付雅麗 彭萬里 林雙君 鄧子新 梁如冰
(上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200240)
環(huán)境雌激素包括天然雌激素和合成雌激素,來源廣泛,包括畜牧業(yè)廢物、人類排泄物、個(gè)人護(hù)理品與藥廠廢水等[1]。環(huán)境雌激素在極低濃度(低至ng/L)條件下即會(huì)對生物體的生理代謝造成嚴(yán)重影響,三致效應(yīng)強(qiáng),是一類嚴(yán)重的環(huán)境污染物[2-3]。17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)是天然雌激素中雌激素活性最高的物質(zhì),對生物體影響最大[4]。
微生物修復(fù)因效率高、成本低、環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是去除環(huán)境雌激素污染的有效策略[5]。在細(xì)菌、真菌和藻類中均發(fā)現(xiàn)一些微生物,它們能以雌激素為碳源或能源,通過一系列復(fù)雜的生理代謝活動(dòng),降低雌激素毒性,并最終將其完全轉(zhuǎn)化為無害的終產(chǎn)物[6-13]。其中,細(xì)菌降解類固醇類化合物的分子機(jī)制被認(rèn)為包括9,10-seco途徑、4,5-seco途徑或2,3-seco途徑。睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosterone)通過9,10 -seco途徑降解雄激素[3];利用2,3-seco途徑,反硝化鏈球菌(Sterolibacterium denitrificans)可實(shí)現(xiàn)厭氧條件下的睪酮降解[14]。鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas spp.)KC8則利用4-羥基雌酮-4、5-雙加氧酶,通過4,5-seco途徑來代謝雌二醇[6]。17β-雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化是雌激素代謝的第一步與限速步驟,相關(guān)酶是啟動(dòng)雌二醇降解的關(guān)鍵酶;短鏈脫氫酶(short chain dehydrogenase/reductase,SDR)被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)菌類固醇激素降解的主要酶,已有不同來源的SDR被證實(shí)催化了雌激素的首步轉(zhuǎn)化反應(yīng)[15-18],另外,一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來[15,19]。該氧化還原酶超家族依賴于NAD(P)+,具有典型的βαβ折疊模式與保守Rossmann fold基序及由高度保守氨基酸構(gòu)成的催化中心[20-21]。然而,因目前已測序的雌激素降解菌株與鑒定的雌激素降解酶較少,細(xì)菌降解雌激素的途徑、關(guān)鍵酶及其催化機(jī)制仍不十分清楚。
我們前期分離鑒定了一株雌激素降解菌,香茅醇假單胞菌(Pseudomonas citronellolis)SJTE-3,并測定了其全基因組序列[22]。該菌株可利用17β-雌二醇(estradiol,E2)、雌酮(estrone,E1)、17α-炔雌醇(17α-ethinylestradiol,EE2)和睪酮(testosterone,TES)等類固醇激素及多環(huán)芳烴;24 h內(nèi)菌株可降解92%的雌二醇(10 μg/mL),其產(chǎn)物為雌酮。本研究從該菌株中分離篩選了一個(gè)短鏈脫氫酶SDR-X1,可有效催化雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化,并對其催化功能與酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了解析,旨為豐富雌激素降解酶的資源庫,推進(jìn)細(xì)菌代謝雌激素的研究奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株與質(zhì)粒 香茅醇假單胞菌SJTE-3為本實(shí)驗(yàn)室分離獲得,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(保藏編號為CGMCC No. 12720)[22]。 大 腸 桿 菌 菌 株 DH5α 購 自 美 國Invitrogen公司,菌株BL21(DE3)和質(zhì)粒pET-28a均購自美國Novagen公司。
1.1.2 培養(yǎng)基與化學(xué)試劑 17β-雌二醇(C18H24O2,Mw=272.38, 純 度 >99%), 雌 酮(C18H22O2,Mw=270.37,純度>99%),睪酮(TES,C19H28O2,Mw=288.42,純度 >99%)和 17α-炔雌醇(C20H24O2,Mw=296.40,純度>99%)均購自美國Sigma-Aldrich公司;其儲存液以DMSO溶解,濃度為10 mg/mL,-20℃保存。乙腈和乙酸乙酯(HPLC級)購自美國EMD公司。其它化學(xué)試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。微生物培養(yǎng)使用液體LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L,酵母提取物5.0 g/L,NaCl 8.0 g/L,pH 7.2)和無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基(KH2PO44.5g/L,K2HPO4·3H2O 13.75 g/L,(NH4)2·SO42.0 g/L,pH 7.4);固體LB培養(yǎng)基是在液體LB培養(yǎng)基中加入15.0 g/L的瓊脂粉。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒與凝膠回收純化試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司。限制性內(nèi)切酶與T4 DNA連接酶購自美國賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific有限公司;DNA聚合酶、RNA提取試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司(TaKaRa中國)。親和層析Ni-NTA樹脂和BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司。DNA引物合成與DNA序列測定由上海派森諾生物科技有限公司完成。
1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用BlastP和Blast分別查找與確定香茅醇假單胞菌SJTE-3(GenBank序號:NZ_CP015878.1)中短鏈脫氫酶SDR-X1(ANI14060.1/WP_043267487.1)序列及其編碼基因sdr-x1(A9C11_RS08750,1947150...1947896)序列。利用DNAMAN 6.0軟件,對短鏈脫氫酶SDR-X1和其它12個(gè)不同來源的短鏈脫氫酶進(jìn)行多序列比對分析,并利用MAGE 7.0.26軟件構(gòu)建進(jìn)化樹[23];所有參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。
1.2.2 高 效 液 相 色 譜 (high performance liquid chromatography,HPLC)測定雌激素物質(zhì)性質(zhì)與含量 利用乙腈溶解17β-雌二醇、雌酮、睪酮和17α-炔雌醇的標(biāo)準(zhǔn)品,設(shè)置不同濃度(1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL 和 50 μg/mL),測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC測定條件為:儀器為美國安捷倫公司的色譜儀Agilent 1260,使用Agilent exclip plus C18色譜柱(3.5 μm,4.6 mm×150.0 mm)和FLD熒光檢測器,流動(dòng)相為乙腈和水(1∶1,V/V),流速為1 mL/min,溫控為30℃。每個(gè)標(biāo)品設(shè)3個(gè)平行,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,利用峰面積計(jì)算不同類固醇激素的含量;標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值>0.99。
1.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng) 將香茅醇假單胞菌SJTE-3在LB固體平板上劃線過夜培養(yǎng),挑取單菌落接種在含10 μg/mL不同碳源(葡萄糖、乙醇、17β-雌二醇、雌酮、睪酮或17α-炔雌醇)的無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基中培養(yǎng),分別在培養(yǎng)6、12、18和24 h取樣。利用RNA提取試劑提取總RNA,通過Nanodrop紫外光譜儀(Nanodrop Technologies,美國)確定RNA含量。之后,利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系為20 μL,總RNA投入量為1 μg。熒光定量PCR反應(yīng)使用Premix Ex Taq(Probe qPCR)試劑盒;內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA編碼基因,sdr-x1基因的引物為sdr-x1-QF/QR(5′-CATTGTTCACCAGCACGTCG-3′/5′-ATGCCGTCGCCATCAACTAT-3′)。熒光定量 PCR反應(yīng)在定量PCR儀qTOWER3G touch中進(jìn)行(德國耶拿analytikjena);測定樣本的閾值周期Cq 值,采用 2-ΔΔCt法計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平的相對倍數(shù)變化[24];每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
1.2.4 表達(dá)SDR-X1的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組DNA,以其為模板,利用引物 sdr-x1-F/R(5′-ggggggAAGCTTGCATGACGTTT ACCCGCCCTA-3′/5′-ggggggGAATTCGACATGCGCAAA GTCATGCTG-3′)擴(kuò)增獲得基因sdr-x1片段;PCR 擴(kuò)增條件為95℃ 3 min,變性95℃ 30 s,退火 55℃ 30 s,延伸 72℃ 1 min,30 個(gè)循環(huán),72℃ 2 min,4℃ 5 min;電泳和DNA片段測序鑒定PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶(EcoR I和Hind III)處理PCR片段和質(zhì)粒pET28a后,用T4 DNA連接酶連接;轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中,在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板(LBK50)上涂布過夜培養(yǎng)后,獲得重組克??;提取質(zhì)粒后,測序鑒定重組質(zhì)粒序列,命名為質(zhì)粒pET-sdr-x1。
1.2.5 重組菌株BL21-SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化測定 將重組質(zhì)粒pET-sdr-x1化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)菌株中,構(gòu)建重組菌株BL21-SDR-X1。挑取菌株BL21-SDR-X1單菌落,接種到含50 μg/mL卡那霉素的3 mL LB 培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1∶100比例接種到新鮮的含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中搖培至OD600約0.6,加入0.1 mmol/L的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。4℃,8 000 r/min,離心5 min收集菌體,用無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基洗滌3次,轉(zhuǎn)入100 mL 含10 μg/mL 17β-雌二醇或0.1%乙醇的無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基中,37℃,220 r/min搖培;分別在3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h取樣1 mL。每個(gè)樣品中加入1/3體積的乙腈震蕩,用0.22 μm有機(jī)濾器過濾后,HPLC測定其17β-雌二醇的殘留量與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物(方法見1.2.2);每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
1.2.6 重組蛋白SDR-X1的表達(dá)純化 按照方法1.2.5,在200 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株BL21-SDR-X1,并用IPTG誘導(dǎo)蛋白SDR-X1表達(dá)。收集菌體后加入40 mL預(yù)冷的裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,5 mmol/L 咪 唑,5 mmol/L β-巰基乙醇,1 mmol/L 苯甲基磺酰氟,10% 甘油,pH 8.0)重懸菌體。冰上超聲破碎菌體后,于4℃,12 000 r/min,離心40 min收集上清。將上清加入平衡緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,5 mmol/L 咪唑,10% 甘油,pH 8.0)平衡后的鎳柱中,孵育30 min后流出;利用60 mL洗滌緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,20 mmol/L咪唑,10% 甘油,pH 8.0)洗去雜蛋白,用3 mL洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,300 mmol/L NaCl,150 mmol/L 咪唑,10% 甘油,pH 8.0)洗脫目標(biāo)蛋白。15% SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化的重組蛋白SDR-X1;利用BCA 蛋白檢測試劑盒測定重組蛋白SDR-X1濃度。
1.2.7 重組蛋白SDR-X1的酶學(xué)性質(zhì)測定 設(shè)計(jì)反應(yīng)體系,測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化不同類固醇激素等物質(zhì)的性質(zhì)。反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,30 mmol/L NaCl)、200 μmol/L NAD+、不同濃度的重組蛋白SDR-X1、不同類固醇激素底物(17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇、睪酮或雙酚A)與多環(huán)芳烴底物(芴、蒽、萘或菲);反應(yīng)體系為200 μL,對照為不含酶的反應(yīng)混合物。根據(jù)NADH產(chǎn)量表征底物的轉(zhuǎn)化情況,利用酶標(biāo)儀(Tecan,上海,中國)測定NADH的產(chǎn)量,檢測激發(fā)波長為355 nm,發(fā)射波長為460 nm[25]。測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的Km值和Vmax及其催化性質(zhì),包括最適反應(yīng)溫度與溫度耐受性(30℃-60℃),最適反應(yīng)pH(pH 4-11)及二價(jià)金屬離子的作用(Zn2+,Mn2+,Mg2+,Ni2+,Ca2+和 Cu2+)等。在含 17β-雌二醇(0.1 mmol/L)的重組蛋白SDR-X1反應(yīng)體系中,加入1/3體積的乙腈震蕩并用0.22 μm有機(jī)濾器過濾;利用HPLC方法,測定重組蛋白SDR-X1體外轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的效率及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行,重復(fù)3次,計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。
通過對香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組的注釋和挖掘,我們發(fā)現(xiàn)其基因組中的基因A9C11_RS08750(1947150..1947896)編碼了一個(gè)屬于短鏈脫氫酶超家族的氧化還原酶(WP_043267487.1);該基因被命名為sdr-x1,其編碼產(chǎn)物命名為SDR-X1。蛋白SDR-X1全長248個(gè)氨基酸,多序列比對顯示,蛋白SDR-X1與不同來源的SDR序列具有相似的二級結(jié)構(gòu),其二級結(jié)構(gòu)含兩個(gè)SDR家族的保守基序,與輔因子結(jié)合的Rossmann-fold區(qū)域GXXXGXG(9-15 aa)和活性位點(diǎn)區(qū)域YXXXK(157-161 aa),其中第157位酪氨酸殘基為質(zhì)子受體,催化中心由高度保守的Tyr157、Ser143、Asn112和Lys161組成(圖1-A)。以來自于Polaromonas sp. JS666的SDR蛋白(4iqg.1.A)為模型,利用SWISSMODEL對蛋白SDR-X1 的同源建模結(jié)果顯示,蛋白SDR-X1的三維模型與蛋白4iqg.1.A的高級結(jié)構(gòu)十分類似(圖1-B)。進(jìn)化分析顯示,蛋白SDR-X1與來源于睪丸酮單胞菌(C. testosteroni)P19的 FabG(WP_057091786.1)和赤紅球菌(Rhodococcus ruber)P14的短鏈脫氫酶(WP_010595922.1)進(jìn)化距離較接近(圖1-C)。因此,香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1為一個(gè)典型短鏈脫氫酶。
圖1 蛋白SDR-X1的多序列比對、高級結(jié)構(gòu)模型與進(jìn)化分析Fig.1 Multiple sequence alignment,advanced structural model and evolutionary analysis of SDR-X1 protein
香茅醇假單胞菌SJTE-3可利用17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇和睪酮等典型類固醇激素和多環(huán)芳烴[22]。因此,我們檢測了不同類固醇激素和多環(huán)芳烴對基因sdr-x1轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)情況。與以乙醇為碳源的組別相比,當(dāng)培養(yǎng)基中含有10 μg/mL的E2、E1和TES時(shí),菌株SJTE-3中基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄水平可在24 h或18 h被誘導(dǎo)上調(diào)2倍以上;而10 μg/mL的EE2可在培養(yǎng)6 h后誘導(dǎo)基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)約1.6倍(圖2)。這些結(jié)果表明,香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1可能參與了這些激素物質(zhì)的降解。
圖2 基因sdr-x1在菌株SJTE-3以不同激素為碳源時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcription levels of the gene sdr-x1 in strain SJTE-3 with different steroid hormones as carbon sources
以10 μg/mL的E2為唯一碳源,培養(yǎng)菌株可高表達(dá)基因sdr-x1的重組菌株BL21-SDR-X1,利用HPLC檢測了其對E2的轉(zhuǎn)化效能。結(jié)果表明,重組菌株BL21-SDR-X1在3 h即可轉(zhuǎn)化超過40%的E2,24 h重組菌株對E2的轉(zhuǎn)化達(dá)到58.83%(圖3-A)。由于E2可被吸附到細(xì)胞表面,因此盡管對照組菌株BL21-pET28a對E2無降解作用,但溶液中的E2含量也有一定程度降低。這說明高表達(dá)基因sdr-x1可促進(jìn)菌株對E2的降解。
通過異源表達(dá)與親和純化,我們獲得了重組蛋白SDR-X1。該蛋白大小為30.2 kD,蛋白產(chǎn)量約35 mg/L,純度不低于95%(圖3-B)。體外酶學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示,蛋白SDR-X1以NAD+/NADH為反應(yīng)輔因子,NADP+/NAD(P)H不能啟動(dòng)其反應(yīng)。通過檢測NADH產(chǎn)量測定重組蛋白SDR-X1對不同激素物質(zhì)和多環(huán)芳烴類的轉(zhuǎn)化效能,結(jié)果顯示該蛋白可在2 min內(nèi)轉(zhuǎn)化接近80%的E2或15%的睪丸酮,但對E1、E3、EE3及多環(huán)芳烴等均無反應(yīng)。這說明重組蛋白SDR-X1對雌二醇與睪丸酮有較好的轉(zhuǎn)化效能;與已報(bào)道的睪丸酮叢毛單胞菌(C. testosterone)的SDR相比,該酶的轉(zhuǎn)化率更高,周期更短[17]。進(jìn)一步測定了蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明,該酶對E2轉(zhuǎn)化反應(yīng)的 Km值為(0.039 86±0.004 061)mmol/L,Vmax值為(3.168±0.135)mmol/L/min/mg;其kcat值為1 595.06 /s,kcat/K比值為40 016.64/mmol/L/s(圖3-C)。這說明重組酶SDR-X1對E2的催化反應(yīng)具有較高的特異性與轉(zhuǎn)化效能。
圖3 重組菌株BL21-SDR-X1對E2的轉(zhuǎn)化與重組蛋白SDR-X1純化及其對E2的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig.3 Efficacy determination of recombinant strain BL21-SDR-X1 for transforming E2,purification of recombinant protein SDR-X1 and its transformation reaction to E2
我們測定了重組酶SDR-X1的酶學(xué)性質(zhì),包括最適溫度、最適pH、溫度耐受性與二價(jià)離子選擇性等;根據(jù)NADH的產(chǎn)量來表征該酶對底物的轉(zhuǎn)化情況[25]。最適溫度實(shí)驗(yàn)是在不同溫度下反應(yīng)15 min,測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果顯示,重組酶SDR-X1在30℃-60℃均可催化E2的氧化反應(yīng)。在反應(yīng)溫度不高于50℃ 時(shí),該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率隨溫度升高而提高;在50℃時(shí)反應(yīng)15 min,該酶可轉(zhuǎn)化約60%的E2;但當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到60℃,該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率下降(圖4-A)。溫度耐受性實(shí)驗(yàn)則是將酶在不同溫度下處理不同時(shí)間,再于37℃反應(yīng)15 min測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明,在37℃條件下,隨著反應(yīng)時(shí)間增加,該酶對E2的轉(zhuǎn)化率增加;在42℃和50℃條件下處理 30 min,對酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的效率影響不顯著,但隨時(shí)間延長,其催化活性有所降低,說明該SDR-X1酶對溫度具有一定耐受性(圖4-B)。反應(yīng)pH測定結(jié)果顯示,重組酶SDR-X1在pH 4-11時(shí)均可有效氧化E2,但在pH大于8的條件下效果較酸性條件好;但在偏酸與偏堿環(huán)境下,酶活性波動(dòng)較大,測定誤差較大,因此后續(xù)測定選擇了pH 8.0的條件(圖4-C)。不同二價(jià)離子對該酶活性的影響結(jié)果如圖4-D所示,Zn2+,Cu2+對重組酶SDR-X1的活性具有顯著抑制作用,Ni2+也有一定的抑制作用;Mn2+,Mg2+,Ca2+可明顯促進(jìn)該酶對E2的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步,我們利用HPLC檢測了該酶催化雌二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物,結(jié)果顯示,重組酶SDR-X1對E2轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物為E1;根據(jù)E2峰面積變化值來計(jì)算重組酶SDR-X1的轉(zhuǎn)化效率,該酶可在15 min內(nèi)將超過61.75%的E2轉(zhuǎn)化成E1(圖5)。利用HPLC方法測定雌二醇轉(zhuǎn)化效率較利用熒光檢測NADH產(chǎn)量表征的方法稍高,可能是由于溶液中NAD+/NADH平衡態(tài)所致誤差及熒光檢測誤差所致;故熒光檢測NADH產(chǎn)量可用于定性,HPLC檢測方法可更準(zhǔn)確定量。因此,該重組酶SDR-X1可在較高溫度和較高pH條件下有效轉(zhuǎn)化E2為E1,降解效能穩(wěn)定。
圖4 重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的酶學(xué)性質(zhì)測定Fig.4 Determination of the enzymatic properties of E2 transformed by recombinant enzyme SDR-X1
圖5 HPLC分析重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的反應(yīng)產(chǎn)物Fig. 5 HPLC analysis of reaction products of conversion of E2 by recombinase SDR-X1
隨著工業(yè)與社會(huì)的發(fā)展,環(huán)境雌激素污染日益嚴(yán)重,已成為威脅人類社會(huì)與生物圈的重大環(huán)境問題之一。微生物降解是去除環(huán)境雌激素、修復(fù)污染環(huán)境的有效手段,但至今微生物降解雌激素的機(jī)制仍不明確。本研究鑒定了雌激素降解菌香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1,證實(shí)其具有SDR的保守結(jié)構(gòu),屬于SDR超家族[26];體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明該酶可被雌二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,有效轉(zhuǎn)化雌二醇為雌酮,確定了其底物譜與催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)及酶學(xué)性質(zhì)。
雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是生物體啟動(dòng)雌激素降解的首個(gè)步驟;細(xì)菌SDR超家族的氧化還原酶被發(fā)現(xiàn)可催化睪酮和17β雌二醇的氧化反應(yīng),是微生物降解類固醇激素的關(guān)鍵酶[8-11,15-18,25]。香茅醇假單胞菌SJTE-3能利用多種雌激素物質(zhì)(17β-雌二醇、雌酮、雌三醇和17α-炔雌醇)和一些多環(huán)芳烴(萘、菲、蒽)為碳源,將其有效降解[22]。本研究中鑒定的短鏈脫氫酶SDR-X1可被17β-雌二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄,催化雌二醇的C17位氧化反應(yīng),其催化活性相似或高于已報(bào)道的雌激素降解SDR[11,14-17]。如紅球菌P14中17β-HSD 轉(zhuǎn)化E2的Km值和Vmax分別為 18.9 μmol/L 和 12.5 μmol/min/mg,惡臭假單胞菌SJTE-1中的17β-HSD催化E2轉(zhuǎn)化的Km值和Vmax分別為0.068 mmol/L和52.26 μmol/min/mg;本文鑒定的香茅醇假單胞菌SJTE-3中SDR-X1酶的Km值為(0.039 86±0.004 061)mmol/L,Vmax為(3.168±0.135)mmol/L/min/mg,高于紅球菌P14的17β-HSD活性,低于惡臭假單胞菌的17β-HSD活性,這和不同菌株對雌二醇的降解效能有關(guān)。降解酶的活性與穩(wěn)定性易受溫度、pH、離子條件等外界因素影響。該SDR-X1酶的降解效能穩(wěn)定,溫度耐受性較好,催化溫度范圍較其他短鏈脫氫酶較廣[15-16]。與已有的SDR類似,偏堿性環(huán)境有利于SDR-X1酶的反應(yīng)[15,27],這可能與偏堿性環(huán)境下雌二醇更易解離從而被轉(zhuǎn)化有關(guān)。有研究表明,添加鐵元素可以增強(qiáng)厭氧顆粒污泥(AnGS)對17β-雌二醇(E2)向雌酮的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)其去除[28];本研究也發(fā)現(xiàn)部分二價(jià)金屬離子如Mn2+,Mg2+,Ca2+對該SDR-X1酶的活性具有顯著促進(jìn)作用。因此,這說明香茅醇假單胞菌SJTE-3中的SDR-X1酶可穩(wěn)定有效轉(zhuǎn)化雌二醇,啟動(dòng)該菌株對雌激素的代謝過程。本工作的完成可推動(dòng)微生物中雌激素降解關(guān)鍵酶的功能研究與降解途徑解析。
鑒定了香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1,該酶參與了菌株對雌激素的降解。SDR-X1酶屬于典型的短鏈脫氫酶超家族,可轉(zhuǎn)化17β-雌二醇為雌酮,轉(zhuǎn)化效率高,對溫度和pH具有一定耐受性,Mn2+、Mg2+和Ca2+可提升酶活性。