張鴻雁 林國(guó)莉 李如蓮 紀(jì)曉琦
(嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,湛江 524048)
番茄是一年生茄科類(lèi)草本植物,是全世界種植最為普遍的果蔬之一,目前有144個(gè)國(guó)家種植,全球番茄面積大約300多萬(wàn)hm2,產(chǎn)量約1.3億 t。我國(guó)番茄已經(jīng)成為主栽作物,也是第一大出口國(guó),同時(shí)也是全球第二大番茄品加工生產(chǎn)國(guó),在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和食物供給中占有重要地位。番茄含有豐富的番茄紅素、維生素C、鉀等營(yíng)養(yǎng)成分,具有抗癌、防貧血、治高血壓等重要功效。但由于番茄具有果皮薄、組織柔嫩多汁并富含糖分等特點(diǎn),采后儲(chǔ)存過(guò)程中容易感染微生物而發(fā)病腐爛[1]。番茄采后病害主要是果腐病。病原菌入侵是造成番茄果腐病的主要原因[2]。有研究顯示灰葡萄孢(Botrytis cinerea)[3-4]、擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)[5]、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)[6]等都會(huì)引起番茄果腐病,但沒(méi)有葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)導(dǎo)致果腐病的報(bào)道。
番茄采后儲(chǔ)藏和運(yùn)輸均會(huì)采取一定的保鮮措施,如物理、化學(xué)及生物方法等來(lái)抑制病害以降低采后損失。但物理保鮮法如低溫儲(chǔ)藏、氣調(diào)儲(chǔ)藏等措施成本高,需要設(shè)備和操作復(fù)雜。長(zhǎng)期以來(lái),化學(xué)方法防控是番茄采后病害保鮮的主要方法。但大量地使用化學(xué)藥劑導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗藥性,化學(xué)物質(zhì)引起食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題,故尋求一種具有綠色、無(wú)毒、生態(tài)環(huán)保的果蔬病害防治方法已成為研究工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。
近年來(lái),國(guó)內(nèi)外利用拮抗菌進(jìn)行番茄采后果腐病病害防控有一些報(bào)道,獲得了對(duì)果腐病有較好拮抗作用及保鮮效果的菌株,其中主要以細(xì)菌[7]、酵母菌[8]、木霉[6]等為主。放線菌種類(lèi)繁多,代謝產(chǎn)物豐富多樣,是一類(lèi)廣泛用于防病的生防微生物。放線菌能有效抑制番茄灰葡萄孢(B. cinerea)[4]果腐病、魚(yú)甘子青霉菌(P. choerospondiatis)軟腐?。?]、芒果可可球二孢(Botryodiplodia theobromae)蒂腐?。?0]等引起采后病害的病原菌的生長(zhǎng)繁殖;另外,也有針對(duì)蘋(píng)果輪紋病病原菌葡萄座腔菌(B.dothidea)[11]具有拮抗作用的放線菌的研究報(bào)道。
本文鑒定了導(dǎo)致番茄果腐病的病原菌,從健康番茄根際分離得到拮抗放線菌菌株,不僅能夠解決當(dāng)前面臨的番茄采后果腐病問(wèn)題,還可為其他果蔬采后防腐保鮮技術(shù)提供新思路和理論依據(jù)。
供試番茄及土壤:番茄購(gòu)自廣東省湛江市麻章區(qū)金綠寶生態(tài)農(nóng)場(chǎng)。選擇顏色和大小均勻、無(wú)機(jī)械損傷的九成熟番茄果實(shí)進(jìn)行常規(guī)實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存。儲(chǔ)存期間挑選典型果腐病發(fā)病的番茄進(jìn)行試驗(yàn)。篩選拮抗菌土壤取自金綠寶生態(tài)農(nóng)場(chǎng)健康番茄根際。
培養(yǎng)基:病原菌分離、純化、活化和保存用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),放線菌活化、拮抗性瓊脂塊制備培養(yǎng)用高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基(GA),放線菌發(fā)酵液制備用GA液體培養(yǎng)基。
供試試劑:2.5 mmol/L dNTP和Taq DNA聚合酶(寶生物工程(大連)有限公司);ITS1和ITS引物(上海派森諾生物科技股份有限公司);Axyprep DNA凝膠回收試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)杭州有限公司);QL-861旋渦震蕩器(江蘇省海門(mén)市麒麟醫(yī)用儀器廠);SW-CJ-2D潔凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);Neofuge 13R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司);GY-1硬度計(jì)(浙江托普儀器有限公司);PX-B32T糖度計(jì)(廣州市普析通儀器有限公司)。
1.2.1 病原菌的分離與鑒定
1.2.1.1 病原菌分離純化 采用組織分離法和劃線培養(yǎng)法分離病原菌[12]。切取發(fā)病番茄病健交界處組織塊3 mm×3 mm的組織塊,75%酒精浸泡30 s,1%次氯酸鈉溶液消毒1-2 min,無(wú)菌水清洗3-5次,無(wú)菌濾紙吸干多余水分,置于PDA培養(yǎng)基,28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)5-7 d。待分離物上長(zhǎng)出白色菌絲,劃線純化后斜面4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)分析與致病性測(cè)定 挑取純化的菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基中央,28℃恒溫培養(yǎng)5-7 d,觀察記錄菌落特征。將病原菌在于PDA培養(yǎng)基上劃線,無(wú)菌的蓋玻片成45°插入PDA培養(yǎng)基內(nèi),與劃線十字垂直,28℃培養(yǎng)5-7 d,用鑷子將蓋玻片取出,擦去蓋玻片一面,在顯微鏡下對(duì)病原菌菌絲和分生孢子進(jìn)行形態(tài)觀察,記錄病原菌菌絲和孢子的形態(tài)特征。初步確定致使番茄發(fā)病病原菌的分類(lèi)地位[13]。
根據(jù)柯赫氏法則,對(duì)病原菌進(jìn)行致病性測(cè)定。選取健康無(wú)傷口番茄,75%乙醇表面消毒后刺出傷口,在傷口處接種病原菌孢子懸液(1.0×107孢子/mL),以無(wú)菌水為對(duì)照。28℃培養(yǎng),每天觀察記錄發(fā)病情況。選取發(fā)病癥狀與自然狀態(tài)下相近的番茄進(jìn)行病原菌分離鑒定,判斷與所接種菌株形態(tài)等是否一致。
1.2.1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 依照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)病原菌進(jìn)行DNA提取。引物為派森諾生物的PAGE序列,ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和 ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC),PCR擴(kuò)增體系為 1 μL 基因組 DNA(20 ng/μL),5.0 μL 10 Buffer( 含 2.5 mmol/L Mg2+),1.0 μL taq 聚 合 酶(5 U/μL),1.0 μL dNTP(10 mmol/L),1.5 μL ITS1 引物(10 μmol/L),1.5 μL ITS4 引 物(10 μmol/L),39.0 μL ddH2O, 總 體積 50.0 μL。50 μL PCR 反應(yīng)體系于95℃預(yù)變性5 min,95℃變性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán),72℃終延伸7 min。產(chǎn)物用Axyprep DNA試劑盒回收測(cè)序。得到的18S rDNA-ITS序列后,在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過(guò)Blast進(jìn)行同源序列比對(duì),下載參比序列在MAGE7.0軟件中,鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),通過(guò)親緣關(guān)系確定分類(lèi)地位。
1.2.2 拮抗菌分離、篩選與鑒定
1.2.2.1 放線菌的分離篩選 在番茄生產(chǎn)基地選擇有代表性的健康植株,在植株周?chē)杉?-20 cm表層土壤。放線菌分離采用稀釋平板法。取5 g土壤加入45 mL無(wú)菌水中,土壤懸液經(jīng)無(wú)菌水稀釋后涂布于高氏一號(hào)培養(yǎng)基上,35℃培養(yǎng)7-9 d,按照相似度選擇鏈霉菌菌落純化保藏于-80℃。
1.2.2.2 拮抗菌的篩選 (1)平皿初篩:瓊脂塊法[14]。將制備好的病原菌菌懸液均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上,正置直徑5 mm放線菌瓊脂塊,28℃培養(yǎng)5-7 d,測(cè)定抑菌圈直徑(D)及抑菌圈透明度(T)。將初篩得到的具有良好拮抗效果的放線菌菌株進(jìn)行復(fù)篩。(2)抑菌率:生長(zhǎng)速率法[15]。將放線菌無(wú)菌發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基按1∶4體積比混勻倒平板。平板中央放置5 mm病原菌菌餅,每處理3次重復(fù),25℃培養(yǎng)7 d,定時(shí)測(cè)量菌落直徑,計(jì)算抑菌率。(3)孢子萌發(fā):病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)6-9 d,加入無(wú)菌水沖洗分生孢子,經(jīng)無(wú)菌紗布和濾紙過(guò)濾去除菌絲,用無(wú)菌水沖洗濾渣2-3次。用血球計(jì)數(shù)板測(cè)數(shù),制得濃孢子懸液。按無(wú)菌發(fā)酵液:無(wú)菌水為1∶4配制發(fā)酵液加入病原菌孢子,使孢子濃度約為108孢子/mL,每處理3 次重復(fù)。25℃培養(yǎng),4-5 h后用懸滴法[12]測(cè)定孢子萌發(fā)率。
1.2.2.3 拮抗菌的鑒定 (1)形態(tài)鑒定:插片法[16]。將待測(cè)菌株接種在GA瓊脂培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng)8-15 d,鏡檢基內(nèi)菌絲、氣生菌絲、孢子絲的形態(tài),觀察待測(cè)菌株的表觀特征。生理生化特征測(cè)定按照文獻(xiàn)[17]中所介紹的方法進(jìn)行。(2)放線菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增和序列分析:利用放線菌核酸提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取。以基因組DNA為模板,25 μL反應(yīng)體系擴(kuò)增16S rDNA,正向引物18#(AAGGTTGCGCTCGTTG),反向引物19#(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,56℃復(fù)性1 min,72℃延伸2 min,25個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后數(shù)據(jù)庫(kù)的提交、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建方法同病原菌鑒定。
1.2.3 X13無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)番茄防腐保鮮作用
1.2.3.1 處理方法 將X13在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后,接種到液體培養(yǎng)基中,28℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)9 d。發(fā)酵液4 000 r/min離心5 min后,用0.22 μm滅菌微孔濾膜過(guò)濾除菌,得無(wú)菌濾液。濾液經(jīng)無(wú)菌生理鹽水稀釋至體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%和20%的無(wú)菌發(fā)酵稀釋液備用。
將洗凈篩選的番茄隨機(jī)分成4 組,對(duì)照用生理鹽水浸泡,其他3 組分別用體積分?jǐn)?shù)5%、10%、20%無(wú)菌發(fā)酵稀釋液浸泡處理5 min。果實(shí)浸泡后室溫晾干,裝入敞口PE袋中,儲(chǔ)藏于(20±1) ℃。每處理20個(gè)果實(shí),重復(fù)3次。
1.2.3.2 測(cè)定指標(biāo)及方法 各處理每隔4 d觀察番茄腐爛情況。根據(jù)番茄的腐敗程度,將番茄果實(shí)腐爛率按照腐爛面積占果面比例大小劃分為4 級(jí):0 級(jí),果實(shí)無(wú)腐爛;1 級(jí),腐爛面積≤10%;2 級(jí),腐爛面積10%-30%;3級(jí),腐爛面積30%-50%;4 級(jí),腐爛面積>50%。
腐爛指數(shù)/%=Σ(腐爛級(jí)別×該級(jí)果實(shí)數(shù))/(總果實(shí)數(shù)×最高級(jí)別)×100
番茄經(jīng)20%無(wú)菌發(fā)酵液處理后,對(duì)果實(shí)中多酚氧化酶(PPO)、過(guò)氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)進(jìn)行測(cè)定。PPO活性測(cè)定采用分光光度法;POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酸法;PAL活性采用紫外分光光度法。番茄硬度采用果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定;可溶性固形物用手持折光儀測(cè)定;可滴定酸采用NaOH溶液滴定法測(cè)定(以檸檬酸計(jì));VC含量采用分光光度法測(cè)定。以上指標(biāo)均參考曹建康等方法[18]進(jìn)行。
1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理,顯著性采用SPSS22.0軟件中的方差分析和 Duncan比較(P<0.05)。
從果腐病發(fā)病番茄分離一株病原菌,得到純培養(yǎng)物標(biāo)記為Qyg16-2。
2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)分析 將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上。28℃培養(yǎng)到5-7 d。病原菌菌落呈圓形,較規(guī)則,早期為白色,菌絲稀疏,后期為灰色,氣生菌絲發(fā)達(dá)、表面呈絨狀。培養(yǎng)皿背面早期為淺黃色,后期為黑色。菌落顏色由菌落中心向外漸變(圖1-A)。顯微鏡下病原菌Qyg16-2菌絲無(wú)色,有隔膜和分枝。分生孢子器黑色,球形,大小約130 μm×260 μm(圖1-B)。單細(xì)胞分生孢子無(wú)色,近紡錘形,大小約(5.0-7.6)μm×(20-30)μm(圖1-C)。通過(guò)菌落特征以及顯微特征觀察,初步判斷病原菌Qyg16-2為葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)。
2.1.2 病原菌系統(tǒng)發(fā)育分析 以病原菌Qyg16-2菌株的基因序列使用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)度為540 bp的擴(kuò)增片段,產(chǎn)物純化后測(cè)序,將所鑒定菌株rDNA-ITS基因序列提交到 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào) MT071502),經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與菌株QYG-2序列相似性較高的菌株均為葡萄座腔菌屬,且該菌株與與葡萄座腔菌B. dothidea(登錄號(hào)NR111146.1)相似性達(dá)100%,聚在一個(gè)分支(圖2)。結(jié)合菌株的培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)特征,明確病原物Qyg16-2為葡萄座腔菌B. dothidea。
圖2 病原菌Qyg16-2系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of pathogen Qyg16-2
2.1.3 致病性 將分離到的病原菌Qyg16-2回接于健康番茄上進(jìn)行致病性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)在5 d時(shí)表層覆蓋一層稀疏呈圓形擴(kuò)散的白色菌絲,后期果肉開(kāi)始出現(xiàn)軟爛,被侵染部位組織軟化明顯,直到整個(gè)果實(shí)腐爛(圖1-D)。發(fā)病癥狀與自然條件下發(fā)病癥狀病癥一致。從番茄回接后的發(fā)病部位病健交界處取得組織塊,分離得到的病原菌與接種病病原菌一致。證明所分離接種的菌株是引起番茄果腐病的病原菌。
2.2.1 拮抗菌分離和篩選 從健康番茄根際土壤中篩選到不同形態(tài)的放線菌93株。從93株菌株中獲得10株對(duì)番茄果腐病病原菌葡萄座腔菌有拮抗作用的放線菌。從表1可以看出,10株生防菌無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)病原菌均有抑制作用,即均能產(chǎn)生抗菌物質(zhì),抑制病原菌生長(zhǎng)。其中抑菌圈直徑超過(guò)15.00 mm,抑菌效果比較明顯的菌株有6株,分別為X1、X13、X19、X43、X85和X90。抑菌圈直徑最大的菌株X13,直徑(26.53±1.03)mm(圖3-A),其次為X1,直徑(20.31±2.12)mm,與其他菌株相比差異顯著,直徑最小的為X85,直徑(18.92±1.11a)mm。選擇6株放線菌進(jìn)行抑菌率和孢子萌發(fā)抑制率試驗(yàn)。
抑菌率和孢子萌發(fā)抑制率試驗(yàn)結(jié)果(表1)可以看出,6株拮抗放線菌抑菌效果相差較大,X1和X13抑菌效果較好,抑菌率分別為(68.15±1.25)%和(82.53±0.93)%,X13抑菌能力最強(qiáng),差異顯著。同時(shí),對(duì)孢子萌發(fā)抑制率結(jié)果與抑菌率結(jié)果相似,X1和X13分別為73.89%和98.37%,差異顯著。選取X13進(jìn)行菌種鑒定。
表1 放線菌對(duì)供試病原菌生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of actinomycetes on the test pathogen
2.2.2 X13鑒定
2.2.2.1 X13的形態(tài)特征 通過(guò)劃線法將菌株X13接種在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上,置于培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)5 d后,可以觀察到菌株X13生長(zhǎng)良好,在培養(yǎng)基上可見(jiàn)到白色但不透明的菌落,菌落表面干燥且起皺,菌落的背面呈黃色,菌落規(guī)模較小且與培養(yǎng)基結(jié)合緊密(圖3-B)。顯微鏡觀察其孢子絲通常直、柔曲,螺旋形少(圖3-C)。
圖3 拮抗菌X13對(duì)病原菌的拮抗作用及其形態(tài)特征Fig.3 Inhibition effect of antagonistic Streptomyce strain X13 to pathogen and their morphological characters
2.2.2.2 X13的生理生化特征 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[17]對(duì)菌株X13進(jìn)行明膠液化、牛奶胨化、硝酸鹽還原、黑色素產(chǎn)生、酪氨酸酶產(chǎn)生及H2S產(chǎn)生等特性檢測(cè),發(fā)現(xiàn)菌株X13與桑氏鏈霉菌(Streptomyces sampsonii)生理生化指標(biāo)相同。另外,X13可利用的碳源包括D-蔗糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖,但不能利用L-鼠李糖、肌醇(表2)。
表2 菌株X13的生理生化特征及碳源利用Table 2 Physicochemical characteristics and carbon source utilization of X13
2.2.3 X13的分子鑒定 對(duì)菌株X13的16SrDNA基因序列擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后,得到約1 300 bp的基因序列。將該提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(序列號(hào)MZ363933)中,經(jīng)BLAST比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)與X13菌株的16S rDNA基因序列具有高度同源性的均為鏈霉菌屬,從這些序列中選取相似度較高的序列,利用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。結(jié)果表明,菌株X13與桑氏鏈霉菌聚于同一分支,且序列相似性為99.11%,結(jié)合其生物學(xué)特性,可將菌株X13鑒定為桑氏鏈霉菌(S. sampsonii)。
圖4 菌株X13的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain X13
2.3.1 X13處理對(duì)番茄腐爛指數(shù)影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13發(fā)酵液處理后,儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)腐爛指數(shù)變化結(jié)果見(jiàn)表3。
由表3可以看出,隨著番茄儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),其腐爛指數(shù)也逐漸上升。對(duì)照的腐爛指數(shù)上升最快,在儲(chǔ)藏到8 d時(shí),對(duì)照和不同體積分?jǐn)?shù)發(fā)酵液處理的番茄皆出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象,對(duì)照的腐爛指數(shù)最高,為(9.81±1.06)%,發(fā)酵液處理腐爛指數(shù)最大為(4.98±1.35)%(體積分?jǐn)?shù)5%),最小為(2.05±0.68)%(體積分?jǐn)?shù)20%),差異顯著。隨著時(shí)間延長(zhǎng),到12 d、16 d和20 d,也表現(xiàn)出發(fā)酵液處理比對(duì)照腐爛指數(shù)低,差異顯著,且處理的腐敗速度明顯慢于對(duì)照,16-20 d,腐爛指數(shù)稍有增加,差異不顯著。同時(shí),由表3可知,菌株X13不同體積分?jǐn)?shù)無(wú)菌發(fā)酵液處理番茄,果實(shí)腐爛指數(shù)均明顯低于對(duì)照,且體積分?jǐn)?shù)越高,抑制效果越好。其中20%體積分?jǐn)?shù)的無(wú)菌發(fā)酵液處理番茄在儲(chǔ)存20 d腐爛指數(shù)(25.02±0.65%),對(duì)照是其約3倍,為(68.32±1.20)%。
表3 X13無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄腐爛指數(shù)的影響Table 3 Effects of cell-free fermentation filtrate of X13 on the decay index of tomato%
2.3.2 X13處理對(duì)對(duì)番茄誘導(dǎo)抗性的影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13處理后,儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)的誘導(dǎo)抗性變化情況結(jié)果見(jiàn)表4。
由表4可知,3項(xiàng)抗性酶活性PPO、POD和PAL皆出現(xiàn)從4-12 d上升,到12 d達(dá)到峰值,16 d后下降的趨勢(shì),但16 d后雖有下降,但3項(xiàng)酶活亦皆大于對(duì)照,下降速度明顯變緩。對(duì)于PPO活性,與對(duì)照相比,12 d、16 d和20 d的PPO活性分別比對(duì)照增加109.0%、109.4%和98.0%,約為對(duì)照的2倍,差異顯著。對(duì)于POD,與對(duì)照相比,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),增加量也逐漸上升,12 d活性增加了127.6%,雖16 d后POD開(kāi)始下降,但處理后POD活性下降速度較慢。PAL增加量從93.3%(4 d)到216.7%(20 d),從8-20 d,PAL活性皆高于對(duì)照,差異顯著。
表4 X13無(wú)菌發(fā)酵濾液對(duì)番茄抗性酶活性影響Table 4 Effects of cell-free fermentation filtrate of X13 on the defense enzyme activity of tomato
2.3.3 X13處理對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)的影響 番茄經(jīng)不同體積分?jǐn)?shù)的拮抗菌X13處理后,儲(chǔ)藏不同時(shí)間番茄果實(shí)品質(zhì)變化情況,結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,對(duì)照和處理番茄硬度、可溶性固形物、可滴定算含量和VC含量皆出現(xiàn)下降趨勢(shì)。隨儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),番茄果實(shí)硬度逐漸下降。但與對(duì)照相比,X13無(wú)菌發(fā)酵液處理硬度下降減慢,至儲(chǔ)藏20 d,果實(shí)硬度為15.08 kg/cm2,較對(duì)照減少15.0%。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng),可溶性固形物含量呈下降趨勢(shì),對(duì)照下降速度較快,至16 d和20 d,經(jīng)處理的番茄可溶性固形物含量比對(duì)照減少4.0%和3.2%??傻味ㄋ岷口厔?shì)同可溶性固形物,對(duì)照從8 d開(kāi)始,可滴定酸迅速下降,至16 d和20 d,處理比對(duì)照高25.0%和20.0%。果實(shí)Vc含量為16 d到20 d,比對(duì)照少損失19.3%和20.1%。
0.00.46.1 Δ/%.51119.3 20.1 3.14a a mg·100 g-1)4.01a 3.02a 3.25a 3.01 3.41a X137±45.27±42.5 40.2 47.22±8±.21±38.45±Vc/(36 3.54a 2.36a 2.14a 2.65b 3.01b b 3.20 ato 6±47.22±45.11±40.12±36.12±2±of tom Ck 32.0 30.3 uality Δ/%0.07.4 Titration acid content /%17.1 18.9 25.0 20.0 3 1a±0.1 0.58±0影.12a.12a響X10.62 0.48±0 0.44±0.11a 0.35±0.12a 0.30±0.09a質(zhì)e p的reservation q量含品th 酸8a 5a 9a實(shí)on 定.0.05a.06a trol(P<0±0.11a±0.0±0.0 0.37±0 0.28±0 0.25±0.05)果13滴可茄Ck 0.62 0.54 0.41番對(duì)液the con濾content/%Δ/%0.00.60.81.64.03.2發(fā)酵n filtrate of X 5a菌.5.01a.20a 13無(wú)3 5 X Soluble solid X1 f cell-free fermentatio 7.30±0 7.25±1 7.22±1 7.11±0.55a 7.07±0.68a 6.52±0.51a物形表固2a 0a 4a性.3.85a.97a (P<0.05)溶 ±1.0±1.2平水ifferences between the treatment and ffects o 可Ck 7.30 7.21 7.16±1 7.00±0 6.80±0 6.32±0.59a著顯到達(dá)ble 5 E .4 Δ/%異0.0差105.6 2)12.4 12.8 15.0比相n indicate significant d Ta kg·cm-1.35a 2.04a 1.65a 1.56a 1.33a a 0.58照對(duì)與ness/(8±標(biāo)e colum X13 22.10±20.45±18.32±18.24±17.33±15.0指項(xiàng)Firm 該示度表硬2.31a 3.02b 4.02a 2.01a 1.02a 1.21b 母字寫(xiě)Ck .10±2218.52±17.35±16.23±15.36±13.11±小ercase letters in the sam同不列儲(chǔ)Storage tim e/d同間中ifferent low時(shí)表:D藏:048121620注Note
本研究對(duì)來(lái)源于番茄果腐病病原菌進(jìn)行組織分離純化,經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證獲得的病原菌菌株Qyg16-2。觀察病原菌形態(tài)特征并進(jìn)行rDNA-ITS序列分析,確定引起采后番茄果腐病病原菌為葡萄座腔菌B. dothidea。本研究采用來(lái)自采后儲(chǔ)藏期間發(fā)病番茄樣品獲得病原菌,其致病菌與其他研究不同[3-6]。
葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)真菌在世界范圍內(nèi)分布廣泛,由其引起得葉斑,枝梢枯敗,果實(shí)腐爛等果樹(shù)病害癥狀,導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)量以及品質(zhì)下降,帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。葡萄座腔菌屬對(duì)水果的危害在獼猴桃櫻桃[19]、藍(lán)莓[20]、蘋(píng)果[21]、葡萄[22]、柑橘[23]等都有研究報(bào)導(dǎo),但針對(duì)其對(duì)番茄的侵染研究較少。葡萄座腔菌B. dothidea生長(zhǎng)速度快,寄生性強(qiáng),以菌絲體、分生孢子及子囊殼在殘留的植物病殘?bào)w上越冬,菌絲體、分生孢子器在第二年春天恢復(fù)活動(dòng),越冬后的4-6月間生成孢子,成為初侵染源[24]。
生防菌株的研究與應(yīng)用對(duì)防止果蔬的微生物病害具有重要意義。目前針對(duì)桑氏鏈霉菌的研究較多,已經(jīng)從土壤[25-26]、樹(shù)木[27-28]和海洋沉積物[29]中分離到桑氏鏈霉菌(S. sampsonii),該菌能夠抑制多種真菌生長(zhǎng),有明顯的抗真菌活性,可抗阿切爾擬莖點(diǎn)霉(Phomopsis archeri)[25]及毛癬菌屬(Trichophyton sp.)[26]等。李姝江等[28]發(fā)現(xiàn)桑氏鏈霉菌KJ40對(duì)楊樹(shù)紫紋羽病原菌Rhizoctonia violacea除了具有較強(qiáng)拮抗作用外,還有促生抗病多種功能。
在外界因子作用下,植物能產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性,如抗性酶的產(chǎn)生,來(lái)抵抗病原菌入侵,使植物免遭病害或減輕病害。郭虹娜等[29]發(fā)現(xiàn)杰克遜酵母揮發(fā)物明顯提高草莓中過(guò)氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)等酶活。孫平平等[30]發(fā)現(xiàn)梨灰霉病菌拮抗放線菌處理梨后果實(shí)的過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性。本研究表明拮抗菌X13無(wú)菌發(fā)酵液處理能顯著提高番茄抗性酶活性,可以提高番茄抗病能力。
番茄由于皮薄多汁,受傷或受到微生物侵染后,容易腐爛變質(zhì),腐敗指數(shù)是番茄新鮮程度的標(biāo)志。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),水果品質(zhì)逐步下降。水果儲(chǔ)藏過(guò)程中可采取措施緩解品質(zhì)下降速度。季小詩(shī)等[31]發(fā)現(xiàn)拮抗酵母GS-316發(fā)酵液處理冬棗能夠顯著延緩冬棗果實(shí)失重率和還原糖含量的上升,抑制可滴定酸含量和Vc含量的下降,降低果實(shí)軟化率,降低腐爛指數(shù)。施俊鳳等[32]發(fā)現(xiàn)草莓采前噴施洋蔥伯克霍爾德菌菌懸液可有效提升草莓品質(zhì),延緩果實(shí)硬度、可溶性固形物、可滴定酸,降低Vc含量。本研究中番茄通過(guò)拮抗菌X13處理后,腐爛指數(shù)下降較低,硬度、可溶性固形物、可滴定酸、Vc含量下降幅度減慢,說(shuō)明X13可以維持番茄果實(shí)在儲(chǔ)藏過(guò)程中的品質(zhì)時(shí)間有所延長(zhǎng),減輕果實(shí)的腐敗變質(zhì),表明該菌株在番茄采后保鮮方面有一定的實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值。但本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)X13菌株應(yīng)用于番茄采后果腐病控制及保鮮效果進(jìn)行了初步研究,仍需對(duì)其發(fā)酵液活性成分進(jìn)行分離鑒定,并對(duì)抑菌機(jī)理,病原菌、拮抗菌及番茄果實(shí)互作及菌株X13的生產(chǎn)應(yīng)用需進(jìn)一步研究探索。
從健康番茄根際土壤中分離得到了一株桑氏鏈霉菌 S. sampsonii X13,其對(duì)番茄果腐病病原菌葡萄座腔菌B. dothidea Qyg16-2有較強(qiáng)拮抗作用,X13可以抑制病原菌Qyg16-2孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng),其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)儲(chǔ)藏期間番茄腐爛的發(fā)生具有良好的抑制效果,且對(duì)番茄果實(shí)品質(zhì)具有較好的維持作用。