高亞慧 姜明國 豐景 周桂

（廣西民族大學(xué)海洋與生物技術(shù)學(xué)院 廣西多糖材料與改性重點實驗室 海洋生物資源保護與利用重點實驗室，南寧 530008）

化肥和農(nóng)藥在我國農(nóng)業(yè)歷史上發(fā)揮了巨大的增產(chǎn)作用，但長期使用化肥會造成土壤板結(jié)，肥力下降，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)降低，污染環(huán)境等一系列問題［1］。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)技術(shù)的進步，應(yīng)用微生物代替化肥和農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用前景。微生物肥料因其生產(chǎn)成本低、效果好、不污染環(huán)境以及有助于農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等特點受到廣泛關(guān)注。由于微生物肥料的快速穩(wěn)定發(fā)展，對PGPR的研究與開發(fā)也成為研究熱點［2］。PGPR是一類能夠在植物根際定殖，通過固氮、溶磷、抗病、增加植物對營養(yǎng)元素的吸收、調(diào)整植物激素濃度以及產(chǎn)生揮發(fā)性有機物等多種機制促進植物生長的有益微生物的總稱。微生物產(chǎn)生揮發(fā)性有機物是促進植物生長的一個重要促生機制，已有研究報道，枯草芽孢桿菌［3-7］，解淀粉芽孢桿菌［3，7］、產(chǎn)堿假單胞菌［8］、放線菌［9］、木霉真菌［10］、枝孢樣枝孢霉［11］等多種微生物產(chǎn)生的VOCs能夠通過調(diào)節(jié)植物激素［12］，誘導(dǎo)系統(tǒng)耐受性［13］及系統(tǒng)抗性［14］等多方面促進植物的生長。

本實驗從實驗室已保存的48株菌株中通過二分格平板實驗篩選得到一株所產(chǎn)VOCs對植物有明顯促生作用的潛在PGPR菌株GX14001，經(jīng)16S rRNA鑒定后進行了VOCs盆栽實驗，以進一步驗證其所產(chǎn)VOCs對植物的促生作用。通過GC-MS對GX14001所釋放的VOCs進行了成分檢測，之后對其固氮、溶磷、產(chǎn)IAA活性進行了研究。本研究為微生物菌肥資源的開發(fā)與利用提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為從海洋分離得到的48株可培養(yǎng)的功能菌株，保藏于廣西多糖材料與改性重點實驗室，菌株信息見表1。

表1 菌株信息Table 1 Strain information

1.1.2 植物材料 本氏煙草（Nicotiana benthamiana），上海青（Brassica chinensis L.）。

1.1.3 培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基，TSB培養(yǎng)基及MS培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術(shù)有限公司，蒙金娜有機培養(yǎng)基［15］，PKO 無機培養(yǎng)基［16］，Ashby無氮培養(yǎng)基［17］，埃利希氏反應(yīng)顯色試劑。

1.1.4 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒及所用引物合成：天根生化科技有限公司；PCR擴增反應(yīng)相關(guān)試劑及限制酶等：北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；PCR擴增儀：BioRad T100；智能人工氣候箱：浙江托普RTOP-1000B；搖床：上海旻泉MQD-B1R；固相微萃取探針，購自青島貞正分析儀器有限公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫5975C-7890A。

1.2 方法

1.2.1 細菌發(fā)酵液的制備 將供試細菌接入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30℃，200 r/min，24 h。之后將菌液用無菌水稀釋至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 細菌與煙草共培養(yǎng)

1.2.2.1 煙草預(yù)處理 用75%（V/V）醫(yī)用酒精對煙草種子上下輕緩顛倒消毒2-3 min后，再用1%的次氯酸鈉溶液（V/V）消毒2-3 min，之后用無菌水將煙草種子沖洗4-5遍，清洗種子表面的消毒劑，防止殘留消毒劑影響種子萌發(fā)。將消毒后的煙草種子點種在MS培養(yǎng)基上，用封口膜將平板封好后，放在25℃智能人工氣候箱培育至發(fā)芽出苗。智能人工氣候箱的條件為白天16 h，黑夜8 h，溫度25℃。

1.2.2.2 共培養(yǎng)實驗 本實驗采用9 cm二分格培養(yǎng)皿進行實驗，一側(cè)培養(yǎng)煙草，另一側(cè)培養(yǎng)細菌，由于物理界限，細菌的分泌及代謝物不能和煙草進行接觸和交流，但細菌釋放的揮發(fā)性有機物可通過培養(yǎng)皿上空與煙草進行交流和作用。將培養(yǎng)5 d生長狀況一致的煙草苗移栽到二分格培養(yǎng)皿的MS培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿移栽5棵，保持每棵煙草間距一致，在另一側(cè)TSA培養(yǎng)基接種10 μL 菌液，菌含量約為1×108CFU/mL，每個菌株做3個平行，以接種10 μL滅菌水作為對照。將平板用封口膜封好后，放入智能人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與之前一致，培養(yǎng)14 d之后對煙草的生物量進行測量與統(tǒng)計。

1.2.3 菌株鑒定 采用細菌基因組 DNA提取試劑盒提取供試菌株的總 DNA。用細菌通用引物27-F ：5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，1492-R ：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 進行 16S rRNA 基因的擴增。PCR反應(yīng)體系：模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×Taq PCR StarMIX with Loading Dye 25 μL，用ddH2O補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4 min ；95℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min ，32個循環(huán)；72℃延伸10 min；最后4℃ 10 min。將PCR 擴增產(chǎn)物送上海生工進行測序，所得序列通過Ezbiocloud進行序列同源性比對分析。

1.2.4 盆栽實驗 將上海青種子進行消毒處理后，播種于已高壓濕熱滅菌的土壤中。每個盆栽3株幼苗，待長出兩葉一心時，對其作處理。將菌株在TSA培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落至裝有TSB液體培養(yǎng)基的瓶子中，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h后放置盆栽下方，用封口膜將盆栽裝置接口處封好，防止細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物滲出，確保其能與植物的根部處于同一密閉空間。培養(yǎng)21 d后進行各項指標(biāo)的測量與記錄。

1.2.5 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用法（headspace solid phase microextraction/GC-MS，HS-SPME/ GC-MS） 分析菌株產(chǎn)生的VOCs成分

1.2.5.1 細菌樣品預(yù)處理 將供試細菌GX14001在裝有TSB液體培養(yǎng)基的固相微萃取瓶中進行活化培養(yǎng)，30℃，200 r/min培養(yǎng)24 h備用。

1.2.5.2 萃取探針的預(yù)處理 本實驗選擇活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯（ACAR/PDMS/DVB）復(fù)合涂層的固相微萃取探針，適合較寬范圍揮發(fā)性有機物的萃取。萃取探針使用前進行老化，老化條件為260℃，60 min。

1.2.5.3 GC-MS條件 實驗條件：載氣為He；不分流進樣；進樣口溫度為230℃；爐溫起始為40℃，保持3 min，以3℃/min升溫至140℃，保持2 min；再以20℃/min升溫至230℃，保持2 min；離子源為EI源；采用Nist 08譜庫進行檢索。

1.2.6 平板活性及IAA能力測定 通過點板法將細菌分別接種在蒙金娜有機培養(yǎng)基，PKO無機培養(yǎng)基，Ashby無氮培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件，30℃，5 d。

分泌IAA能力測定：取IAA標(biāo)準品與蒸餾水配置 成 5 μg/mL、10 μg/mL、12 μg/mL、15 μg/mL、18 μg/mL、20 μg/mL、22 μg/mL、24 μg/mL、28 μg/mL的標(biāo)準溶液，按體積比1∶1與Salksowskil比色液Ⅱ 混合，室溫避光放置30 min，以蒸餾水與Salksowski比色液Ⅱ等體積混合溶液為對照，測各濃度的OD530，以IAA濃度為橫坐標(biāo)，OD530為縱坐標(biāo)繪制IAA標(biāo)準曲線。將待測菌株接種于TSB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min，培養(yǎng)48 h。取1 mL發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL與Salksowski比色液Ⅱ等體積混勻，室溫下避光放置30 min，測定其OD530的值。其中，以未接菌的液體培養(yǎng)基與Salksowski比色液Ⅱ等體積混合液為對照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2016和IBM SPSS Statistics 21軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；采用單因素方差分析、LSD法進行差異性顯著檢驗；采用OriginPro 2018 進行柱狀圖的繪制。

2 結(jié)果

2.1 菌株產(chǎn)生的VOCs對煙草的促生作用

對48株菌株進行VOCs二分隔平板實驗，培養(yǎng)14 d后對煙草的生物量進行測量與統(tǒng)計。研究發(fā)現(xiàn)，GX13594、GX13747、GX14001、GX14016、GX-14066、GX14070、GX14201這7個菌株處理組的鮮重，根長，側(cè)根數(shù)，葉片長及葉片寬均顯著高于CK對照組（P＜0.01），結(jié)果表明這7個菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機物對煙草都具有明顯的促生作用（表2）。

表2 部分菌株產(chǎn)生的VOCs對煙草作用效果Table 2 Effect of VOCs produced by some strains on tobacco

經(jīng)過二分隔平板實驗復(fù)篩，得到一株潛在PGPR優(yōu)良菌株GX14001。如圖1所示，與對照組相比，GX14001處理組的煙草生長旺盛，植株健壯，葉片增大，根長及側(cè)根數(shù)都有明顯的增長。經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析，如圖2所示，GX14001處理組的鮮重，根長，側(cè)根數(shù)，葉片長及葉片寬相比對照組有極顯著差異（P＜0.01），分別增長了1003.3%、58.7%、196.1%、139.6%、113.0%。

圖1 菌株產(chǎn)生的VOCs對煙草的促生作用Fig. 1 Growth-promoting effects of VOCs produced by the strains on tobacco

圖2 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs對煙草的促生結(jié)果分析Fig. 2 Growth-promoting effects of VOCs produced by strain GX14001 on tobacco

2.2 菌株鑒定

將GX14001測序得到的16S rRNA基因序列，在Ezbiocloud網(wǎng)站上進行比對分析，采用MEGA6.5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。根據(jù)比對結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)GX14001與橙色微桿菌（Microbacterium aurantiacum）的同源性最高，親緣關(guān)系最近，因此GX14001被鑒定為橙色微桿菌。將GX14001菌株序列上傳到NCBI獲得其GenBank登錄號。

圖3 根據(jù)16S rRNA基因序列構(gòu)建菌株GX14001系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Constructed phylogenetic tree of strain GX14001 based on 16S rRNA gene sequence

2.3 盆栽實驗結(jié)果

如圖4所示，與對照組相比，GX14001產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物對上海青有明顯的促生作用，分別在葉片長，葉片寬，根長，鮮重，干重方面有明顯的作用。SPSS統(tǒng)計分析結(jié)果表明，與對照組相比，GX14001處理組在葉片長，葉片寬，鮮重及干重方面有極顯著差異（P＜0.01），分別增長了29.9%、29.5%、83.3%、104.8%，而在根長方面沒有顯著性差異。盆栽結(jié)果再次表明菌株GX14001所產(chǎn)生的VOCs對植物有明顯的促生作用。

圖4 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs對上海青的促生作用Fig. 4 Growth promoting effect of VOCs produced by strain GX14001 on rape

2.4 GX14001產(chǎn)生的VOCs成分分析

通過GC-MS分析了該潛在PGPR菌株產(chǎn)生的VOCs，與空白對照相比，發(fā)現(xiàn)存在7種特異性化合物（圖 5），主要為鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯、1，2，4-三甲苯、4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷（表3）。

表3 菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs成分Table 3 VOCs produced by strain GX14001

圖5 空白對照TSA及菌株GX14001產(chǎn)生的VOCs成分SPME-GC-MS分析總離子流圖Fig. 5 SPME-GC-MS analysis of total ion flow diagram of blank control TSA and VOCs produced by strain GX14001

2.5 菌株其他功能測定

對橙色微桿菌GX14001進行溶解有機磷、無機磷、固氮及產(chǎn)IAA能力測定，結(jié)果如表4所示，GX14001具有一定的溶解有機/無機磷及固氮的能力，但其分泌IAA能力一般，所產(chǎn)IAA量為1.737 μg/mL。研究結(jié)果表明GX14001還有具有潛在的其他方面的促生能力。

表4 菌株溶磷固氮及IAA能力測定匯總Table 4 Summary of determining strain’s IAA and ability of fixing nitrogen and solubilizing phosphorus

3 討論

微生物大致可通過直接和間接兩個促生機制來促進植物的生長［18］。其中直接促生機制主要是通過調(diào)整植物激素濃度，增加植物對養(yǎng)分的吸收以及釋放揮發(fā)性有機化合物（VOCs）來促進植物的生長；間接促生機制是通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性和抑制病原菌的入侵來促進植物生長［19］。與其他促生機制不同，微生物釋放的VOCs可以在不與植物進行物理接觸的情況下，通過提高植物生物量、抗病（蟲）性和非生物脅迫耐性來發(fā)揮對植物的促生作用，這是其優(yōu)勢所在［20］。本文主要研究了從海洋分離得到的橙色微桿菌GX14001的VOCs對植物生長的促生作用，對其產(chǎn)生的VOCs成分及菌株的其他促生特性進行了分析檢測。

迄今為止，關(guān)于PGPR所釋放的VOCs對植物促生作用的研究大多以假單胞菌屬和芽孢桿菌屬為主，微桿菌屬的報道較少。Cordovez等［21］研究表明微桿菌菌株EC8-VOCs通過調(diào)節(jié)植物根部硫和氮的代謝從而促進植物生長，并且發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)植物生長促進具有組織特異性的。本文研究發(fā)現(xiàn)橙色微桿菌GX14001-VOCs能夠誘導(dǎo)植物葉片和鮮重增加，在模式植物本氏煙草和經(jīng)濟作物上海青中均有體現(xiàn)。

對微生物產(chǎn)生的VOCs的收集和成分分析一般采用頂空固相微萃法［22］和氣相色譜-質(zhì)譜法。目前已報道的PGPR釋放的能促進擬南芥生長的VOCs主要有以下幾種：2，3-丁二醇以及合成2，3-丁二醇的前體乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）［3］，低濃度的1-己醇以及高濃度的正十五烷［23］，1-癸烯［10］等。Velázquez-Becerra等［24］研究表明運動節(jié)桿菌UMCV2產(chǎn)生的二甲基正十六胺能促進紫花苜蓿的生長發(fā)育。Yamagiwa等［25］發(fā)現(xiàn)促進植物生長的真菌Talaromyces sp.產(chǎn)生的β-石竹烯能夠有效促進甘藍型油菜幼苗的生長。Paul等［11］研究發(fā)現(xiàn)根際促生真菌 Cladosporium cladosporioides CL-1產(chǎn)生的VOCs，α-蒎烯、（-）反式 -石竹烯、2，2，5，5-四甲基四氫呋喃、脫氫香橙烯以及（+）-苜蓿烯對煙草幼苗具有促進能力。

本實驗篩選得到的GX14001所產(chǎn)生的VOCs經(jīng)GC-MS分析表明，與對照相比有7種特異性化合物，可分為苯基類和烷類化合物。其中烷類化合物有4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷四類。烷類化合物是目前已報道的具有活性的揮發(fā)性物質(zhì)，該GC-MS分析得到的十二烷和二十五烷曾在2017年被Jishma等［26］報道是能促進植物生長的VOCs成分。苯基類化合物有鄰乙基甲苯，1，2，3-三甲苯和1，2，4-三甲苯。苯基類化合物大都能在細菌/真菌的揮發(fā)性物質(zhì)中被檢測到，乙苯曾在生物測定實驗中被發(fā)現(xiàn)具有殺蟲作用［27］，最終結(jié)果表明十二烷，1，2，3-三甲苯，鄰乙基甲苯及二十五烷的含量相對較高，結(jié)合前人研究推測GX14001釋放的VOCs起主要促生作用的成分可能為十二烷及二十五烷，關(guān)于其他成分的具體作用還需進一步分析研究。

平板活性結(jié)果表明，橙色微桿菌GX14001還具有一定溶磷及固氮的能力，在之前的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微桿菌屬是一類重要的溶磷細菌［28-30］。微桿菌屬在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用也可追溯到2007年，Karlidag等［31］研究發(fā)現(xiàn)微桿菌FS01和芽孢桿菌M3和/或OSU-142組合具有提高蘋果樹產(chǎn)量、生長和營養(yǎng)的潛力。Sheng等［32］從重金屬污染土壤中的油菜根分離得到微桿菌G16，研究發(fā)現(xiàn)接種G16可提高油菜生物量和總鉛吸收量，同時G16表現(xiàn)出不同的多重重金屬和抗生素抗性特征，增加了溶液和土壤中的水溶性鉛。因此微桿菌屬在農(nóng)業(yè)方面有一定的前景應(yīng)用。

本研究發(fā)現(xiàn)橙色微桿菌所釋放的VOCs具有植物促生的作用，并對其進行了初步研究，但未對促生機理進行探究，因此還有待于深入研究菌株所釋放的 VOCs 對植物中相關(guān)通路及基因的影響，以期能夠為微生物資源的開發(fā)與利用提供理論支撐。此外，能否在土壤中定殖是評判PGPR的重要指標(biāo)，在實際應(yīng)用中PGPR的定殖也是其發(fā)揮作用的重要因素，之后需要對該潛在PGPR橙色微桿菌的定殖能力進行進一步的研究。

4 結(jié)論

本實驗通過二分隔平板實驗及VOCs盆栽實驗發(fā)現(xiàn)GX14001釋放的VOCs對煙草和上海青的根部及葉片的生長都有顯著的促進作用，該菌株經(jīng)16S rRNA分子生物學(xué)鑒定為橙色微桿菌。GC-MS結(jié)果顯示GX14001釋放的VOCs成分中起主要促生作用的成分為烷類。平板活性檢測結(jié)果顯示，GX14001菌株具有一定的溶磷和固氮作用，而產(chǎn)IAA能力較低。研究結(jié)果表明，該菌株促進植物生長主要是通過產(chǎn)生揮發(fā)性有機化合物（VOCs）來實現(xiàn)的，通過對菌株其他活性的檢測表明橙色微桿菌是促進植物生長的多功能有效菌株。