胡珊 梁衛(wèi)驅(qū) 黃皓 徐匆 羅華建 胡楚維 黃曉彥 陳仕麗

（東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中心，東莞 523000）

磷是植物生長(zhǎng)的必需元素之一，它參與了植物生長(zhǎng)發(fā)育多種生理、生化過程，對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要作用［1-2］。我國(guó)土壤中植物可吸收利用的有效磷含量匱乏，絕大多數(shù)的磷都以植物極難吸收的難溶礦物態(tài)存在。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通過施用磷肥補(bǔ)充磷元素［3］。研究表明，中國(guó)磷肥的當(dāng)季利用率僅有 5%-25%，大量的磷肥殘留在土壤中被土壤礦物質(zhì)吸附成為難溶性磷酸鹽，不能被植物吸收利用［4-5］。長(zhǎng)期施用化學(xué)磷肥還易造成磷素資源耗竭、環(huán)境污染、土壤板結(jié)等問題，不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［6］。因此，如何轉(zhuǎn)化土壤中的無效磷，提高土壤有效磷的含量，是解決土壤中磷素營(yíng)養(yǎng)缺乏的有效途徑。

解磷微生物（phosphate-solubilizing microorganisms，PSMs）是指能將無效態(tài)磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收態(tài)磷的微生物，包括解磷細(xì)菌、真菌和放線菌［7］。除了解磷作用，解磷微生物對(duì)植物可能還具有促生作用，能改善因大量施肥而造成的土壤退化等環(huán)境問題。因此，解磷微生物的篩選和應(yīng)用成為緩解土壤缺磷問題的有效途徑。近年來，在土壤、紅樹林和植物根際等環(huán)境中開展解磷微生物的研究及應(yīng)用已成為國(guó)內(nèi)外土壤肥料及植物營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一［8-11］。中藥植物以其特殊的藥理亦成為解磷菌篩選的研究對(duì)象，目前已有研究主要集中在從地黃［12］、當(dāng)歸［13］、潞黨參［14］及連翹［15］等藥用植物根際分離獲得解磷菌株，并對(duì)其固氮、解鉀、產(chǎn)生生長(zhǎng)激素和抑病機(jī)理等方面進(jìn)行了探索。

中成藥生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的中藥渣包含植物纖維、脂類、蛋白質(zhì)、多糖、黃酮、生物堿、萜類以及氮、磷和鉀等物質(zhì)，現(xiàn)主要用于制備生物有機(jī)肥［16-17］。魯耀雄等［18］研究中藥渣堆肥過程微生物菌群變化發(fā)現(xiàn)，堆肥過程中細(xì)菌數(shù)量多于放線菌和真菌的數(shù)量。王明歡等［19］從中藥藥渣中篩選出1株固氮菌、2株解磷菌和3株解鉀菌，并研究相應(yīng)固氮、解磷及解鉀能力。中藥渣堆肥有殘留的藥理作用和豐富的微生物，而有拮抗作用的解磷菌研究甚少。本研究擬從中藥渣堆肥中分離篩選解磷細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和拮抗作用的試驗(yàn)，旨在為開發(fā)高效、安全微生物菌肥篩選優(yōu)良菌株，助力生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 篩選材料 樣品取自東莞市農(nóng)業(yè)科學(xué)中心試驗(yàn)基地室外已堆放2個(gè)月中藥渣。

1.1.2 主要設(shè)備 電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-75G 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；SW-CJ-1F潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；正置熒光顯微鏡：奧林巴斯 Olympus；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-1800全波長(zhǎng)掃描分光光度計(jì)：日本島津公司；TSQ Quantum Ultra & Access MAX液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基（含瓊脂）、硅酸鹽培養(yǎng)基、酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、阿須貝無氮培養(yǎng)基、CAS檢測(cè)培養(yǎng)基：青島高科技公園海博生物技術(shù)有限公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；蒙吉娜卵磷脂培養(yǎng)基：蔗糖（葡萄糖）10.0 g，（NH4）2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，NaCl 0.3 g，MnSO4·7H2O 0.03 g，CaCO35.0 g，卵磷脂1.0 g（卵磷脂用時(shí)先溶于75%乙醇中），去離子水1 L，pH 7.2-7.4；KB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，甘油10 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，離子水 1 L，pH 7.0。

1.1.4 供試植物病原菌 水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.）、花生褐斑病菌（Cercospora arachidicola Hori）、玉米小斑病菌（Bipolaris maydis）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）、甘蔗赤腐病菌（Colletotrichum falcatum Went.）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）和冬瓜根腐病菌（Fusarium solani）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理系提供。

1.2 方法

1.2.1 解磷細(xì)菌的篩選 中藥渣室外堆肥2個(gè)月后，在堆肥處采用三點(diǎn)取樣法取藥渣混合為1份，用無菌袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室。

在無菌條件下，稱取10 g藥渣溶于90 mL的無菌水在120 r/min的振動(dòng)篩上搖動(dòng)1 h，并梯度稀釋成10-3、10-4和10-5倍的藥渣懸液，每個(gè)稀釋度各取100 μL均勻涂布于解磷細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，36℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察有無溶磷圈。挑選溶磷圈較大的菌落進(jìn)行平板劃線純化，反復(fù)進(jìn)行3次，同時(shí)用顯微鏡觀察菌落純度，直至獲得純培養(yǎng)。最后將所獲得的純培養(yǎng)菌株轉(zhuǎn)入終濃度為30%的甘油中密封保存于-20℃冰箱。

1.2.2 解磷細(xì)菌的復(fù)篩

1.2.2.1 采用溶磷圈法測(cè)定 解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的解磷作用。將待測(cè)菌株點(diǎn)接于有機(jī)磷固體培養(yǎng)基，3次重復(fù)，36℃的恒溫箱中培養(yǎng)3 d，根據(jù)透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）的比值（D/d）初步確定菌株解磷能力的強(qiáng)弱。

1.2.2.2 采用磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定 解磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的解磷作用。將篩選菌株接種于20 mL高溫滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于36℃，130 r/min下活化培養(yǎng)1 d，作為種子液。將種子液按1.5%（體積比）的接種量轉(zhuǎn)接至100 mL高溫滅菌的蒙金娜卵磷脂培養(yǎng)基中，以不接任何菌液的發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)3重復(fù)，于36℃，130 r/min下培養(yǎng)5 d。5 d后取50 mL發(fā)酵液4℃，9 000 r/min，離心15 min后取上清液，用磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定發(fā)酵液中的有效含磷量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組可溶性磷含量的差值即為待測(cè)菌株解磷量。

1.2.3 解磷細(xì)菌的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)觀察 參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第九版）［20］觀察解磷細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)菌落的形態(tài)、顏色等；挑取幼齡培養(yǎng)物，涂片、革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)、大小、革蘭氏染色反應(yīng)，以及芽孢的有無、形態(tài)和著生位置等。

1.2.3.2 API系統(tǒng)鑒定 使用法國(guó)梅里埃公司生產(chǎn)的API 20NE和API 20E系統(tǒng)對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.3.3 16S rDNA鑒定 提取細(xì)菌的基因組DNA后，采用細(xì)菌16S rDNA的通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R ：5′ -TACGGCTACCTTGTTACGACTT -3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果提交GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，并選取同屬內(nèi)近緣種的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析，利用MEGA11 ALPHA 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 解磷細(xì)菌促生拮抗因子測(cè)定［21-22］

1.2.4.1 解鉀指標(biāo)的測(cè)定 解磷細(xì)菌三區(qū)劃線到硅酸鹽培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)72 h，觀察是否有光滑透明油滴狀菌落。

1.2.4.2 固氮能力測(cè)定 將細(xì)菌接種于阿須貝無氮培養(yǎng)基平板上，以無菌水為對(duì)照，3次重復(fù)，平板置于36℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，第7天平板上有菌落者為陽性。

1.2.4.3 菌株產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）的檢測(cè) 以Salkowski法測(cè)定產(chǎn)吲哚乙酸的能力。將細(xì)菌接種于含100 mg/L色氨酸的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，取2 mL發(fā)酵液4℃，9 000 r/min，離心15 min后取上清液，每1 mL上清液加2 mL Salkowski試劑，室溫條件下暗處顯色1 h，測(cè)定OD530值。以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，并以IAA標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的OD530值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算發(fā)酵液中的IAA含量。

1.2.4.4 產(chǎn)生嗜鐵素能力的檢測(cè) 將細(xì)菌點(diǎn)接于CAS檢測(cè)培養(yǎng)基平板上，置于36℃培養(yǎng)7 d，觀察菌落周圍是否會(huì)出現(xiàn)明顯的橙色鐵載體暈圈，若產(chǎn)生暈圈，則表明細(xì)菌能分泌鐵載體的。

1.2.4.5 蛋白酶檢測(cè) 將細(xì)菌單菌落接種到酪蛋白培養(yǎng)基平板上，36℃培養(yǎng)2 d，觀察是否產(chǎn)生透明圈，若產(chǎn)生透明圈，則表明有蛋白酶產(chǎn)生。

1.2.5 解磷細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn) 采用K-B紙片擴(kuò)散法對(duì)解磷細(xì)菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。將篩選細(xì)菌接種于20 mL高溫滅菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中于36℃，130 r/min下活化培養(yǎng)24 h，均勻涂布于牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上。將浸有各種抗生素溶液的藥敏紙片均勻分布粘貼在培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)24 h后，測(cè)定抑菌圈直徑。根據(jù)NCCLS提供的標(biāo)準(zhǔn)判斷菌株對(duì)藥物的敏感程度。

1.2.6 解磷細(xì)菌對(duì)植物真菌病害的拮抗作用

1.2.6.1 解磷細(xì)菌的發(fā)酵液和無菌濾液制備 將細(xì)菌單菌落接種至LB培養(yǎng)基中，36℃、130 r/min振蕩培養(yǎng) 24 h，調(diào)整菌液OD600至1.0作為種子液。將種子液按1.5%（體積比）的接種量轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基中，28℃、130 r/min振蕩培養(yǎng)5 d后即得發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4℃，9 000 r/min離心15 min，取上清液用0.22 μm無菌濾膜過濾，獲得無菌濾液。

1.2.6.2 發(fā)酵液抑菌譜測(cè)定 按榮良燕等［23］的方法，采用平板對(duì)峙法測(cè)定細(xì)菌與病原真菌的拮抗作用。將真菌與細(xì)菌同時(shí)接種在PDA平板上，平板中心接種直徑為6 mm的真菌菌餅，距中心2 cm處等距離三點(diǎn)接種YP5發(fā)酵液（用加液槍將20 μL菌液垂直滴在培養(yǎng)基上），以不接種細(xì)菌的真菌平板為對(duì)照，每種組合3個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，在對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平板時(shí)，測(cè)量真菌距細(xì)菌遠(yuǎn)端和近端的半徑，按式（1）計(jì)算細(xì)菌對(duì)病原真菌的抑制率。抑制率越高，細(xì)菌對(duì)真菌的抑制作用越強(qiáng)。

無菌濾液的抑菌率測(cè)定［24］：帶毒培養(yǎng)基法。將無菌濾液按體積濃度5%與50℃左右的PDA培養(yǎng)基混合倒平板，不加無菌濾液的PDA作為對(duì)照。在混合培養(yǎng)基中央放置直徑6 mm的真菌菌餅，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，在對(duì)照菌落長(zhǎng)滿平板時(shí)，按式（1）計(jì)算測(cè)量菌落直徑并計(jì)算抑制率。

1.2.7 解磷細(xì)菌產(chǎn)申嗪霉素的定量分析鑒定

1.2.7.1 發(fā)酵培養(yǎng)條件［25-26］從LB平板上挑取細(xì)菌單菌落接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基36℃，130 r/min中振蕩培養(yǎng)24 h，調(diào)整菌液OD600至1.0作為種子液。按1.5%的接種量將種子液分別接種至KB培養(yǎng)基和黃豆浸粉培養(yǎng)基中，分別在36和28℃，130 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120 h。將發(fā)酵液于4℃，9 000 r/min離心15 min，取上清液。

1.2.7.2 申嗪霉素檢測(cè)［27］將YP5發(fā)酵的上清液用甲醇稀釋，離心，取上清液，濾膜過濾后進(jìn)樣分析。分析參數(shù)如下：流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A），甲醇（B）；流速為0.4 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；色譜柱為 Hypersil-Gold-C18（100×2.1 mm，5 μm）；梯 度洗脫程序?yàn)?-2 min，95% A；2 min-6 min，95%-2% A；6 min-8 min，2% A；8.1 min-10 min，2%-95% A。用甲醇溶解申嗪霉素標(biāo)準(zhǔn)品配置標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0及Microsoft Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析（One-way ANOVA），以最小顯著性差異法（LSD）多重比較檢驗(yàn)不同處理之間的差異顯著性（α=0.05）。

2 結(jié)果

2.1 解磷細(xì)菌的篩選及解磷能力測(cè)定

利用有機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)基對(duì)堆肥2個(gè)月中藥渣進(jìn)行解磷細(xì)菌篩選，挑取其中5株生長(zhǎng)速度快，在培養(yǎng)基上具有較大溶磷圈的細(xì)菌進(jìn)行劃線純化后分別命名為 YP1、YP2、YP3、YP4和 YP5。通過溶磷圈法測(cè)定各菌株的解磷作用。測(cè)量各菌株透明圈直徑的大小，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，各菌株D/d值在2.26-4.27之間，D/d 值最大的菌株是YP5，其余依次為 YP2＞YP1＞YP4＞YP3。利用磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定各菌株發(fā)酵上清液中的有效含磷量，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，5株解磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的解磷量為23.6 mg/L-48.43 mg/L之間，其中解磷量最大的菌株是YP5（48.43 mg/L），有效含磷量與對(duì)照（5.63 mg/L）相比增加8.6倍，解磷能力由強(qiáng)及弱依次為YP5＞YP2＞YP1＞YP4＞YP3，此結(jié)果與溶磷圈法測(cè)定結(jié)果一致。YP5透明圈直徑和解磷量均高于其它菌株，具有優(yōu)良的解有機(jī)磷作用，將對(duì)YP5進(jìn)行鑒定和促生拮抗作用研究。

圖1 解磷細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的解磷能力Fig.1 Phosphate-solubilizing capacities of different stra-ins cultivated in liquid medium

表1 解磷細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的解磷能力Table 1 Phosphate solubilization capacity of different strains cultivated on solid nutrient medium

2.2 解磷細(xì)菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 YP5在NA培養(yǎng)基36℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)觀察，結(jié)果如圖2所示，菌落淡綠色，扁平，濕潤(rùn)，邊緣不規(guī)則；革蘭氏染色反應(yīng)顯微鏡觀察，YP5為革蘭氏陰性桿菌，菌體單個(gè)或成雙排列。

圖2 YP5的細(xì)胞形態(tài)（1）（×1 000倍）、菌落形態(tài)（2）和發(fā)酵液（3）Fig.2 Cell morphology（1）（×1 000 times），colony morphology（2），and fermentation broth of YP5（3）

2.2.2 生理生化試驗(yàn)結(jié)果 YP5經(jīng)API菌種鑒定系統(tǒng)，從API數(shù)據(jù)庫中獲得和該菌種序列相近種、屬鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），鑒定率為98.9%，其生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。將YP5進(jìn)行16S rDNA鑒定。

表2 菌株YP5的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of YP5

2.2.3 16S rDNA鑒定 以YP5的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的1.5 kb左右長(zhǎng)度的DNA片段（圖3）。BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，YP5與銅綠假單胞菌的同源性達(dá)100%。為明確菌株之間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位，利用MEGA11 ALPHA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖4），同時(shí)結(jié)合YP5的形態(tài)特征及生理生化試驗(yàn)結(jié)果，鑒定YP5為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

圖3 YP5 16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis result of YP5 16S rDNA PCR product

圖4 基于16S rDNA序列的YP5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequences of YP5

2.3 解磷細(xì)菌促生拮抗因子測(cè)定

結(jié)果如圖5所示，YP5在CAS培養(yǎng)基平板上36℃培養(yǎng)7 d，菌落周圍產(chǎn)生橙色暈圈（圖5-A），說明該菌株能產(chǎn)鐵載體；在酪蛋白培養(yǎng)基上36℃培養(yǎng)2 d，菌落周圍產(chǎn)生39 mm-44 mm的透明圈，說明該菌株可分泌大量胞外蛋白酶（圖5-B）；在硅酸鹽和阿須貝培養(yǎng)基沒生長(zhǎng)，說明YP5沒有解鉀和固氮作用；經(jīng)檢測(cè)YP5也不產(chǎn)IAA。

圖5 菌株YP5產(chǎn)鐵載體（A）和分泌蛋白酶（B）試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of producing iron carrier（A）and secreted protease（B）by strain YP5

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選用15種抗生素對(duì)YP5進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，YP5對(duì)諾氟沙星、氯霉素、慶大霉素、恩諾沙星和丁胺卡那霉素高度敏感，對(duì)萘啶酸、鏈霉素中度敏感，對(duì)氨芐西林、利福平和四環(huán)素等8種抗生素耐藥。

表3 YP5的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Test results on the antimicrobial susceptibility of YP5

2.5 解磷細(xì)菌對(duì)植物真菌病害的拮抗作用

2.5.1 發(fā)酵液抑菌譜 采用平板對(duì)峙法測(cè)定YP5發(fā)酵液對(duì)植物病原真菌的拮抗作用，結(jié)果如圖6所示，YP5發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌、辣椒炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、花生褐斑病菌、玉米小斑病菌、番茄早疫病菌、甘蔗赤腐病菌、小麥赤霉病菌和冬瓜根腐病菌9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用。如表4所示，YP5發(fā)酵液對(duì)不同病原菌抑制率在84.29%-51.07%之間，對(duì)冬瓜根腐病菌、花生褐斑病菌的抑制率達(dá)80%以上，對(duì)香蕉枯萎病抑制作用最弱，抑菌率為51.07%。深入研究YP5無菌濾液對(duì)植物病原菌的抑制作用。

圖6 YP5發(fā)酵液的拮抗作用Fig.6 Antagonistic activity of YP5 fermentation

2.5.2 無菌濾液的抑菌作用 用含體積濃度5% YP5無菌濾液的培養(yǎng)基測(cè)定對(duì)冬瓜根腐病菌9種植物病原菌的抑制作用。5% YP5無菌濾液對(duì)9種植物病原菌均有不同程度的抑制作用，結(jié)果如表4所示，抑制率在81.19%-52.18%之間，對(duì)冬瓜根腐病菌的抑制率最高，達(dá)81.19%。YP5發(fā)酵液和無菌濾液對(duì)植物病原菌均有拮抗作用。試驗(yàn)進(jìn)一步研究YP5的拮抗次生代謝物。

表4 YP5發(fā)酵液和無菌濾液的拮抗作用試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Antagonistic activity results of YP5 fermentation and cell-free filtrate

2.6 解磷細(xì)菌產(chǎn)申嗪霉素的定量分析鑒定

申嗪霉素又名吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA），是假單胞菌屬重要的拮抗次生代謝物。YP5不同溫度（28和36℃）下在KB培養(yǎng)基和黃豆浸粉培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量，結(jié)果如圖7所示。28℃條件下，YP5兩種培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量差異顯著，在KB培養(yǎng)基PCA的產(chǎn)量最高，為17.73 mg/L，在黃豆浸粉培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量最低，為2.96 mg/L。36℃條件下，YP5兩種培養(yǎng)中PCA的產(chǎn)量差異不顯著，在KB培養(yǎng)基和黃豆浸粉培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量分別為11.35 mg/L、10.86 mg/L。由此可知，菌株YP5在28℃，KB培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量最高（17.73 mg/L）。在兩種培養(yǎng)基中，溫度不同PCA的產(chǎn)量差異顯著且變化趨勢(shì)不一致，在KB培養(yǎng)基中，PCA的產(chǎn)量隨溫度升高而降低；在黃豆浸粉培養(yǎng)基中，PCA的產(chǎn)量隨溫度升高而升高。

圖7 YP5在不同培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量Fig.7 PCA content of YP5 （phenazine-1-carborglic acid）in the different medium

3 討論

隨著我國(guó)中藥行業(yè)的迅速發(fā)展，大量中藥藥渣也隨之產(chǎn)生，中藥藥渣成分中含有多種有益成分，是可循環(huán)使用的生物物料。高溫好氧堆肥是目前最常用的一種中藥渣處理方法。堆肥亦是一種潛在的解磷細(xì)菌來源。Hameeda等［28］、Nuraini等［29］和Atekan等［30］從農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥（稻草、玉米、花生、蓖麻葉、甘蔗和大型動(dòng)物糞便）中分離出解磷細(xì)菌。中藥渣堆肥有豐富的微生物，本研究以堆肥2個(gè)月的中藥渣為試材，從中篩選到5株解有機(jī)磷細(xì)菌，各菌株發(fā)酵上清液中的解磷量在23.6 mg/L-48.43 mg/L之間，其中解磷量最大的菌株是YP5（48.43 mg/L），能有效提升發(fā)酵液中的有機(jī)磷含量8.6倍。伍善東等［31］從油菜（Brassica napus）根際土壤篩選得到的4株解有機(jī)磷細(xì)菌，解磷量在8.59 mg/L-28.34 mg/L；白變霞等［32］從南方紅豆杉（Taxus chinensis var.mairei）根際土壤分離得到的解有機(jī)磷菌株 CLY07的解磷量為26.62 mg/L。王明歡等［19］從中藥渣堆肥中篩選到2株解磷菌的解磷能力分別為2.68、4.60 mg/L。與目前已報(bào)道的解有機(jī)磷細(xì)菌相比，YP5具有良好的解磷作用。

銅綠假單胞菌是土壤促生菌中的常見種類，具有解磷、固氮等促生作用。Roopali等［33］從垃圾土中分離鑒定一株對(duì)印度芥藍(lán)有固氮和溶磷作用的銅綠假單胞菌。Linu等［34］從辣椒根際分離的解磷細(xì)菌銅綠假單胞菌KR270346和KR270347對(duì)辣椒土壤微生物數(shù)量和PSB種群、磷酸酶和脫氫酶活性、土壤有效磷、植物養(yǎng)分吸收和產(chǎn)量參數(shù)等各方面都有顯著影響。譙天敏等［35-36］通過抗生素標(biāo)記法得到一株銅綠假單胞菌ZB27，對(duì)雜交竹梢枯病的防治效果可達(dá)到70.07%，并通過粗活性物質(zhì)檢測(cè)試驗(yàn)表明菌粗提物中具有生物活性的成分大多是極性較小的物質(zhì)，其分子質(zhì)量小于1 000 kD。但既有促生作用，又有拮抗作用的銅綠假單胞菌鮮見報(bào)道。本研究從中藥渣堆肥中篩選的解磷有機(jī)磷細(xì)菌銅綠假單胞菌YP5不但具有解磷作用，且其發(fā)酵液和無菌濾液對(duì)冬瓜根腐病等多種植物病原菌有良好的拮抗作用，抑菌率最高達(dá)80%以上。此外，HPLC試驗(yàn)測(cè)定菌株YP5在KB培養(yǎng)基和黃豆粉培養(yǎng)基中均能產(chǎn)拮抗次生代謝物PCA，產(chǎn)量在2.96 mg/L-17.73 mg/L，YP5在28℃，KB培養(yǎng)基中PCA的產(chǎn)量最高（17.73 mg/L）。研究表明，培養(yǎng)基種類和溫度對(duì)PCA的產(chǎn)量均有影響。周蓮等［25］從水稻根際篩選能高效抑制水稻病原菌的銅綠假單胞菌PA1201在PPM和黃豆浸粉培養(yǎng)基中申嗪霉素的產(chǎn)量分別為81.7 mg/L和926.9 mg/L。這與本研究中培養(yǎng)基種類對(duì)PCA的產(chǎn)量有影響的結(jié)果一致。銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物有很多種，如生長(zhǎng)素、鐵載體、抗生素、酶和糖類等［37］。YP5能分泌胞外蛋白酶，產(chǎn)鐵載體、申嗪霉素，但其拮抗作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從中藥渣堆肥中篩選出5株解有機(jī)磷細(xì)菌，通過溶磷圈法和磷鉬藍(lán)比色法測(cè)定其解磷作用，解磷能力最優(yōu)的菌株是YP5（48.43 mg/L），有效含磷量與對(duì)照（5.63 mg/L）相比增加8.6倍。鑒定YP5為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），能分泌胞外蛋白酶，產(chǎn)鐵載體、申嗪霉素，對(duì)多種植物病原菌有廣譜拮抗作用。