐵載體，其中270個已被結構表征［5］。利用微生物分泌的鐵載體是開發(fā)新型補鐵劑及補鐵添加劑，提高鐵素利用率的主要措施，但目前認識較清楚的鐵載體的數(shù)量還很有限，還有很多鐵載體，尤其是能更好地反映菌株特異性的次級鐵載體，有待進一步發(fā)現(xiàn)和研究［6］。

原始森林獨特的生理生化環(huán)境中形成的微生物菌群，與來自土壤、海洋、植物等環(huán)境中的微生物菌群具有明顯不同的生理生化特征，在生物學和功能活性方面表現(xiàn)出特異性和多樣性?；诎Ю紊皆忌知毺氐纳鷳B(tài)環(huán)境，開展鐵載體微生物資源發(fā)掘與利用研究，將為鐵載體研究提供必要的物種、遺傳和生理生化功能信息。本文對從哀牢山原始森林土壤環(huán)境中分離到的1株分泌型鐵載體真菌進行形態(tài)學和分子生物學鑒定，并研究其代謝產(chǎn)物對罹煙草青枯病土壤微生物生理生化功能的影響，以期為該菌株的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 采樣區(qū)概況 本研究的分泌型鐵載體真菌從云南省哀牢山國家級自然保護區(qū)森林土壤（100°49′-101°53′ E，23°95′-24°17′ N，海拔 780 m）中分離，該地區(qū)屬于亞熱帶季風氣候，年均氣溫18.9-22.6℃，降雨量2 200 mm。0-20 cm土壤有機質含量47.58 g/kg、含水量9.60%、鐵元素質量含量1.18%、pH 6.47。

罹煙草青枯病根際土壤采自云南省保山市昌寧縣大田壩鎮(zhèn)，煙草種植基地（98°32′-99°63′ E、24°92′-23°43′ N，海拔 2 000 m），亞熱帶季風氣候，年均氣溫15-17℃，年均降雨量1 290 mm。0-20 cm土壤有機質含量28.54 g/kg、速效氮134 mg/kg、速效磷27 mg/kg、速效鉀167 mg/kg、pH 4.71。

1.1.2 供試溶液及培養(yǎng)基的制備 本研究所需的CAS檢測液，取0.0605 g鉻天青S（chromeazurol S，CAS）溶于50 mL去離子水中，并加入10 mL FeCl3溶液攪拌混勻，標記為“A液”；再稱取0.072 9 g十六烷基三甲基溴化銨溶于40 mL去離子水，標記為“B液”；最后將A液緩慢倒入B液中，并攪拌均勻。1-5F1菌株菌懸液，菌株斜面試管中加入2 mL無菌水，刮取菌苔，用酶標儀或分光光度計測試其在OD625處讀取1的吸收值。將1-5F1菌株代謝物配制成0.05、0.15、0.45 mg/mL濃度的溶液備用。PDA培養(yǎng)基、無鐵查氏液體培養(yǎng)基、雙層顯色培養(yǎng)基的配制與Retamal-Morales等［7］的研究相同。

1.1.3 土壤樣品采集、處理 2017年采集的森林土壤樣品與2020年采集的煙草青枯病根際土壤樣品，兩個樣品分別在不同的采樣區(qū)采集，按照常規(guī)取樣法在采樣區(qū)域對角線5點取樣，然后混合均勻為1個樣，挑除根系等雜質后迅速放入做好標記的自封袋中，帶回實驗室置于4℃低溫冰箱中。

1.2 方法

1.2.1 菌株產(chǎn)鐵載體活性測定 對土壤樣品中分離到的菌株進行編號，對培養(yǎng)完成的單菌落用菌餅器取菌餅（直徑6 μm），接種在雙層顯色培養(yǎng)基的中心上層，每菌株3重復。將完成接種的培養(yǎng)基放置在25℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，觀察顯色層顏色變化。

挑選出培養(yǎng)基底層顏色變紅的菌株，加入到無鐵查氏液體培養(yǎng)基中，后在28℃、150 r/min的恒溫搖床（型號：HS-200B）上培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結束后吸取2-5 mL培養(yǎng)液用0.22 μm無菌濾膜過濾后加入等體積的CAS檢測液，靜置1 h后用全波長酶標儀（型號：Multiska GO）測定其 OD630（記作“As”），用相同方法測定未接菌的液體培養(yǎng)基的OD630作為參比值（記作“Ar”）。鐵載體的濃度用鐵載體活性單位（siderophore unit，SU）表示，SU（%）=［（Ar-As）/Ar］×100%，測定重復3次，取平均值進行比較分析。

1.2.2 菌株產(chǎn)鐵載體類型判定 在1 mL菌株培養(yǎng)濾液中加入1 mL濃度為0.25 μmol/L的CuSO4溶液和1 mL（pH 4.0）醋酸鹽緩沖液，用紫外分光光度計檢測。在190-280 nm之間出現(xiàn)吸收峰則說明螯合物為羧酸型（carboxylates）鐵載體。

1.2.3 菌株的形態(tài)學與分子生物學鑒定 觀察單個菌株在PDA平板培養(yǎng)基的形態(tài)，使用雙面刀片切下菌落（3 mm×3 mm），然后使用1%戊二醛固定30 min，蒸餾水清洗2次（20 min/次），采用不同濃度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）與丁叔醇（75%、100%）進行脫水15 min/次，置冰箱冷凍室固化，抽真空升華干燥，掃描電鏡觀察。

采用ITS-rDNA通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進行 PCR 擴增 ；反應體系 ：3.0 μL 10×Buffer、2.5 μL dNTP（2.5 mmol/L）、1.0 μL MgCl2（25 mmol/L）、1.0 μL DNA、1.0 μL ITS1（10 μmol/L）、1.0 μL ITS4（10 μmol/L）、1.0 μL Taq 酶（2.5 U/μL）、0.5 μL ddH2O；PCR 反應條件 ：94℃預變性 5 min，94℃變性 1 min，56℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，50個循環(huán)反應，循環(huán)后72℃延伸10 min，4℃保存，與Tistechok等［8］的相同，系統(tǒng)發(fā)育分析時排除堿基缺失位點，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法，用MEGA7構建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 提取菌株代謝物及罹煙草青枯病根際土壤處理 選擇25 g蒸熟大米裝入到500 mL組培瓶中，進行高壓蒸汽滅菌（121℃、30 min），然后加入1 mL菌懸液，充分攪拌，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)1-2月。完成發(fā)酵后在發(fā)酵瓶中加入95%的甲醇充分浸泡24 h，選擇5 mm孔徑濾紙過濾。旋轉蒸發(fā)儀（R-210 BUCHI）溫度設置45℃，轉數(shù)700 r/min，將濾液中有機溶劑完全蒸發(fā)。

選擇煙草青枯病根際鮮土樣，稱取30 g土樣倒入50 mL的離心管中，加入5 mL蒸餾水靜置5 min，再添加不同濃度的菌株代謝物。其中設置對照組CKA（病土加5 mL蒸餾水）與處理組（加5 mL菌株代謝物），在0.05 mg/mL濃度下標記為1-5F1A，0.15 mg/mL為1-5F1B，0.45 mg/mL為1-5F1C。

1.2.5 處理土壤蔗糖酶與脲酶活性及土壤Biolog測定新鮮土樣冷凍干燥，先粗研磨，過40目篩網(wǎng)，再次研磨過60目篩網(wǎng)。分別稱取0.1 g和0.2 g土壤樣本，采用DNS比色法［9］測定土壤蔗糖酶（S-SC）與脲酶（S-UE）。選擇蘇州格瑞思生物科技有限公司試劑盒，加對應的試劑在37℃水浴鍋中孵育，完成后土壤蔗糖酶在OD540與脲酶在OD578讀取吸光度值。土壤蔗糖酶活力（mg/d/g）=2.2×（△A+0.0445）/W×D，脲 酶 活 力（mg/d/g）=27.6×（△A+0.0051）/W。△A=A測定管-A對照管，W為土壤樣本實際稱取量，D為稀釋倍數(shù)。

采用Biolog-GN板來確定供試土壤微生物群落水平的生理分布，接種液的制備采用王雪梅等［10］的方法，接種后的ECO板在25℃條件下連續(xù)培養(yǎng)10 d，每隔24 h用酶標儀在OD595處讀數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 土壤微生物群落利用碳源的整體能力用平均顏色變化率（average well color development，AWCD）表示，土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)包括Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)，各指數(shù)計算方法與Ge等［11］相同，數(shù)據(jù)采用SPSS進行方差分析。

2 結果

2.1 產(chǎn)鐵載體活性菌株分離

本研究在云南省哀牢山森林土壤中分離到100多株菌株，經(jīng)過產(chǎn)鐵載體活性測定得到一株高產(chǎn)鐵載體活性菌株并編號為1-5F1。由PDA平板培養(yǎng)得到菌落形態(tài)（圖1-A）為圓形，棕黃色。通過雙層顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)（圖1-B）底層顏色由藍色變?yōu)榧t色，表示菌株能產(chǎn)生螯鐵離子的鐵載體。通過對1-5F1菌株產(chǎn)鐵載體活力值定量分析，得出1-5F1菌株產(chǎn)鐵載體活性單位（SU）為78.79%，相比本研究其他菌株的鐵載體活性都要高。

圖1 菌株平板培養(yǎng)（PDA與CAS平板）Fig.1 Plate culture of the strain（PDA and CAS plate）

2.2 鐵載體類型判定

通過使用分光光度計（EU-2200R）全波段掃描后發(fā)現(xiàn)（圖2），含有1-5F1菌株分泌鐵載體的培養(yǎng)濾液只在190-280 nm波段下出現(xiàn)最高吸收峰，故判定1-5F1菌株所產(chǎn)的鐵載體為羧酸型（carboxylates）。

圖2 1-5F1菌株產(chǎn)鐵載體在全波段下吸光度值Fig.2 Absorbance values of strain 1-5F1 siderophores in full band

2.3 菌株鑒定

通過掃描電鏡觀察（圖3），1-5F1菌株分生孢子間隔緊密，圓形，直徑在3.5-4 μm，分生孢子表面有平滑。在形態(tài)觀察基礎上，使用分子生物學方法擴增菌株的ITS序列。結果表明，1-5F1菌株ITS擴增序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，并與同源性高于80%的標準菌株序列進行同源比對（圖4），1-5F1菌株與百歲蘭曲霉（Aspergillus welwitschiae）同源性高達99.97%，故將1-5F1菌株鑒定為百歲蘭曲霉菌。

圖3 菌株分生孢子電鏡形態(tài)Fig.3 Microscopic morphologies of conidia of the strain

圖4 菌株1-5F1基于ITS基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain 1-5F1 based on ITS gene sequence

2.4 菌株代謝物對罹病土壤酶活力影響

土壤蔗糖酶與脲酶活力值一定程度上反映土壤微生物群落對碳和氮元素轉化能力，酶活力值越高土壤轉化能力越強。由圖5所示，與未施加的土壤相比，施加1-5F1菌株代謝物的土壤蔗糖酶與脲酶活力值高（P＜0.05）。在1-5F1菌株代謝物各濃度間對比下，土壤蔗糖酶與脲酶活力值均較高時對應的濃度為0.15 mg/mL。因此可見，隨著代謝物濃度增加，土壤蔗糖酶與脲酶活力值均呈現(xiàn)先增加后下降的情況，最適濃度為0.15 mg/mL。結果說明最適濃度的1-5F1菌株代謝物能夠顯著提高煙草青枯病土壤微生物對碳與氮源的利用。

圖5 1-5F1菌株代謝物對煙草青枯病根際土壤蔗糖酶（SSC）與脲酶（S-UE）活力的影響Fig.5 Effects of metabolites of 1-5F1 strain on the activities of sucrase（S-SC）and urease（S-UE）in the rhizosphere soil of tobacco bacterial wilt

2.5 菌株代謝物對罹病土壤碳源利用強度的影響

AWCD一定程度上可反應土壤微生物種群數(shù)量與群落的生理功能多樣性，平均顏色變化率值越大表明土壤微生物利用單一碳源能力越強，微生物活性也越高。由圖6所示，隨著培養(yǎng)時間的延長施加1-5F1菌株代謝物的土壤AWCD逐漸升高，未施加菌株代謝物的土壤總體趨向于平緩。在48-144 h時間段中，施加菌株代謝物的土壤AWCD曲線斜率最大，表明這一階段土壤微生物碳源代謝活性最高。在培養(yǎng)196 h后AWCD曲線趨向平緩，各處理間AWCD 表現(xiàn)為 ：1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A＞CKA＞CKB。結果表明，與未施加相比，施加1-5F1菌株代謝物可顯著提高土壤AWCD。

圖6 1-5F1菌株代謝物對煙草青枯病根際土壤平均顏色變化率（AWCD）隨時間的變化Fig.6 Mean color change rate（AWCD）of tobacco bacterial wilt rhizosphere soil treated by the metabolites of 1-5F1 strain with time

在各土壤處理下土壤微生物對主要碳源的優(yōu)先利用種類和程度也有顯著差異。由圖7所示，與未施加1-5F1菌株代謝物相比，施加菌株代謝物的土壤對氨基酸，碳水化合物，多聚化合物，芳香化合物和羧酸類化合物的利用能力更強（P＜0.05）。隨著濃度的提高土壤對各碳源利用的AWCD表現(xiàn)為1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A。以上均表明，受1-5F1菌株代謝物的影響煙草青枯病土微生物群落對碳源利用能力顯著增強，但隨著菌株代謝物濃度不斷提高病土微生物群落對碳利用能力出現(xiàn)先增加后降低的趨勢。

圖7 菌株不同濃度代謝物處理下土壤微生物群落對碳源利用能力的差異Fig.7 Differences in carbon source utilization abilities of soil microbial communities treated with different concentrations of metabolites of bacterial strains

2.6 菌株代謝物對罹病土壤微生物群落功能多樣性影響

采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Richness指數(shù)綜合表征了土壤微生物群落中功能的多樣性、分布的均勻度和豐富度。由圖8所示，隨著培養(yǎng)時間的延長Simpson指數(shù)在各處理下變化不顯著（P＞0.05），對于Shannon與Richness指數(shù)，當培養(yǎng)到196 h時各指數(shù)差值最大，表現(xiàn)為1-5F1B＞1-5F1C＞1-5F1A＞CKB＞CKA（P＜0.05）。與未施加 1-5F1菌株代謝物的土壤相比，施加菌株代謝物的土壤微生物群落功能多樣性與豐富度顯著提高。但隨著菌株代謝濃度的增加Shannon與Richness指數(shù)的變化與土壤AWCD指數(shù)一致，在1-5F1B處理下最高。結果說明，1-5F1菌株代謝物對煙草青枯病土壤微生物群落功能多樣性與豐富度具有促進作用。

圖8 菌株不同濃度代謝物處理下土壤微生物功能多樣性指數(shù)隨時間的變化Fig.8 Changes in soil microbial functional diversity index with time under different concentrations of metabolites from the strain

3 討論

大多由嗜鐵菌分泌的鐵載體可特異性螯合鐵離子，且被吸收的鐵離子又在菌株各項機能代謝過程中發(fā)揮著重要作用［12］。通過微生物對土壤環(huán)境中鐵離子的爭奪，可有效的改變土壤微生物群落結構［13-14］。在自然中存在大量可分泌鐵載體的微生物，其中已報道的真菌有曲霉屬Aspergillus［15］、青霉屬 Penicillium［16］、鏈格孢屬 Alternaria［17］、木霉屬 Trichoderma［18］、白僵菌屬 Beauveria［19］均可分泌鐵載體。本研究，通過對云南省哀牢山森林土壤中大量菌株篩選，獲得一株高產(chǎn)鐵載體活性的菌株（1-5F1）。對1-5F1菌株進行形態(tài)學與分子生物鑒定得出，該菌株與百歲蘭曲霉菌相似度最高。根據(jù)文獻報道，曲霉屬中可分泌鐵載體的有黃曲霉Aspergillus flavus［20］、黑曲霉 Aspergillus niger［21］、赭曲 霉 Aspergillus ochraceous［22］、 煙 曲 霉 Aspergillus fumigatus［23］，但相比1-5F1菌株（載體活性單位SU為78.79%）產(chǎn)鐵載體活性較低。通過測定菌株代謝物全波段吸收峰，對鐵載體化學結構進行初步鑒定。結果表明，菌株所產(chǎn)鐵載體類型為羧酸型。有研究指出，真菌主要合成分泌異羥肟酸型和羧酸型鐵載體［24］，與本結果相符合。在云南省哀牢山森林土壤中發(fā)現(xiàn)的百歲蘭曲霉菌，具有分泌鐵載體的能力系為首次報道。對自然界中嗜鐵菌株的發(fā)掘可為后續(xù)菌株的利用提供基礎。

根際作為植物-土壤-微生物相互作用的關鍵微域，每克根際土壤中大約有109個微生物定殖，其中土傳病害的發(fā)生主要依靠關鍵微域的相互作用［25］。煙草青枯病作為土傳病害，由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）從煙草根際侵入，引起植株發(fā)?。?6］。有學者研究發(fā)現(xiàn)，在煙草青枯病根際土壤中主要存在的微生物類群有真菌的子囊菌門、接合菌門、擔子菌門和壺菌門，細菌的變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門［27-28］。本研究將嗜鐵菌代謝物與煙草青枯病根際土壤微生物學特性相結合。通過之前分離到的嗜鐵菌（1-5F1），將其發(fā)酵處理提取菌株代謝物，施加到煙草青枯病根際土壤中，后進行240 h培養(yǎng)測定土壤中蔗糖酶與脲酶的活性，并對土壤進行Biolog分析與微生物功能多樣性分析。施加菌株代謝物的土壤蔗糖酶與脲酶活性顯著增強，說明受到菌株代謝物（含有鐵載體）的影響煙草青枯病根際土壤中微生物群落提高對碳和氮的利用能力。這一研究結果與Voβ等［29］相似，菌株代謝物（含有鐵載體）可促進土壤中微生物群落變得更為活躍。一方面的原因可能是微生物群落中存在特定的類群可利用施加的菌株代謝物促進自身的發(fā)展，另一方面的原因這種菌株代謝物可抑制土壤微生物群落中優(yōu)勢菌群的生長。

Biolog法是通過微生物對碳源的利用程度來反映土壤微生物功能活性，WACD值作為微生物活性有效指標能夠比較敏感地反映出土壤環(huán)境脅迫［30］。有研究表明，菌株所產(chǎn)生的鐵載體因其具有螯合鐵離子的獨特性質能夠廣泛參與多種微生物生理代謝，在微生物體中微量鐵離子有利于生長繁殖，但當鐵離子的加入過量時，生長就被抑制［31］。本研究中施加的產(chǎn)鐵載體菌株代謝物濃度分別為0.05、0.15、0.45 mg/mL，均可顯著提高煙草青枯病根際土壤微生物對碳源的利用程度，且隨著濃度提高WACD值表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，與前人的研究相符［32］。在利用碳源類型與程度中對氨基酸的利用更顯著，說明根際土壤微生物整體代謝能力加強，因此病土壤微生物受到產(chǎn)鐵載體菌株代謝物的環(huán)境脅迫下，對碳源利用能力顯著提高。通過進一步分析土壤微生物功能多樣性發(fā)現(xiàn)，施加菌株代謝的根際土壤Shannon與Richness指數(shù)顯著提高，說明土壤中微生物群落功能多樣性與豐富度均提高，可見不同濃度的產(chǎn)鐵載體菌株代謝物與煙草青枯病根際土壤微生物群落之間的相互作用十分密切［33］。

4 結論

從云南省哀牢山國家級自然保護區(qū)森林土壤中分離到一株產(chǎn)鐵載體活性單位為78.79%的菌株1-5F1，鑒定為百歲蘭曲霉，并初步鑒定鐵載體化學結構類型為羧酸型。1-5F1菌株代謝物可提高罹煙草青枯病病土蔗糖酶與脲酶活力值、AWCD、微生物利用碳源的功能多樣性和豐富度。