付雅麗 彭萬里 林雙君 鄧子新 梁如冰

（上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240）

環(huán)境雌激素包括天然雌激素和合成雌激素，來源廣泛，包括畜牧業(yè)廢物、人類排泄物、個(gè)人護(hù)理品與藥廠廢水等［1］。環(huán)境雌激素在極低濃度（低至ng/L）條件下即會(huì)對生物體的生理代謝造成嚴(yán)重影響，三致效應(yīng)強(qiáng)，是一類嚴(yán)重的環(huán)境污染物［2-3］。17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是天然雌激素中雌激素活性最高的物質(zhì)，對生物體影響最大［4］。

微生物修復(fù)因效率高、成本低、環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是去除環(huán)境雌激素污染的有效策略［5］。在細(xì)菌、真菌和藻類中均發(fā)現(xiàn)一些微生物，它們能以雌激素為碳源或能源，通過一系列復(fù)雜的生理代謝活動(dòng)，降低雌激素毒性，并最終將其完全轉(zhuǎn)化為無害的終產(chǎn)物［6-13］。其中，細(xì)菌降解類固醇類化合物的分子機(jī)制被認(rèn)為包括9，10-seco途徑、4，5-seco途徑或2，3-seco途徑。睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosterone）通過9，10 -seco途徑降解雄激素［3］；利用2，3-seco途徑，反硝化鏈球菌（Sterolibacterium denitrificans）可實(shí)現(xiàn)厭氧條件下的睪酮降解［14］。鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas spp.）KC8則利用4-羥基雌酮-4、5-雙加氧酶，通過4，5-seco途徑來代謝雌二醇［6］。17β-雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化是雌激素代謝的第一步與限速步驟，相關(guān)酶是啟動(dòng)雌二醇降解的關(guān)鍵酶；短鏈脫氫酶（short chain dehydrogenase/reductase，SDR）被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)菌類固醇激素降解的主要酶，已有不同來源的SDR被證實(shí)催化了雌激素的首步轉(zhuǎn)化反應(yīng)［15-18］，另外，一些調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來［15，19］。該氧化還原酶超家族依賴于NAD（P）+，具有典型的βαβ折疊模式與保守Rossmann fold基序及由高度保守氨基酸構(gòu)成的催化中心［20-21］。然而，因目前已測序的雌激素降解菌株與鑒定的雌激素降解酶較少，細(xì)菌降解雌激素的途徑、關(guān)鍵酶及其催化機(jī)制仍不十分清楚。

我們前期分離鑒定了一株雌激素降解菌，香茅醇假單胞菌（Pseudomonas citronellolis）SJTE-3，并測定了其全基因組序列［22］。該菌株可利用17β-雌二醇（estradiol，E2）、雌酮（estrone，E1）、17α-炔雌醇（17α-ethinylestradiol，EE2）和睪酮（testosterone，TES）等類固醇激素及多環(huán)芳烴；24 h內(nèi)菌株可降解92%的雌二醇（10 μg/mL），其產(chǎn)物為雌酮。本研究從該菌株中分離篩選了一個(gè)短鏈脫氫酶SDR-X1，可有效催化雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化，并對其催化功能與酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了解析，旨為豐富雌激素降解酶的資源庫，推進(jìn)細(xì)菌代謝雌激素的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 香茅醇假單胞菌SJTE-3為本實(shí)驗(yàn)室分離獲得，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏編號為CGMCC No. 12720）［22］。 大 腸 桿 菌 菌 株 DH5α 購 自 美 國Invitrogen公司，菌株BL21（DE3）和質(zhì)粒pET-28a均購自美國Novagen公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與化學(xué)試劑 17β-雌二醇（C18H24O2，Mw=272.38， 純 度 ＞99%）， 雌 酮（C18H22O2，Mw=270.37，純度＞99%），睪酮（TES，C19H28O2，Mw=288.42，純度 ＞99%）和 17α-炔雌醇（C20H24O2，Mw=296.40，純度＞99%）均購自美國Sigma-Aldrich公司；其儲存液以DMSO溶解，濃度為10 mg/mL，-20℃保存。乙腈和乙酸乙酯（HPLC級）購自美國EMD公司。其它化學(xué)試劑均購自上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。微生物培養(yǎng)使用液體LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 8.0 g/L，pH 7.2）和無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基（KH2PO44.5g/L，K2HPO4·3H2O 13.75 g/L，（NH4）2·SO42.0 g/L，pH 7.4）；固體LB培養(yǎng)基是在液體LB培養(yǎng)基中加入15.0 g/L的瓊脂粉。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒與凝膠回收純化試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。限制性內(nèi)切酶與T4 DNA連接酶購自美國賽默飛世爾科技ThermoFisher Scientific有限公司；DNA聚合酶、RNA提取試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司（TaKaRa中國）。親和層析Ni-NTA樹脂和BCA蛋白檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司。DNA引物合成與DNA序列測定由上海派森諾生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 利用BlastP和Blast分別查找與確定香茅醇假單胞菌SJTE-3（GenBank序號：NZ_CP015878.1）中短鏈脫氫酶SDR-X1（ANI14060.1/WP_043267487.1）序列及其編碼基因sdr-x1（A9C11_RS08750，1947150...1947896）序列。利用DNAMAN 6.0軟件，對短鏈脫氫酶SDR-X1和其它12個(gè)不同來源的短鏈脫氫酶進(jìn)行多序列比對分析，并利用MAGE 7.0.26軟件構(gòu)建進(jìn)化樹［23］；所有參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值。

1.2.2 高 效 液 相 色 譜 （high performance liquid chromatography，HPLC）測定雌激素物質(zhì)性質(zhì)與含量 利用乙腈溶解17β-雌二醇、雌酮、睪酮和17α-炔雌醇的標(biāo)準(zhǔn)品，設(shè)置不同濃度（1 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL 和 50 μg/mL），測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。HPLC測定條件為：儀器為美國安捷倫公司的色譜儀Agilent 1260，使用Agilent exclip plus C18色譜柱（3.5 μm，4.6 mm×150.0 mm）和FLD熒光檢測器，流動(dòng)相為乙腈和水（1∶1，V/V），流速為1 mL/min，溫控為30℃。每個(gè)標(biāo)品設(shè)3個(gè)平行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，利用峰面積計(jì)算不同類固醇激素的含量；標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值＞0.99。

1.2.3 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR反應(yīng) 將香茅醇假單胞菌SJTE-3在LB固體平板上劃線過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種在含10 μg/mL不同碳源（葡萄糖、乙醇、17β-雌二醇、雌酮、睪酮或17α-炔雌醇）的無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)6、12、18和24 h取樣。利用RNA提取試劑提取總RNA，通過Nanodrop紫外光譜儀（Nanodrop Technologies，美國）確定RNA含量。之后，利用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒對總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL，總RNA投入量為1 μg。熒光定量PCR反應(yīng)使用Premix Ex Taq（Probe qPCR）試劑盒；內(nèi)參基因?yàn)?6S rRNA編碼基因，sdr-x1基因的引物為sdr-x1-QF/QR（5′-CATTGTTCACCAGCACGTCG-3′/5′-ATGCCGTCGCCATCAACTAT-3′）。熒光定量 PCR反應(yīng)在定量PCR儀qTOWER3G touch中進(jìn)行（德國耶拿analytikjena）；測定樣本的閾值周期Cq 值，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算轉(zhuǎn)錄水平的相對倍數(shù)變化［24］；每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.4 表達(dá)SDR-X1的重組質(zhì)粒的構(gòu)建 提取香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組DNA，以其為模板，利用引物 sdr-x1-F/R（5′-ggggggAAGCTTGCATGACGTTT ACCCGCCCTA-3′/5′-ggggggGAATTCGACATGCGCAAA GTCATGCTG-3′）擴(kuò)增獲得基因sdr-x1片段；PCR 擴(kuò)增條件為95℃ 3 min，變性95℃ 30 s，退火 55℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃ 2 min，4℃ 5 min；電泳和DNA片段測序鑒定PCR產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶（EcoR I和Hind III）處理PCR片段和質(zhì)粒pET28a后，用T4 DNA連接酶連接；轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中，在含50 μg/mL卡那霉素的LB平板（LBK50）上涂布過夜培養(yǎng)后，獲得重組克??；提取質(zhì)粒后，測序鑒定重組質(zhì)粒序列，命名為質(zhì)粒pET-sdr-x1。

1.2.5 重組菌株BL21-SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化測定 將重組質(zhì)粒pET-sdr-x1化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，構(gòu)建重組菌株BL21-SDR-X1。挑取菌株BL21-SDR-X1單菌落，接種到含50 μg/mL卡那霉素的3 mL LB 培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物按1∶100比例接種到新鮮的含50 μg/mL卡那霉素的10 mL LB培養(yǎng)基中搖培至OD600約0.6，加入0.1 mmol/L的異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h。4℃，8 000 r/min，離心5 min收集菌體，用無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基洗滌3次，轉(zhuǎn)入100 mL 含10 μg/mL 17β-雌二醇或0.1%乙醇的無機(jī)鹽MM培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min搖培；分別在3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h取樣1 mL。每個(gè)樣品中加入1/3體積的乙腈震蕩，用0.22 μm有機(jī)濾器過濾后，HPLC測定其17β-雌二醇的殘留量與轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（方法見1.2.2）；每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.6 重組蛋白SDR-X1的表達(dá)純化 按照方法1.2.5，在200 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株BL21-SDR-X1，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白SDR-X1表達(dá)。收集菌體后加入40 mL預(yù)冷的裂解緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪 唑，5 mmol/L β-巰基乙醇，1 mmol/L 苯甲基磺酰氟，10% 甘油，pH 8.0）重懸菌體。冰上超聲破碎菌體后，于4℃，12 000 r/min，離心40 min收集上清。將上清加入平衡緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，5 mmol/L 咪唑，10% 甘油，pH 8.0）平衡后的鎳柱中，孵育30 min后流出；利用60 mL洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，10% 甘油，pH 8.0）洗去雜蛋白，用3 mL洗脫緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，300 mmol/L NaCl，150 mmol/L 咪唑，10% 甘油，pH 8.0）洗脫目標(biāo)蛋白。15% SDS-PAGE蛋白電泳檢測純化的重組蛋白SDR-X1；利用BCA 蛋白檢測試劑盒測定重組蛋白SDR-X1濃度。

1.2.7 重組蛋白SDR-X1的酶學(xué)性質(zhì)測定 設(shè)計(jì)反應(yīng)體系，測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化不同類固醇激素等物質(zhì)的性質(zhì)。反應(yīng)體系包括反應(yīng)緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L NaCl）、200 μmol/L NAD+、不同濃度的重組蛋白SDR-X1、不同類固醇激素底物（17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇、睪酮或雙酚A）與多環(huán)芳烴底物（芴、蒽、萘或菲）；反應(yīng)體系為200 μL，對照為不含酶的反應(yīng)混合物。根據(jù)NADH產(chǎn)量表征底物的轉(zhuǎn)化情況，利用酶標(biāo)儀（Tecan，上海，中國）測定NADH的產(chǎn)量，檢測激發(fā)波長為355 nm，發(fā)射波長為460 nm［25］。測定重組蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的Km值和Vmax及其催化性質(zhì)，包括最適反應(yīng)溫度與溫度耐受性（30℃-60℃），最適反應(yīng)pH（pH 4-11）及二價(jià)金屬離子的作用（Zn2+，Mn2+，Mg2+，Ni2+，Ca2+和 Cu2+）等。在含 17β-雌二醇（0.1 mmol/L）的重組蛋白SDR-X1反應(yīng)體系中，加入1/3體積的乙腈震蕩并用0.22 μm有機(jī)濾器過濾；利用HPLC方法，測定重組蛋白SDR-X1體外轉(zhuǎn)化17β-雌二醇的效率及轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行，重復(fù)3次，計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果

2.1 香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白WP_043267 487.1為短鏈脫氫酶

通過對香茅醇假單胞菌SJTE-3基因組的注釋和挖掘，我們發(fā)現(xiàn)其基因組中的基因A9C11_RS08750（1947150..1947896）編碼了一個(gè)屬于短鏈脫氫酶超家族的氧化還原酶（WP_043267487.1）；該基因被命名為sdr-x1，其編碼產(chǎn)物命名為SDR-X1。蛋白SDR-X1全長248個(gè)氨基酸，多序列比對顯示，蛋白SDR-X1與不同來源的SDR序列具有相似的二級結(jié)構(gòu)，其二級結(jié)構(gòu)含兩個(gè)SDR家族的保守基序，與輔因子結(jié)合的Rossmann-fold區(qū)域GXXXGXG（9-15 aa）和活性位點(diǎn)區(qū)域YXXXK（157-161 aa），其中第157位酪氨酸殘基為質(zhì)子受體，催化中心由高度保守的Tyr157、Ser143、Asn112和Lys161組成（圖1-A）。以來自于Polaromonas sp. JS666的SDR蛋白（4iqg.1.A）為模型，利用SWISSMODEL對蛋白SDR-X1 的同源建模結(jié)果顯示，蛋白SDR-X1的三維模型與蛋白4iqg.1.A的高級結(jié)構(gòu)十分類似（圖1-B）。進(jìn)化分析顯示，蛋白SDR-X1與來源于睪丸酮單胞菌（C. testosteroni）P19的 FabG（WP_057091786.1）和赤紅球菌（Rhodococcus ruber）P14的短鏈脫氫酶（WP_010595922.1）進(jìn)化距離較接近（圖1-C）。因此，香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1為一個(gè)典型短鏈脫氫酶。

圖1 蛋白SDR-X1的多序列比對、高級結(jié)構(gòu)模型與進(jìn)化分析Fig.1 Multiple sequence alignment，advanced structural model and evolutionary analysis of SDR-X1 protein

2.2 17β-雌二醇可誘導(dǎo)基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄

香茅醇假單胞菌SJTE-3可利用17β-雌二醇、雌酮、17α-炔雌醇和睪酮等典型類固醇激素和多環(huán)芳烴［22］。因此，我們檢測了不同類固醇激素和多環(huán)芳烴對基因sdr-x1轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)情況。與以乙醇為碳源的組別相比，當(dāng)培養(yǎng)基中含有10 μg/mL的E2、E1和TES時(shí)，菌株SJTE-3中基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄水平可在24 h或18 h被誘導(dǎo)上調(diào)2倍以上；而10 μg/mL的EE2可在培養(yǎng)6 h后誘導(dǎo)基因sdr-x1的轉(zhuǎn)錄上調(diào)約1.6倍（圖2）。這些結(jié)果表明，香茅醇假單胞菌SJTE-3中的蛋白SDR-X1可能參與了這些激素物質(zhì)的降解。

圖2 基因sdr-x1在菌株SJTE-3以不同激素為碳源時(shí)的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcription levels of the gene sdr-x1 in strain SJTE-3 with different steroid hormones as carbon sources

2.3 重組BL21-SDR-X1菌株與SDR-X1蛋白均可有效轉(zhuǎn)化17β-雌二醇

以10 μg/mL的E2為唯一碳源，培養(yǎng)菌株可高表達(dá)基因sdr-x1的重組菌株BL21-SDR-X1，利用HPLC檢測了其對E2的轉(zhuǎn)化效能。結(jié)果表明，重組菌株BL21-SDR-X1在3 h即可轉(zhuǎn)化超過40%的E2，24 h重組菌株對E2的轉(zhuǎn)化達(dá)到58.83%（圖3-A）。由于E2可被吸附到細(xì)胞表面，因此盡管對照組菌株BL21-pET28a對E2無降解作用，但溶液中的E2含量也有一定程度降低。這說明高表達(dá)基因sdr-x1可促進(jìn)菌株對E2的降解。

通過異源表達(dá)與親和純化，我們獲得了重組蛋白SDR-X1。該蛋白大小為30.2 kD，蛋白產(chǎn)量約35 mg/L，純度不低于95%（圖3-B）。體外酶學(xué)反應(yīng)結(jié)果顯示，蛋白SDR-X1以NAD+/NADH為反應(yīng)輔因子，NADP+/NAD（P）H不能啟動(dòng)其反應(yīng)。通過檢測NADH產(chǎn)量測定重組蛋白SDR-X1對不同激素物質(zhì)和多環(huán)芳烴類的轉(zhuǎn)化效能，結(jié)果顯示該蛋白可在2 min內(nèi)轉(zhuǎn)化接近80%的E2或15%的睪丸酮，但對E1、E3、EE3及多環(huán)芳烴等均無反應(yīng)。這說明重組蛋白SDR-X1對雌二醇與睪丸酮有較好的轉(zhuǎn)化效能；與已報(bào)道的睪丸酮叢毛單胞菌（C. testosterone）的SDR相比，該酶的轉(zhuǎn)化率更高，周期更短［17］。進(jìn)一步測定了蛋白SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明，該酶對E2轉(zhuǎn)化反應(yīng)的 Km值為（0.039 86±0.004 061）mmol/L，Vmax值為（3.168±0.135）mmol/L/min/mg；其kcat值為1 595.06 /s，kcat/K比值為40 016.64/mmol/L/s（圖3-C）。這說明重組酶SDR-X1對E2的催化反應(yīng)具有較高的特異性與轉(zhuǎn)化效能。

圖3 重組菌株BL21-SDR-X1對E2的轉(zhuǎn)化與重組蛋白SDR-X1純化及其對E2的轉(zhuǎn)化反應(yīng)Fig.3 Efficacy determination of recombinant strain BL21-SDR-X1 for transforming E2，purification of recombinant protein SDR-X1 and its transformation reaction to E2

2.4 重組酶SDR-X1可穩(wěn)定高效轉(zhuǎn)化17β-雌二醇為雌酮

我們測定了重組酶SDR-X1的酶學(xué)性質(zhì)，包括最適溫度、最適pH、溫度耐受性與二價(jià)離子選擇性等；根據(jù)NADH的產(chǎn)量來表征該酶對底物的轉(zhuǎn)化情況［25］。最適溫度實(shí)驗(yàn)是在不同溫度下反應(yīng)15 min，測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1在30℃-60℃均可催化E2的氧化反應(yīng)。在反應(yīng)溫度不高于50℃ 時(shí)，該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率隨溫度升高而提高；在50℃時(shí)反應(yīng)15 min，該酶可轉(zhuǎn)化約60%的E2；但當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到60℃，該酶對E2的轉(zhuǎn)化效率下降（圖4-A）。溫度耐受性實(shí)驗(yàn)則是將酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再于37℃反應(yīng)15 min測定酶SDR-X1對雌二醇的轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明，在37℃條件下，隨著反應(yīng)時(shí)間增加，該酶對E2的轉(zhuǎn)化率增加；在42℃和50℃條件下處理 30 min，對酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的效率影響不顯著，但隨時(shí)間延長，其催化活性有所降低，說明該SDR-X1酶對溫度具有一定耐受性（圖4-B）。反應(yīng)pH測定結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1在pH 4-11時(shí)均可有效氧化E2，但在pH大于8的條件下效果較酸性條件好；但在偏酸與偏堿環(huán)境下，酶活性波動(dòng)較大，測定誤差較大，因此后續(xù)測定選擇了pH 8.0的條件（圖4-C）。不同二價(jià)離子對該酶活性的影響結(jié)果如圖4-D所示，Zn2+，Cu2+對重組酶SDR-X1的活性具有顯著抑制作用，Ni2+也有一定的抑制作用；Mn2+，Mg2+，Ca2+可明顯促進(jìn)該酶對E2的轉(zhuǎn)化。進(jìn)一步，我們利用HPLC檢測了該酶催化雌二醇轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物，結(jié)果顯示，重組酶SDR-X1對E2轉(zhuǎn)化反應(yīng)的產(chǎn)物為E1；根據(jù)E2峰面積變化值來計(jì)算重組酶SDR-X1的轉(zhuǎn)化效率，該酶可在15 min內(nèi)將超過61.75%的E2轉(zhuǎn)化成E1（圖5）。利用HPLC方法測定雌二醇轉(zhuǎn)化效率較利用熒光檢測NADH產(chǎn)量表征的方法稍高，可能是由于溶液中NAD+/NADH平衡態(tài)所致誤差及熒光檢測誤差所致；故熒光檢測NADH產(chǎn)量可用于定性，HPLC檢測方法可更準(zhǔn)確定量。因此，該重組酶SDR-X1可在較高溫度和較高pH條件下有效轉(zhuǎn)化E2為E1，降解效能穩(wěn)定。

圖4 重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的酶學(xué)性質(zhì)測定Fig.4 Determination of the enzymatic properties of E2 transformed by recombinant enzyme SDR-X1

圖5 HPLC分析重組酶SDR-X1轉(zhuǎn)化E2的反應(yīng)產(chǎn)物Fig. 5 HPLC analysis of reaction products of conversion of E2 by recombinase SDR-X1

3 討論

隨著工業(yè)與社會(huì)的發(fā)展，環(huán)境雌激素污染日益嚴(yán)重，已成為威脅人類社會(huì)與生物圈的重大環(huán)境問題之一。微生物降解是去除環(huán)境雌激素、修復(fù)污染環(huán)境的有效手段，但至今微生物降解雌激素的機(jī)制仍不明確。本研究鑒定了雌激素降解菌香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1，證實(shí)其具有SDR的保守結(jié)構(gòu)，屬于SDR超家族［26］；體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)表明該酶可被雌二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，有效轉(zhuǎn)化雌二醇為雌酮，確定了其底物譜與催化動(dòng)力學(xué)常數(shù)及酶學(xué)性質(zhì)。

雌二醇向雌酮的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是生物體啟動(dòng)雌激素降解的首個(gè)步驟；細(xì)菌SDR超家族的氧化還原酶被發(fā)現(xiàn)可催化睪酮和17β雌二醇的氧化反應(yīng)，是微生物降解類固醇激素的關(guān)鍵酶［8-11，15-18，25］。香茅醇假單胞菌SJTE-3能利用多種雌激素物質(zhì)（17β-雌二醇、雌酮、雌三醇和17α-炔雌醇）和一些多環(huán)芳烴（萘、菲、蒽）為碳源，將其有效降解［22］。本研究中鑒定的短鏈脫氫酶SDR-X1可被17β-雌二醇誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，催化雌二醇的C17位氧化反應(yīng)，其催化活性相似或高于已報(bào)道的雌激素降解SDR［11，14-17］。如紅球菌P14中17β-HSD 轉(zhuǎn)化E2的Km值和Vmax分別為 18.9 μmol/L 和 12.5 μmol/min/mg，惡臭假單胞菌SJTE-1中的17β-HSD催化E2轉(zhuǎn)化的Km值和Vmax分別為0.068 mmol/L和52.26 μmol/min/mg；本文鑒定的香茅醇假單胞菌SJTE-3中SDR-X1酶的Km值為（0.039 86±0.004 061）mmol/L，Vmax為（3.168±0.135）mmol/L/min/mg，高于紅球菌P14的17β-HSD活性，低于惡臭假單胞菌的17β-HSD活性，這和不同菌株對雌二醇的降解效能有關(guān)。降解酶的活性與穩(wěn)定性易受溫度、pH、離子條件等外界因素影響。該SDR-X1酶的降解效能穩(wěn)定，溫度耐受性較好，催化溫度范圍較其他短鏈脫氫酶較廣［15-16］。與已有的SDR類似，偏堿性環(huán)境有利于SDR-X1酶的反應(yīng)［15，27］，這可能與偏堿性環(huán)境下雌二醇更易解離從而被轉(zhuǎn)化有關(guān)。有研究表明，添加鐵元素可以增強(qiáng)厭氧顆粒污泥（AnGS）對17β-雌二醇（E2）向雌酮的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)其去除［28］；本研究也發(fā)現(xiàn)部分二價(jià)金屬離子如Mn2+，Mg2+，Ca2+對該SDR-X1酶的活性具有顯著促進(jìn)作用。因此，這說明香茅醇假單胞菌SJTE-3中的SDR-X1酶可穩(wěn)定有效轉(zhuǎn)化雌二醇，啟動(dòng)該菌株對雌激素的代謝過程。本工作的完成可推動(dòng)微生物中雌激素降解關(guān)鍵酶的功能研究與降解途徑解析。

4 結(jié)論

鑒定了香茅醇假單胞菌SJTE-3中的短鏈脫氫酶SDR-X1，該酶參與了菌株對雌激素的降解。SDR-X1酶屬于典型的短鏈脫氫酶超家族，可轉(zhuǎn)化17β-雌二醇為雌酮，轉(zhuǎn)化效率高，對溫度和pH具有一定耐受性，Mn2+、Mg2+和Ca2+可提升酶活性。