韓東晶 王志花 周寧 劉國慶 楊少華 汪文君

（合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，合肥 230601）

木質(zhì)素是自然界中最豐富的可再生能源之一［1］，也是自然界中最大的芳香劑儲備原料。與纖維素、半纖維素共同組成木質(zhì)纖維素，在植物細胞壁中，木質(zhì)素填充了纖維素與半纖維素之間的空間，并將木質(zhì)纖維素緊緊的包裹在一起［2］。其結(jié)構(gòu)主要是通過3個單木質(zhì)醇的自由基聚合過程而形成的，單體之間自由基偶聯(lián)導致形成大量的單元鍵合，這些單元間的連接主要包括醚鍵和碳碳鍵等，具有復雜性和異質(zhì)性［3］。由于木質(zhì)素這種復雜的結(jié)構(gòu)，使得對纖維素和半纖維素的酶解產(chǎn)生可發(fā)酵糖及高附加值產(chǎn)品的開發(fā)形成了一定的阻礙，所以木質(zhì)素能否有效的去除也影響著纖維素和半纖維素的有效利用［4］。對木質(zhì)素的處理通常有物理法、化學法和生物法［5］等，物理法主要是通過機械等物理方式破壞木質(zhì)素的顆粒大小及結(jié)構(gòu)進一步提高后續(xù)處理效果，化學法則是通過酸堿等試劑破壞木質(zhì)素單體之間的化學鍵使之分解，從而達到去除木質(zhì)素的目的。但是物理法與化學法存在成本高、對環(huán)境不友好、回收困難等缺點，而生物法清潔高效、反應能耗低，從而引起研究者的廣泛關(guān)注。生物處理主要借助于自然界中的細菌或真菌，真菌具有產(chǎn)生多種氧化還原酶的能力［6］，在木質(zhì)素解聚方面起到了重要的作用，而有的研究發(fā)現(xiàn)細菌在衍生自木質(zhì)素的異質(zhì)低分子量化合物的礦化中起主要作用［7］，如紅球菌、假單胞菌、鞘氨醇等能夠通過分泌過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶來降解木質(zhì)素［8-10］。與真菌相比細菌降解木質(zhì)素的能力較弱，但更快的生長速度和更寬的環(huán)境耐受性的特征使其可以大規(guī)模培育和生產(chǎn)，在木質(zhì)素降解方面具有很大的應用潛力［11］。

本研究從廢棄的白蟻菌圃中篩選出一株能夠固氮并具有木質(zhì)素降解能力的細菌，經(jīng)16S rRNA測序，結(jié)合形態(tài)觀察結(jié)果，命名為R.ornithinolytica RS-1；以堿木質(zhì)素為底物進一步探究了該菌株在降解木質(zhì)素過程中相關(guān)酶活的變化以及降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 供試白蟻菌圃購于廣東省茂名化州市。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 LB培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，瓊脂22 g，加蒸餾水配成1 000 mL，pH 7.2，121℃滅菌20 min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.2.2 Ashby無氮培養(yǎng)基 甘露醇10 g，KH2PO40.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2g，CaCO35 g，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌20 min。

1.1.2.3 堿木質(zhì)素培養(yǎng)基 （NH4）2SO42 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，NaCl 0.5 g，堿性木質(zhì)素5 g，瓊脂粉22 g，H2O 1 L，121℃滅菌20 min，液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.2.4 苯胺藍培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉22 g，苯胺藍0.4 g，H2O 1 L，121℃滅菌 20 min。

1.1.2.5 愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂粉22 g，0.4%愈創(chuàng)木酚，H2O 1 L，121℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗儀器 高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；智能恒溫振蕩器，天津歐諾儀器股份有限公司；無菌操作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；紫外分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；冷場掃描電鏡，日立公司；傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 取1 g的白蟻菌圃置于49 mL的無菌水中，于28℃、180 r/min的搖床震蕩3-4 h，之后離心過濾取上清得到菌懸液。取1 mL的菌懸液于9 mL的無菌水中得到10-1的菌懸液，按同樣步驟依次操作得到10-7、10-8、10-9濃度梯度。每個梯度取200 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，28℃下觀察菌株生長，之后再將單個菌落進行平板劃線直至得到純菌株。將得到的菌株畫線于無氮培養(yǎng)基上，觀察其是否可以在無氮源的情況下進行生長。

將實驗所篩選出來的菌種送至上海生工進行16S rRNA測序，將測序完成的16S rRNA基因序列拼接后，提交至NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫，并進行Blast同源性相似度對比，下載Blast比對序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA6.0軟件計算序列相似度，同時用Neighbor-joining法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定物種的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.2.2 木質(zhì)素降解酶活性的定性檢測 采用苯胺藍脫色平板進行過氧化物酶的測定，愈創(chuàng)木酚顯色平板進行漆酶的測定。將篩選出來的菌株在無菌操作條件下用接種環(huán)挑取一定量分別在兩種染料培養(yǎng)基上進行劃線，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察，以苯胺藍培養(yǎng)基中菌落周圍是否產(chǎn)生脫色圈判定是否有過氧化物酶的產(chǎn)生，以愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基中菌落周圍是否有顯色圈判定是否有漆酶的產(chǎn)生。

1.2.3 木質(zhì)素降解酶的定量測定 從LB固體培養(yǎng)基上切取一塊大小為0.5 mm2×0.5 mm2的菌塊接種于LB液體培養(yǎng)基，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)2-3 d，之后接種于堿木質(zhì)素液體培養(yǎng)基中，接種量為2%，進行為期一周的降解實驗，每個酶活進行3組平行測定。粗酶液的制備：取10 mL堿木質(zhì)素液體培養(yǎng)基于8 000 r/min離心10 min，得上清液即為粗酶液。

1.2.3.1 過氧化物酶的測定 過氧化物酶的測定時運用藜蘆醇測定法［12］，在試管中加入2.7 mL酒石酸-酒石酸鈉緩沖液（250 mmol/L，pH 4.5）和0.1 mL 10 mmol/L藜蘆醇溶液后，再0.1 mL的粗酶液，在28℃下加入20 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應2 min后于310 nm波長處測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個活力單位（U/mL）為每分鐘產(chǎn)生1.0 μmol藜蘆醇。計算公式如下：

ΔA：時間t內(nèi)吸光值的變化量；V1：反應體系的總體積；V2：加入樣品的體積；V：參與反應粗酶液的體積（mL）；N：粗酶液的稀釋倍數(shù)；m：浸提每克干曲酶所用緩沖液體積（mL/g干曲）；t：反應時間；ε：摩爾消光系數(shù)，ε310=9.3×103mol-1·cm-1。

①以“氵”(同“水”)為形符的字：江、河、湖、海、潑、灑、洶、涌、汁、湯；這些字都跟水有關(guān)，“江、河、湖、海”表示不同的水域，“潑、灑、洶、涌”表示水的運動狀態(tài)，“汁、湯”表示與水有關(guān)的液體。

1.2.3.2 錳過氧化物酶活力的測定［13］在試管中加入3.4 mL乳酸-乳酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 5.0）和0.1 mL 0.4 mol/L MnSO4溶液后，再準確加入稀釋的待測粗酶液0.4 mL，在28℃下加入0.1 mL 3.2 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應3 min后于240 nm波長處測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個酶活力單位（U/mL）為每分鐘產(chǎn)生 1.0 μmol Mn3+。ε240=6.5×103mol-1·cm-1。

1.2.3.3 漆酶活力的測定［14］在試管中加入2.7 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（50 mmol/L，pH 5.0）和0.2 mL 1.0 mmol/L ABTS溶液后，再準確加入待測粗酶液0.1 mL，在28℃下加入0.1 mL 20 mmol/L過氧化氫溶液啟動整個反應。反應2 min后于430 nm波長下測定吸光度OD值。在上述實驗條件下進行酶促反應，一個酶活力單位（U/mL）為每分鐘產(chǎn)生1.0 μmol ABTS。ε430=3.6×104mol-1·cm-1。

1.2.4 細菌對木質(zhì)素降解率的測定 用普魯士法［15］測定木質(zhì)素降解過程中的濃度變化情況，進行3組平行測定。

1.2.4.1 木質(zhì)素濃度標準曲線圖的繪制 取若干根試管進行編號，分別取1.5 mL不同濃度（10-40 μg/mL）堿木質(zhì)素加入到試管中，再依次加入100 μL的 8 mmol/L K3Fe（CN）6和 100 μL的 0.1 mol/L 的FeCl3到試管中，混勻后在30℃的搖床中反應5-10 min。在700 nm波長下測量吸光度，以去離子水作為空白對照。以木質(zhì)素濃度（μg/mL）為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制木質(zhì)素濃度標準曲線（圖 1）。

圖1 木質(zhì)素濃度標準曲線Fig. 1 Lignin concentration standard curve

1.2.4.2 木質(zhì)素濃度的測定及降解率的計算 液體堿木質(zhì)素培養(yǎng)基稀釋一定的倍數(shù)后，按上述方法測定其吸光度，將OD值代入到木質(zhì)素濃度標準曲線中，計算木質(zhì)素濃度及降解率。公式中A0為初始的木質(zhì)素濃度，A1為某時刻培養(yǎng)基中剩余的木質(zhì)素濃度。

1.2.5 掃描電鏡表面結(jié)構(gòu)分析 取未接菌處理0 d與接菌處理7 d后的堿木質(zhì)素培養(yǎng)基，于8 000 r/min離心10 min，棄上清，將沉淀物用冷凍干燥機進行干燥后，噴金進行掃描電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 木質(zhì)素降解菌的分離純化與鑒定

2.1.1 木質(zhì)素降解菌的分離純化 待培養(yǎng)基上長出菌落時，挑取單菌落進行多次劃線分離后，將單菌落接種于LB固體培養(yǎng)基，挑取菌落較大和生長速度較快的菌株在無氮培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)、觀察。發(fā)現(xiàn)菌株RS-1能夠生長，菌落光滑透明，呈圓形有輕微凸起（圖2-A）。采用苯胺藍和愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基觀察其脫色和顯色能力，將菌株接種于染料培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)菌株RS-1能夠使苯胺藍培養(yǎng)基產(chǎn)生明顯的透明圈（圖2-B），同時也觀察到菌株RS-1在愈創(chuàng)木酚培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生明顯的顯色圈（圖2-C）。但是僅通過染料脫色只能簡單的判斷產(chǎn)酶的特性，并不能具體的了解酶的活性大小，所以還需后續(xù)實驗加以驗證。

圖2 菌株RS-1在不同培養(yǎng)基上生長情況Fig. 2 Growth of strain RS-1 on different media

2.1.2 木質(zhì)素降解菌分子生物學鑒定及生長特性 將篩選出來的菌株送至上海生物工程公司進行16S rRNA測序，結(jié)果顯示菌株RS-1序列數(shù)為1 478 bp，將序列進行Blast同源性對比，與解鳥氨酸拉烏爾菌有99%的相似度。觀察其形態(tài)，兩頭圓形呈短桿狀（圖3-A），結(jié)合發(fā)育樹（圖4），將RS-1菌株暫時命名為R.ornithinolytica RS-1。菌體（包括死菌與活菌）密度用OD600表示，其生長曲線變化趨勢如圖3-B所示，培養(yǎng)至第2天時菌體生長達到穩(wěn)定期。

圖3 菌株RS-1掃描電鏡觀察圖（A）及生長曲線圖（B）Fig. 3 Scanning electron microscopic observation（A）and growth curve（B）of strain RS-1

圖4 菌株RS-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain RS-1

2.2 木質(zhì)素降解菌降解堿木質(zhì)素過程分析

2.2.1 木質(zhì)素降解相關(guān)酶活的測定 為了解細菌RS-1降解木質(zhì)素的情況，對堿木質(zhì)素液體培養(yǎng)基木質(zhì)素酶活進行測定。由圖5可以看出，在3種酶中錳過氧化物酶的活性最強，其次是過氧化物酶和漆酶，在為期7 d的培養(yǎng)過程中3種酶的酶活都是呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢。在前3 d錳過氧化物酶最大值為1 466.67 U/L，過氧化物酶最大值為177.42 U/L，漆酶的最大值為6.94 U/L。

圖5 木質(zhì)素降解過程中相關(guān)酶活隨時間變化情況Fig. 5 Variation of relevant enzyme activity over time during lignin degradation

2.2.2 木質(zhì)素降解率的測定 用普魯士法進行了木質(zhì)素濃度的測定，了解細菌在培養(yǎng)過程中降解木質(zhì)素的效果。未接菌0 d處理的堿木質(zhì)素濃度經(jīng)測定為23.606 μg/mL，經(jīng)過接菌處理的堿木質(zhì)素隨著降解時間的延長，木質(zhì)素濃度發(fā)生了變化，前3 d下降趨勢明顯，在第3天的時候達到17.89 μg/mL，此時木質(zhì)素的降解率達到24.21%，之后木質(zhì)素濃度及降解率變化緩慢（圖6）。

圖6 木質(zhì)素濃度以及降解率隨時間變化情況Fig. 6 Lignin concentration and degradation rate over time

2.3 木質(zhì)素降解菌降解特性分析

2.3.1 木質(zhì)素表面結(jié)構(gòu)分析 為觀察堿木質(zhì)素在降解過程中的變化，取未接種0 d處理與接菌處理7 d的堿木質(zhì)素，進行掃描電鏡觀察（放大倍數(shù)為500倍）。如圖7所示，圖7-A為未處理的堿木質(zhì)素表面結(jié)構(gòu)，整體呈現(xiàn)為凹凸不平的塊狀結(jié)構(gòu)，相對緊密；圖7-B是經(jīng)細菌處理7 d后的堿木質(zhì)素，呈現(xiàn)無規(guī)則分散的狀態(tài)且表面疏松多孔，與未處理組的相比顆粒直徑明顯減小，有的顆粒直徑小于100 μm，說明堿木質(zhì)素經(jīng)處理后表面結(jié)構(gòu)受到了很大程度的破壞，該菌對木質(zhì)素的降解有一定的效果。

圖7 堿木質(zhì)素處理前后掃描電鏡圖Fig. 7 Scanning electron micrographs before and after alkaline lignin treatment

2.3.2 傅里葉紅外光譜分析 通過掃描電鏡只能觀察堿木質(zhì)素表面結(jié)構(gòu)的變化，并不能說明堿木質(zhì)素內(nèi)部的變化，所以通過傅里葉紅外光譜對處理與未處理的樣品進行測定，觀察其相應官能團的變化情況。如圖8所示，處理與未處理組的譜圖有明顯的變化主要集中在1 800 cm-1-800 cm-1指紋區(qū)，1 602 cm-1、1 510 cm-1、1 425 cm-1處的吸收峰歸于木質(zhì)素組分中芳香族骨架的伸縮振動，1 462 cm-1處的吸收峰歸于C-H的變形振動和苯環(huán)的伸縮振動，木質(zhì)素中的紫丁香基型（S）單元和愈創(chuàng)木基型（G）單元分別在1 331 cm-1、1 251 cm-1處有伸縮振動，833 cm-1處的吸收峰歸于紫丁香基型（S）單元中C2和C6的平面C-H及對羥基苯基丙烷（H）單元的所在位置的伸縮振動。細菌處理過后的堿木質(zhì)素在1 034 cm-1、1 060 cm-1、1 118 cm-1、1 182 cm-1、1 300 cm-1、1 425 cm-1、1 478 cm-1、1 538 cm-1處吸收峰減小，這幾處與堿木質(zhì)素側(cè)鏈，C=O、C-O和芳香環(huán)骨架有關(guān)，說明木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到了破壞。

圖8 堿木質(zhì)素處理前后紅外譜圖變化情況Fig. 8 Variations in FIR spectra untreated and treated alkaline lignin treatment

3 討論

木質(zhì)素在植物中的作用是增加細胞壁的完整性和抵御病原體的侵襲，保護了內(nèi)部的纖維素和半纖維素結(jié)構(gòu)［16］?，F(xiàn)階段有許多研究對纖維素和半纖維素的降解比較關(guān)注，因為水解時產(chǎn)生可發(fā)酵的糖作為生產(chǎn)生物乙醇及乳酸等的原料，但是對這兩種物質(zhì)進行有效降解時，還得對木質(zhì)素進行去除［17］。由于木質(zhì)素復雜的結(jié)構(gòu)，尋求一種有效的降解方法是如今面臨的一個問題。張鵬飛等［18］從高溫堆肥中篩選出木質(zhì)素降解酶活力較高的菌株，鑒定為嗜熱嗜脂肪地衣芽孢桿菌。崔家榮等［19］采用檸條作為單一碳源的篩選培養(yǎng)基、苯胺藍篩選培養(yǎng)基從牲畜糞便以及檸條腐質(zhì)中分離篩選出對檸條木質(zhì)素具有降解作用的菌株D-11，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，在最優(yōu)條件下對檸條木質(zhì)素降解率為18.21%。王晶等［20］從腐木中篩選分離到一株木質(zhì)素降解菌株CCZU-WJ6，通過形態(tài)學觀察和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株屬于無色桿菌屬（Achromobacter sp.），通過單因素實驗進行條件優(yōu)化，使木質(zhì)素的降解率達到了32.1%。以上實驗結(jié)果表明，自然界中有許多具有木質(zhì)素降解能力的細菌還有待被挖掘。

木質(zhì)素降解實驗中發(fā)現(xiàn)細菌RS-1能夠分泌3種木質(zhì)素降解酶，且酶活大小依次為錳過氧化物酶＞過氧化物酶＞漆酶，但木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復雜，其降解酶系不能僅通過這3種酶來評價，后期實驗應通過其他手段如蛋白組學去探究其他的木質(zhì)素降解酶。李峰［21］從白蟻腸道進行木質(zhì)素降解菌的篩選，經(jīng)鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌屬，與本實驗不同的是這株菌在以堿木質(zhì)素為碳源生長過程中沒有檢測到錳過氧化物酶活力，只檢測到漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶活力。在第4天木質(zhì)素過氧化物酶的活力達到最高為105.6 U/L，漆酶在第3天活力達到最高為32 U/L?？赡苁且驗榫N來源地不同，雖然是同一菌屬，但是培養(yǎng)條件等各不相同也影響了相關(guān)酶的活性，具體差異性還應當通過其他先進的技術(shù)手段進行分析。

白蟻及白蟻菌圃作為一個復雜的微生物體系，其中含有各種各樣的細菌和真菌，之前的研究主要是真菌，尤其是白腐真菌［22-25］，挖掘高效木質(zhì)素降解菌，探索其木質(zhì)素降解特性和降解機制是研究的熱門，近些年來，由于細菌的獨特優(yōu)勢，對于細菌的研究慢慢的成為了一個新的方向［26-28］。實驗從廢棄白蟻巢中篩選出來的解鳥氨酸拉烏爾菌屬細菌，在環(huán)境中廣泛存在，具有很強的污染物降解能力［29］。通過掃描電鏡對處理前后的堿木質(zhì)素表征結(jié)構(gòu)進行觀察，發(fā)現(xiàn)細菌處理后有明顯的變化，李峰等［30］從白蟻腸道篩選出來的木質(zhì)素降解菌進行降解實驗后，通過掃描電鏡觀察其表面也是呈現(xiàn)出粗糙和較多的孔隙。在官能團上，處理與未處理的堿木質(zhì)素特征峰大都主要集中于1 800cm-1-800cm-1的指紋區(qū)，處理后的特征峰峰強減弱或位置發(fā)生了偏移，說明與木質(zhì)素相關(guān)的官能團結(jié)構(gòu)遭到了破壞。從以上結(jié)果表明細菌在降解木質(zhì)素方面具有很大的應用潛力，本實驗從廢棄白蟻菌圃中篩選出的細菌為降解木質(zhì)素提供了一條有效的途徑。

4 結(jié)論

本實驗從廢棄白蟻菌圃中篩選出一株菌株R.ornithinolytica RS-1，該菌具有一定的固氮能力，并能夠有效降解木質(zhì)素。