張鴻雁 林國(guó)莉 李如蓮 紀(jì)曉琦

（嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湛江 524048）

番茄是一年生茄科類(lèi)草本植物，是全世界種植最為普遍的果蔬之一，目前有144個(gè)國(guó)家種植，全球番茄面積大約300多萬(wàn)hm2，產(chǎn)量約1.3億 t。我國(guó)番茄已經(jīng)成為主栽作物，也是第一大出口國(guó)，同時(shí)也是全球第二大番茄品加工生產(chǎn)國(guó)，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和食物供給中占有重要地位。番茄含有豐富的番茄紅素、維生素C、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗癌、防貧血、治高血壓等重要功效。但由于番茄具有果皮薄、組織柔嫩多汁并富含糖分等特點(diǎn)，采后儲(chǔ)存過(guò)程中容易感染微生物而發(fā)病腐爛［1］。番茄采后病害主要是果腐病。病原菌入侵是造成番茄果腐病的主要原因［2］。有研究顯示灰葡萄孢（Botrytis cinerea）［3-4］、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）［5］、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［6］等都會(huì)引起番茄果腐病，但沒(méi)有葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）導(dǎo)致果腐病的報(bào)道。

番茄采后儲(chǔ)藏和運(yùn)輸均會(huì)采取一定的保鮮措施，如物理、化學(xué)及生物方法等來(lái)抑制病害以降低采后損失。但物理保鮮法如低溫儲(chǔ)藏、氣調(diào)儲(chǔ)藏等措施成本高，需要設(shè)備和操作復(fù)雜。長(zhǎng)期以來(lái)，化學(xué)方法防控是番茄采后病害保鮮的主要方法。但大量地使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗藥性，化學(xué)物質(zhì)引起食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題，故尋求一種具有綠色、無(wú)毒、生態(tài)環(huán)保的果蔬病害防治方法已成為研究工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外利用拮抗菌進(jìn)行番茄采后果腐病病害防控有一些報(bào)道，獲得了對(duì)果腐病有較好拮抗作用及保鮮效果的菌株，其中主要以細(xì)菌［7］、酵母菌［8］、木霉［6］等為主。放線菌種類(lèi)繁多，代謝產(chǎn)物豐富多樣，是一類(lèi)廣泛用于防病的生防微生物。放線菌能有效抑制番茄灰葡萄孢（B. cinerea）［4］果腐病、魚(yú)甘子青霉菌（P. choerospondiatis）軟腐?。?］、芒果可可球二孢（Botryodiplodia theobromae）蒂腐?。?0］等引起采后病害的病原菌的生長(zhǎng)繁殖；另外，也有針對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌葡萄座腔菌（B.dothidea）［11］具有拮抗作用的放線菌的研究報(bào)道。

本文鑒定了導(dǎo)致番茄果腐病的病原菌，從健康番茄根際分離得到拮抗放線菌菌株，不僅能夠解決當(dāng)前面臨的番茄采后果腐病問(wèn)題，還可為其他果蔬采后防腐保鮮技術(shù)提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄及土壤：番茄購(gòu)自廣東省湛江市麻章區(qū)金綠寶生態(tài)農(nóng)場(chǎng)。選擇顏色和大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷的九成熟番茄果實(shí)進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。儲(chǔ)存期間挑選典型果腐病發(fā)病的番茄進(jìn)行試驗(yàn)。篩選拮抗菌土壤取自金綠寶生態(tài)農(nóng)場(chǎng)健康番茄根際。

培養(yǎng)基：病原菌分離、純化、活化和保存用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），放線菌活化、拮抗性瓊脂塊制備培養(yǎng)用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基（GA），放線菌發(fā)酵液制備用GA液體培養(yǎng)基。

供試試劑：2.5 mmol/L dNTP和Taq DNA聚合酶（寶生物工程（大連）有限公司）；ITS1和ITS引物（上海派森諾生物科技股份有限公司）；Axyprep DNA凝膠回收試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司）；QL-861旋渦震蕩器（江蘇省海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠）；SW-CJ-2D潔凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海力申科學(xué)儀器有限公司）；GY-1硬度計(jì)（浙江托普儀器有限公司）；PX-B32T糖度計(jì)（廣州市普析通儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定

1.2.1.1 病原菌分離純化 采用組織分離法和劃線培養(yǎng)法分離病原菌［12］。切取發(fā)病番茄病健交界處組織塊3 mm×3 mm的組織塊，75%酒精浸泡30 s，1%次氯酸鈉溶液消毒1-2 min，無(wú)菌水清洗3-5次，無(wú)菌濾紙吸干多余水分，置于PDA培養(yǎng)基，28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)5-7 d。待分離物上長(zhǎng)出白色菌絲，劃線純化后斜面4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)分析與致病性測(cè)定 挑取純化的菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央，28℃恒溫培養(yǎng)5-7 d，觀察記錄菌落特征。將病原菌在于PDA培養(yǎng)基上劃線，無(wú)菌的蓋玻片成45°插入PDA培養(yǎng)基內(nèi)，與劃線十字垂直，28℃培養(yǎng)5-7 d，用鑷子將蓋玻片取出，擦去蓋玻片一面，在顯微鏡下對(duì)病原菌菌絲和分生孢子進(jìn)行形態(tài)觀察，記錄病原菌菌絲和孢子的形態(tài)特征。初步確定致使番茄發(fā)病病原菌的分類(lèi)地位［13］。

根據(jù)柯赫氏法則，對(duì)病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。選取健康無(wú)傷口番茄，75%乙醇表面消毒后刺出傷口，在傷口處接種病原菌孢子懸液（1.0×107孢子/mL），以無(wú)菌水為對(duì)照。28℃培養(yǎng)，每天觀察記錄發(fā)病情況。選取發(fā)病癥狀與自然狀態(tài)下相近的番茄進(jìn)行病原菌分離鑒定，判斷與所接種菌株形態(tài)等是否一致。

1.2.1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 依照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)病原菌進(jìn)行DNA提取。引物為派森諾生物的PAGE序列，ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），PCR擴(kuò)增體系為 1 μL 基因組 DNA（20 ng/μL），5.0 μL 10 Buffer（ 含 2.5 mmol/L Mg2+），1.0 μL taq 聚 合 酶（5 U/μL），1.0 μL dNTP（10 mmol/L），1.5 μL ITS1 引物（10 μmol/L），1.5 μL ITS4 引 物（10 μmol/L），39.0 μL ddH2O， 總 體積 50.0 μL。50 μL PCR 反應(yīng)體系于95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min。產(chǎn)物用Axyprep DNA試劑盒回收測(cè)序。得到的18S rDNA-ITS序列后，在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過(guò)Blast進(jìn)行同源序列比對(duì)，下載參比序列在MAGE7.0軟件中，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)親緣關(guān)系確定分類(lèi)地位。

1.2.2 拮抗菌分離、篩選與鑒定

1.2.2.1 放線菌的分離篩選 在番茄生產(chǎn)基地選擇有代表性的健康植株，在植株周?chē)杉?-20 cm表層土壤。放線菌分離采用稀釋平板法。取5 g土壤加入45 mL無(wú)菌水中，土壤懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)7-9 d，按照相似度選擇鏈霉菌菌落純化保藏于-80℃。

1.2.2.2 拮抗菌的篩選 （1）平皿初篩：瓊脂塊法［14］。將制備好的病原菌菌懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，正置直徑5 mm放線菌瓊脂塊，28℃培養(yǎng)5-7 d，測(cè)定抑菌圈直徑（D）及抑菌圈透明度（T）。將初篩得到的具有良好拮抗效果的放線菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。（2）抑菌率：生長(zhǎng)速率法［15］。將放線菌無(wú)菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶4體積比混勻倒平板。平板中央放置5 mm病原菌菌餅，每處理3次重復(fù)，25℃培養(yǎng)7 d，定時(shí)測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。（3）孢子萌發(fā)：病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)6-9 d，加入無(wú)菌水沖洗分生孢子，經(jīng)無(wú)菌紗布和濾紙過(guò)濾去除菌絲，用無(wú)菌水沖洗濾渣2-3次。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)數(shù)，制得濃孢子懸液。按無(wú)菌發(fā)酵液：無(wú)菌水為1∶4配制發(fā)酵液加入病原菌孢子，使孢子濃度約為108孢子/mL，每處理3 次重復(fù)。25℃培養(yǎng)，4-5 h后用懸滴法［12］測(cè)定孢子萌發(fā)率。

1.2.2.3 拮抗菌的鑒定 （1）形態(tài)鑒定：插片法［16］。將待測(cè)菌株接種在GA瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)8-15 d，鏡檢基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲的形態(tài)，觀察待測(cè)菌株的表觀特征。生理生化特征測(cè)定按照文獻(xiàn)［17］中所介紹的方法進(jìn)行。（2）放線菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析：利用放線菌核酸提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。以基因組DNA為模板，25 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增16S rDNA，正向引物18#（AAGGTTGCGCTCGTTG），反向引物19#（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，56℃復(fù)性1 min，72℃延伸2 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后數(shù)據(jù)庫(kù)的提交、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建方法同病原菌鑒定。

1.2.3 X13無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)番茄防腐保鮮作用

1.2.3.1 處理方法 將X13在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，接種到液體培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d。發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min后，用0.22 μm滅菌微孔濾膜過(guò)濾除菌，得無(wú)菌濾液。濾液經(jīng)無(wú)菌生理鹽水稀釋至體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%和20%的無(wú)菌發(fā)酵稀釋液備用。

將洗凈篩選的番茄隨機(jī)分成4 組，對(duì)照用生理鹽水浸泡，其他3 組分別用體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%無(wú)菌發(fā)酵稀釋液浸泡處理5 min。果實(shí)浸泡后室溫晾干，裝入敞口PE袋中，儲(chǔ)藏于（20±1） ℃。每處理20個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.2.3.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 各處理每隔4 d觀察番茄腐爛情況。根據(jù)番茄的腐敗程度，將番茄果實(shí)腐爛率按照腐爛面積占果面比例大小劃分為4 級(jí)：0 級(jí)，果實(shí)無(wú)腐爛；1 級(jí)，腐爛面積≤10%；2 級(jí)，腐爛面積10%-30%；3級(jí)，腐爛面積30%-50%；4 級(jí)，腐爛面積＞50%。

腐爛指數(shù)/%=Σ（腐爛級(jí)別×該級(jí)果實(shí)數(shù)）/（總果實(shí)數(shù)×最高級(jí)別）×100

番茄經(jīng)20%無(wú)菌發(fā)酵液處理后，對(duì)果實(shí)中多酚氧化酶（PPO）、過(guò)氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）進(jìn)行測(cè)定。PPO活性測(cè)定采用分光光度法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酸法；PAL活性采用紫外分光光度法。番茄硬度采用果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定；可溶性固形物用手持折光儀測(cè)定；可滴定酸采用NaOH溶液滴定法測(cè)定（以檸檬酸計(jì)）；VC含量采用分光光度法測(cè)定。以上指標(biāo)均參考曹建康等方法［18］進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，顯著性采用SPSS22.0軟件中的方差分析和 Duncan比較（P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 病原菌鑒定

從果腐病發(fā)病番茄分離一株病原菌，得到純培養(yǎng)物標(biāo)記為Qyg16-2。

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)分析 將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)到5-7 d。病原菌菌落呈圓形，較規(guī)則，早期為白色，菌絲稀疏，后期為灰色，氣生菌絲發(fā)達(dá)、表面呈絨狀。培養(yǎng)皿背面早期為淺黃色，后期為黑色。菌落顏色由菌落中心向外漸變（圖1-A）。顯微鏡下病原菌Qyg16-2菌絲無(wú)色，有隔膜和分枝。分生孢子器黑色，球形，大小約130 μm×260 μm（圖1-B）。單細(xì)胞分生孢子無(wú)色，近紡錘形，大小約（5.0-7.6）μm×（20-30）μm（圖1-C）。通過(guò)菌落特征以及顯微特征觀察，初步判斷病原菌Qyg16-2為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）。

2.1.2 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析 以病原菌Qyg16-2菌株的基因序列使用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為540 bp的擴(kuò)增片段，產(chǎn)物純化后測(cè)序，將所鑒定菌株rDNA-ITS基因序列提交到 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（序列號(hào) MT071502），經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與菌株QYG-2序列相似性較高的菌株均為葡萄座腔菌屬，且該菌株與與葡萄座腔菌B. dothidea（登錄號(hào)NR111146.1）相似性達(dá)100%，聚在一個(gè)分支（圖2）。結(jié)合菌株的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征，明確病原物Qyg16-2為葡萄座腔菌B. dothidea。

圖2 病原菌Qyg16-2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of pathogen Qyg16-2

2.1.3 致病性 將分離到的病原菌Qyg16-2回接于健康番茄上進(jìn)行致病性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在5 d時(shí)表層覆蓋一層稀疏呈圓形擴(kuò)散的白色菌絲，后期果肉開(kāi)始出現(xiàn)軟爛，被侵染部位組織軟化明顯，直到整個(gè)果實(shí)腐爛（圖1-D）。發(fā)病癥狀與自然條件下發(fā)病癥狀病癥一致。從番茄回接后的發(fā)病部位病健交界處取得組織塊，分離得到的病原菌與接種病病原菌一致。證明所分離接種的菌株是引起番茄果腐病的病原菌。

2.2 拮抗菌的篩選和鑒定

2.2.1 拮抗菌分離和篩選 從健康番茄根際土壤中篩選到不同形態(tài)的放線菌93株。從93株菌株中獲得10株對(duì)番茄果腐病病原菌葡萄座腔菌有拮抗作用的放線菌。從表1可以看出，10株生防菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌均有抑制作用，即均能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制病原菌生長(zhǎng)。其中抑菌圈直徑超過(guò)15.00 mm，抑菌效果比較明顯的菌株有6株，分別為X1、X13、X19、X43、X85和X90。抑菌圈直徑最大的菌株X13，直徑（26.53±1.03）mm（圖3-A），其次為X1，直徑（20.31±2.12）mm，與其他菌株相比差異顯著，直徑最小的為X85，直徑（18.92±1.11a）mm。選擇6株放線菌進(jìn)行抑菌率和孢子萌發(fā)抑制率試驗(yàn)。

抑菌率和孢子萌發(fā)抑制率試驗(yàn)結(jié)果（表1）可以看出，6株拮抗放線菌抑菌效果相差較大，X1和X13抑菌效果較好，抑菌率分別為（68.15±1.25）%和（82.53±0.93）%，X13抑菌能力最強(qiáng)，差異顯著。同時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)抑制率結(jié)果與抑菌率結(jié)果相似，X1和X13分別為73.89%和98.37%，差異顯著。選取X13進(jìn)行菌種鑒定。

表1 放線菌對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of actinomycetes on the test pathogen

2.2.2 X13鑒定

2.2.2.1 X13的形態(tài)特征 通過(guò)劃線法將菌株X13接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5 d后，可以觀察到菌株X13生長(zhǎng)良好，在培養(yǎng)基上可見(jiàn)到白色但不透明的菌落，菌落表面干燥且起皺，菌落的背面呈黃色，菌落規(guī)模較小且與培養(yǎng)基結(jié)合緊密（圖3-B）。顯微鏡觀察其孢子絲通常直、柔曲，螺旋形少（圖3-C）。

圖3 拮抗菌X13對(duì)病原菌的拮抗作用及其形態(tài)特征Fig.3 Inhibition effect of antagonistic Streptomyce strain X13 to pathogen and their morphological characters

2.2.2.2 X13的生理生化特征 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［17］對(duì)菌株X13進(jìn)行明膠液化、牛奶胨化、硝酸鹽還原、黑色素產(chǎn)生、酪氨酸酶產(chǎn)生及H2S產(chǎn)生等特性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)菌株X13與桑氏鏈霉菌（Streptomyces sampsonii）生理生化指標(biāo)相同。另外，X13可利用的碳源包括D-蔗糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖，但不能利用L-鼠李糖、肌醇（表2）。

表2 菌株X13的生理生化特征及碳源利用Table 2 Physicochemical characteristics and carbon source utilization of X13

2.2.3 X13的分子鑒定 對(duì)菌株X13的16SrDNA基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，得到約1 300 bp的基因序列。將該提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（序列號(hào)MZ363933）中，經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與X13菌株的16S rDNA基因序列具有高度同源性的均為鏈霉菌屬，從這些序列中選取相似度較高的序列，利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。結(jié)果表明，菌株X13與桑氏鏈霉菌聚于同一分支，且序列相似性為99.11%，結(jié)合其生物學(xué)特性，可將菌株X13鑒定為桑氏鏈霉菌（S. sampsonii）。

圖4 菌株X13的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain X13

2.3 X13無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)番茄防腐保鮮作用

2.3.1 X13處理對(duì)番茄腐爛指數(shù)影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13發(fā)酵液處理后，儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)腐爛指數(shù)變化結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可以看出，隨著番茄儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其腐爛指數(shù)也逐漸上升。對(duì)照的腐爛指數(shù)上升最快，在儲(chǔ)藏到8 d時(shí)，對(duì)照和不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理的番茄皆出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象，對(duì)照的腐爛指數(shù)最高，為（9.81±1.06）%，發(fā)酵液處理腐爛指數(shù)最大為（4.98±1.35）%（體積分?jǐn)?shù)5%），最小為（2.05±0.68）%（體積分?jǐn)?shù)20%），差異顯著。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，到12 d、16 d和20 d，也表現(xiàn)出發(fā)酵液處理比對(duì)照腐爛指數(shù)低，差異顯著，且處理的腐敗速度明顯慢于對(duì)照，16-20 d，腐爛指數(shù)稍有增加，差異不顯著。同時(shí)，由表3可知，菌株X13不同體積分?jǐn)?shù)無(wú)菌發(fā)酵液處理番茄，果實(shí)腐爛指數(shù)均明顯低于對(duì)照，且體積分?jǐn)?shù)越高，抑制效果越好。其中20%體積分?jǐn)?shù)的無(wú)菌發(fā)酵液處理番茄在儲(chǔ)存20 d腐爛指數(shù)（25.02±0.65%），對(duì)照是其約3倍，為（68.32±1.20）%。

表3 X13無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄腐爛指數(shù)的影響Table 3 Effects of cell-free fermentation filtrate of X13 on the decay index of tomato%

2.3.2 X13處理對(duì)對(duì)番茄誘導(dǎo)抗性的影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13處理后，儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)的誘導(dǎo)抗性變化情況結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，3項(xiàng)抗性酶活性PPO、POD和PAL皆出現(xiàn)從4-12 d上升，到12 d達(dá)到峰值，16 d后下降的趨勢(shì)，但16 d后雖有下降，但3項(xiàng)酶活亦皆大于對(duì)照，下降速度明顯變緩。對(duì)于PPO活性，與對(duì)照相比，12 d、16 d和20 d的PPO活性分別比對(duì)照增加109.0%、109.4%和98.0%，約為對(duì)照的2倍，差異顯著。對(duì)于POD，與對(duì)照相比，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，增加量也逐漸上升，12 d活性增加了127.6%，雖16 d后POD開(kāi)始下降，但處理后POD活性下降速度較慢。PAL增加量從93.3%（4 d）到216.7%（20 d），從8-20 d，PAL活性皆高于對(duì)照，差異顯著。

表4 X13無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄抗性酶活性影響Table 4 Effects of cell-free fermentation filtrate of X13 on the defense enzyme activity of tomato

2.3.3 X13處理對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13處理后，儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)品質(zhì)變化情況，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，對(duì)照和處理番茄硬度、可溶性固形物、可滴定算含量和VC含量皆出現(xiàn)下降趨勢(shì)。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，番茄果實(shí)硬度逐漸下降。但與對(duì)照相比，X13無(wú)菌發(fā)酵液處理硬度下降減慢，至儲(chǔ)藏20 d，果實(shí)硬度為15.08 kg/cm2，較對(duì)照減少15.0%。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)，可溶性固形物含量呈下降趨勢(shì)，對(duì)照下降速度較快，至16 d和20 d，經(jīng)處理的番茄可溶性固形物含量比對(duì)照減少4.0%和3.2%?？傻味ㄋ岷口厔?shì)同可溶性固形物，對(duì)照從8 d開(kāi)始，可滴定酸迅速下降，至16 d和20 d，處理比對(duì)照高25.0%和20.0%。果實(shí)Vc含量為16 d到20 d，比對(duì)照少損失19.3%和20.1%。

0.00.46.1 Δ/%.51119.3 20.1 3.14a a mg·100 g-1）4.01a 3.02a 3.25a 3.01 3.41a X137±45.27±42.5 40.2 47.22±8±.21±38.45±Vc/（36 3.54a 2.36a 2.14a 2.65b 3.01b b 3.20 ato 6±47.22±45.11±40.12±36.12±2±of tom Ck 32.0 30.3 uality Δ/%0.07.4 Titration acid content /%17.1 18.9 25.0 20.0 3 1a±0.1 0.58±0影.12a.12a響X10.62 0.48±0 0.44±0.11a 0.35±0.12a 0.30±0.09a質(zhì)e p的reservation q量含品th 酸8a 5a 9a實(shí)on 定.0.05a.06a trol（P＜0±0.11a±0.0±0.0 0.37±0 0.28±0 0.25±0.05）果13滴可茄Ck 0.62 0.54 0.41番對(duì)液the con濾content/%Δ/%0.00.60.81.64.03.2發(fā)酵n filtrate of X 5a菌.5.01a.20a 13無(wú)3 5 X Soluble solid X1 f cell-free fermentatio 7.30±0 7.25±1 7.22±1 7.11±0.55a 7.07±0.68a 6.52±0.51a物形表固2a 0a 4a性.3.85a.97a （P＜0.05）溶 ±1.0±1.2平水ifferences between the treatment and ffects o 可Ck 7.30 7.21 7.16±1 7.00±0 6.80±0 6.32±0.59a著顯到達(dá)ble 5 E .4 Δ/%異0.0差105.6 2）12.4 12.8 15.0比相n indicate significant d Ta kg·cm-1.35a 2.04a 1.65a 1.56a 1.33a a 0.58照對(duì)與ness/（8±標(biāo)e colum X13 22.10±20.45±18.32±18.24±17.33±15.0指項(xiàng)Firm 該示度表硬2.31a 3.02b 4.02a 2.01a 1.02a 1.21b 母字寫(xiě)Ck .10±2218.52±17.35±16.23±15.36±13.11±小ercase letters in the sam同不列儲(chǔ)Storage tim e/d同間中ifferent low時(shí)表：D藏：048121620注Note

3 討論

本研究對(duì)來(lái)源于番茄果腐病病原菌進(jìn)行組織分離純化，經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證獲得的病原菌菌株Qyg16-2。觀察病原菌形態(tài)特征并進(jìn)行rDNA-ITS序列分析，確定引起采后番茄果腐病病原菌為葡萄座腔菌B. dothidea。本研究采用來(lái)自采后儲(chǔ)藏期間發(fā)病番茄樣品獲得病原菌，其致病菌與其他研究不同［3-6］。

葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）真菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛，由其引起得葉斑，枝梢枯敗，果實(shí)腐爛等果樹(shù)病害癥狀，導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量以及品質(zhì)下降，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。葡萄座腔菌屬對(duì)水果的危害在獼猴桃櫻桃［19］、藍(lán)莓［20］、蘋(píng)果［21］、葡萄［22］、柑橘［23］等都有研究報(bào)導(dǎo)，但針對(duì)其對(duì)番茄的侵染研究較少。葡萄座腔菌B. dothidea生長(zhǎng)速度快，寄生性強(qiáng)，以菌絲體、分生孢子及子囊殼在殘留的植物病殘?bào)w上越冬，菌絲體、分生孢子器在第二年春天恢復(fù)活動(dòng)，越冬后的4-6月間生成孢子，成為初侵染源［24］。

生防菌株的研究與應(yīng)用對(duì)防止果蔬的微生物病害具有重要意義。目前針對(duì)桑氏鏈霉菌的研究較多，已經(jīng)從土壤［25-26］、樹(shù)木［27-28］和海洋沉積物［29］中分離到桑氏鏈霉菌（S. sampsonii），該菌能夠抑制多種真菌生長(zhǎng)，有明顯的抗真菌活性，可抗阿切爾擬莖點(diǎn)霉（Phomopsis archeri）［25］及毛癬菌屬（Trichophyton sp.）［26］等。李姝江等［28］發(fā)現(xiàn)桑氏鏈霉菌KJ40對(duì)楊樹(shù)紫紋羽病原菌Rhizoctonia violacea除了具有較強(qiáng)拮抗作用外，還有促生抗病多種功能。

在外界因子作用下，植物能產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，如抗性酶的產(chǎn)生，來(lái)抵抗病原菌入侵，使植物免遭病害或減輕病害。郭虹娜等［29］發(fā)現(xiàn)杰克遜酵母揮發(fā)物明顯提高草莓中過(guò)氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）等酶活。孫平平等［30］發(fā)現(xiàn)梨灰霉病菌拮抗放線菌處理梨后果實(shí)的過(guò)氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性。本研究表明拮抗菌X13無(wú)菌發(fā)酵液處理能顯著提高番茄抗性酶活性，可以提高番茄抗病能力。

番茄由于皮薄多汁，受傷或受到微生物侵染后，容易腐爛變質(zhì)，腐敗指數(shù)是番茄新鮮程度的標(biāo)志。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，水果品質(zhì)逐步下降。水果儲(chǔ)藏過(guò)程中可采取措施緩解品質(zhì)下降速度。季小詩(shī)等［31］發(fā)現(xiàn)拮抗酵母GS-316發(fā)酵液處理冬棗能夠顯著延緩冬棗果實(shí)失重率和還原糖含量的上升，抑制可滴定酸含量和Vc含量的下降，降低果實(shí)軟化率，降低腐爛指數(shù)。施俊鳳等［32］發(fā)現(xiàn)草莓采前噴施洋蔥伯克霍爾德菌菌懸液可有效提升草莓品質(zhì)，延緩果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸，降低Vc含量。本研究中番茄通過(guò)拮抗菌X13處理后，腐爛指數(shù)下降較低，硬度、可溶性固形物、可滴定酸、Vc含量下降幅度減慢，說(shuō)明X13可以維持番茄果實(shí)在儲(chǔ)藏過(guò)程中的品質(zhì)時(shí)間有所延長(zhǎng)，減輕果實(shí)的腐敗變質(zhì)，表明該菌株在番茄采后保鮮方面有一定的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)X13菌株應(yīng)用于番茄采后果腐病控制及保鮮效果進(jìn)行了初步研究，仍需對(duì)其發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)抑菌機(jī)理，病原菌、拮抗菌及番茄果實(shí)互作及菌株X13的生產(chǎn)應(yīng)用需進(jìn)一步研究探索。

4 結(jié)論

從健康番茄根際土壤中分離得到了一株桑氏鏈霉菌 S. sampsonii X13，其對(duì)番茄果腐病病原菌葡萄座腔菌B. dothidea Qyg16-2有較強(qiáng)拮抗作用，X13可以抑制病原菌Qyg16-2孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)儲(chǔ)藏期間番茄腐爛的發(fā)生具有良好的抑制效果，且對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)具有較好的維持作用。